菜心（Brassica campestrisL.ssp.chinensisMakino）又稱為菜薹，是一種葉、花、莖同食的蔬菜[1-2]，富含維生素C、人體所需氨基酸和一些黃酮類化合物。葉類蔬菜的食用部分大多為鮮嫩的綠葉以及莖稈，但葉是植株新陳代謝速度最高的營養(yǎng)部分，因其表面積大、水分揮發(fā)速度快，且表層的保護(hù)組織很脆弱或在采摘過程中還沒充分發(fā)育，所以在采摘后易脫水而枯萎。而且，幼葉蔬菜呼吸功能很強(qiáng)，在貯運(yùn)過程中會(huì)急劇損耗大量營養(yǎng)物質(zhì)，從而形成大量呼吸熱，從而導(dǎo)致蔬菜老化、黃化和腐爛等現(xiàn)象，進(jìn)而造成蔬菜的新鮮品質(zhì)急劇下降，因此菜心等葉菜類蔬菜貯藏保鮮難度大[3-4]。因此，通過深入研究探討造成菜心品質(zhì)降低的各種因素，對于解決菜心保鮮問題有著重大意義。

氣體調(diào)節(jié)保鮮是利用水果和蔬菜的呼吸作用、環(huán)境中的氣體成分以及包裝膜滲透的動(dòng)態(tài)平衡而建立的儲(chǔ)存方法。它是保持水果和蔬菜質(zhì)量、減少收獲和運(yùn)輸過程中損失的有效手段之一[5-6]。薄膜包裝能夠有效減少青菜的新陳代謝速率，從而降低營養(yǎng)物質(zhì)的丟失，10 ℃條件下，聚丙烯薄膜包裝材料最能夠延長青菜的貯藏有效期[7]；聚乙烯薄膜保濕性好、透氣性好，可有效控制蔬菜失水和無氧呼吸，延緩采后老化進(jìn)程[8]。本實(shí)驗(yàn)通過自發(fā)氣調(diào)包裝研究其對采后菜心的保鮮效果影響，包含聚乙烯袋（Polyethylene，PE）、聚丙烯袋（Polypropylene，PP）和雙向拉伸聚丙烯袋（Biaxially Oriented Polypropylene，BOPP）等包裝，并進(jìn)一步研究自發(fā)氣調(diào)包裝延緩菜心老化的作用機(jī)制，從維生素C代謝相關(guān)基因表達(dá)等方面進(jìn)行探討，這對于解決菜心保鮮、增長其貨架期及提高其商品附加值具有理論和現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材

本實(shí)驗(yàn)所采用的主要品種是“四九”型菜心，是在中國廣州從化市郊街光聯(lián)村農(nóng)場采購，大棚栽培，選用了莖薹豐滿，均勻，無病、蟲、黃葉、斷葉，花蕾未開放的植株為實(shí)驗(yàn)試材，按14 cm高度要求用刀整齊采摘，經(jīng)真空預(yù)冷到1 ℃后，租用廣州拜爾冷鏈物流公司的冷藏車運(yùn)存于4 ℃冷庫備用。

自發(fā)氣調(diào)包裝袋為低密度聚乙烯薄膜袋（PE）、雙向拉伸聚丙烯薄膜袋（BOPP）、聚丙烯薄膜袋（PP），其厚度為0.04 mm，購于廣州市海珠廣場。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

DDS-307電導(dǎo)率儀（上海雷磁）、果皮打孔器、VBR20糖度計(jì)（杭州匯爾儀器）、RS232C紫外分光光度計(jì)（德國Eppendorf公司）、GC-17A氣象色譜儀（日本島津有限公司）、T100 PCR儀（美國BIO-RAD公司）、CFX9600熒光定量PCR儀（美國BIO-RAD公司）和SonyA580相機(jī)（日本Sony）等。

1.1.3 主要試劑

熒光引物，由上海生物工程有限公司合成；RNA提取試劑盒，購于天澤生物技術(shù)有限公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購于TAKARA公司；乙醇、丙酮、二甲苯、濃硫酸等試劑購于SIGMA Life Science有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)處理

選好的菜心隨機(jī)分成4組，放入塑料框架（36 cm×21 cm×13 cm），每框內(nèi)放置20個(gè)菜心，分別用PE、PP和BOPP薄膜包裝并密封，以不包裝樣品作為對照組。每個(gè)處理都放在25 ℃條件下貯藏5 d，每個(gè)處理重復(fù)3次，對貯藏0 d、1 d、2 d、3 d和5 d的菜心的衰老情況進(jìn)行觀測，并采樣分析相關(guān)生理指標(biāo)，同時(shí)取菜心葉片用液氮迅速冷凍，置于-80 ℃冰箱中待用。

1.3 菜心生理指標(biāo)的測定方法

1.3.1 葉片黃化指數(shù)的測定

菜心葉片的黃化程度分為5個(gè)等級：0級，無黃化葉片；1級，葉片黃化面積＜25%；2級，葉片黃化面積為25%～50%；3級，葉片黃化面積為50%～75%；4級，葉片黃化面積＞75%。取菜心葉片測定黃化指數(shù)，重復(fù)3次。葉片黃化指數(shù)的計(jì)算公式為

1.3.2 失重率的測定

使用稱重法，每個(gè)處理固定顆數(shù)，分3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20根菜心。失重率的計(jì)算公式為

1.3.3 葉片相對電導(dǎo)率的測定

參照李秋月等[9]的方法，使用ODDS-11c測量型電導(dǎo)率儀時(shí)，用打孔器將菜心葉片打成厚薄均勻、尺寸相同的組織圓片（直徑0.5 cm）放入三角錐瓶中，雙蒸水洗3次，用濾紙吸干，準(zhǔn)確稱0.1 g圓片，放進(jìn)25 mL雙蒸水中，在25 ℃下保溫2 h，用ODDS-11c型的電導(dǎo)率儀測出R1，加熱煮沸5 min后迅速冷卻，再測R2。相對電導(dǎo)率的計(jì)算公式為

1.3.4 葉綠素?zé)晒釬v/Fm值的測定

把葉片在暗處中放置10 min，通過OS-30P調(diào)制式葉綠素?zé)晒鈨x（Opti-Sciences，USA）來測定葉片的Fv/Fm值。

1.3.5 總?cè)~綠素含量的測定

參照張憲政[10]的方法，準(zhǔn)備好丙酮∶乙醇=2∶1的混合液，稱取0.1 g葉片切碎，放進(jìn)50 mL塑料管中加20 mL上述混合液，蓋上蓋子，在室溫暗室下浸泡約24 h，在此期間振搖2～3次，提取其葉綠素。以提取液做對照，在645 nm和663 nm波長測定上清液吸光度，每個(gè)處理均重復(fù)3次?？?cè)~綠素含量計(jì)算公式為

式中：V為提取液體積，mL；W為葉片重量，g。

1.3.6 維生素C含量的測定

采用比色法[11]，稱取2.0 g鮮樣，加2%草酸3 mL磨成勻漿，轉(zhuǎn)到100 mL容量瓶，并用1%草酸沖洗其殘?jiān)?。? mL 30%硫酸鋅溶液，搖勻，添加15%亞鐵氰化鉀溶液1 mL，最后用1%草酸定容至刻度，過濾到一個(gè)燒杯中。取提取液4 mL放入具塞大試管中，依次加入2 mL染料，5 mL二甲苯，以二甲苯為空白調(diào)零，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測量其吸光度，通過回歸方程算出所測樣品中維生素C含量。

1.4 菜心相關(guān)基因表達(dá)的方法

1.4.1 樣品總RNA提取

參照吳亞[12]的方法，用天澤生物技術(shù)有限公司的植物RNA提取試劑盒提取菜心RNA，具體步驟如下。

（1）稱取50～100 mg樣品，用液氮進(jìn)行速凍后，將其研磨成粉狀，趁液氮還沒完全揮發(fā)時(shí)，將其轉(zhuǎn)移至2.0 mL的離心管中，再迅速加入1 mL細(xì)胞裂解液。

（2）把300 μL的去蛋白液和200 μL氯仿一并加入離心管，振蕩器振蕩30 s，此時(shí)溶液呈均勻乳濁液狀。

（3）將離心管在室溫下12 000 r·min-1離心8 min，兩相間就會(huì)有5～10 mm厚的細(xì)胞破碎物，將上清液轉(zhuǎn)移至另一個(gè)干凈的2.0 mL離心管中，下層有機(jī)相和中間層因?yàn)榇嬖诘鞍踪|(zhì)、DNA和其他雜質(zhì)，避免觸及或吸取雜質(zhì)對實(shí)驗(yàn)造成影響，所以留下100 μL上清液不取。

（4）加相同體積的漂洗液，充分混勻，將其加入一個(gè)離心吸附柱中，12 000 r·min-1室溫下離心1 min，棄穿透液。

（5）加入 500 μL 洗柱液，12 000 r·min-1室溫離心1 min，棄穿透液。加500 μL洗柱液，重復(fù)一遍。然后室溫12 000 r·min-1離心1 min以便去除殘留的液體。

（6）膜上消化DNA。①將6 μL的RNase-free DNase I加入44 μL DNase buffer中混勻均勻，加到離心吸附柱中并于室溫放置15～20 min。②直接在離心吸附柱中添加0.5 mL去酶液，蓋好，顛倒混勻數(shù)次。③室溫12 000 r·min-1離心1 min，棄穿透液。④加0.5 mL去酶液，12 000 r·min-1室溫離心1 min，棄穿透液。⑤室溫 12 000 r·min-1離心 2 min。

（7）轉(zhuǎn)移離心吸附柱至RNase-free收集管中，向里面加入50～100 μL RNA洗脫液，室溫放置3～5 min。

（8）12 000 r·min-1室溫離心1 min，離心管中溶液為RNA樣品，檢測后可立即使用或存放在-80 ℃待用。

1.4.2 樣品總RNA濃度的測定及完整性檢測

用分光光度計(jì)測總RNA含量及質(zhì)量評價(jià)。取1 μL總RNA，稀釋100倍后測定230 nm、260 nm和280 nm處的光吸收值和OD260/OD280的比值?？俁NA樣品濃度計(jì)算公式為

1.4.3 cDNA第一鏈的合成

以菜心葉片總RNA為模板，采用TaKaRa cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，反轉(zhuǎn)錄酶為Reverse Transcription M-mLV（RNase H-）（TaKaRa），引物為Oligod（T）18和Random 9 mers（TaKaRa）。CDNA合成方法如下：菜心RNA 1 μL、Oligod（T）18 0.5 μL和Random 9 mers 0.5 μL混合于0.5 mL離心管中，70 ℃變性10 min，冰浴2 min，依次加入5×M-mLV（200 U·μL-1）0.3 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)到 10 μL，輕柔混勻振蕩到管底后，30 ℃反應(yīng)10 min后，轉(zhuǎn)入42 ℃反應(yīng)1～2 h，反應(yīng)結(jié)束后重復(fù)變性和水浴操作。此時(shí)的cDNA可做PCR，或-20 ℃存放備用。

1.5 葉片葉綠素降解和中維生素C代謝相關(guān)酶基因的表達(dá)分析

參考WAN等[13]研究報(bào)道，選取BrAct1（ABS70449.1）作為熒光定量的內(nèi)參基因。選擇葉綠素降解關(guān)鍵酶基因BrPAO以及中維生素C合成關(guān)鍵酶基因BrAPX進(jìn)行表達(dá)分析。根據(jù)NCBI上登錄的序列，設(shè)計(jì)熒光定量引物。這些引物都是在3'非翻譯區(qū)設(shè)計(jì)的，用來確保擴(kuò)增片段的特異性。引物的長度為18～24 bp，退火溫度為55 ℃以上，引物擴(kuò)增目的片段的長度一般為80～250 bp，為確保更高擴(kuò)增效率，qRT-PCR引物序列都是由上海生工生物公司合成（引物見表1）。配制qRT-PCR溶液的操作流程見TAKARA SYBR Green I試劑盒說明書。

熒光定量反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃，3 min→（95 ℃，5 s→55 ℃，10 s→72 ℃，30 s）×40。在PCR擴(kuò)增程序添加溶解程序后形成溶解曲線，程序?yàn)椋?0～95 ℃，以0.5 ℃遞增讀板，每次讀板5 s。

表1 qRT-PCR引物序列表

通過相對定量軟件，對qRT-PCR結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線進(jìn)分析、定量。每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析作圖

通過Microsoft公司的Excel 2003和SPSS Inc公司的SPSS Statistics 21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析，通過Systat Software Inc公司的Sigmaplot 12.0軟件進(jìn)行作圖。各項(xiàng)生理生化指標(biāo)的測得值以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，方差分析運(yùn)用鄧肯氏新復(fù)級差檢驗(yàn)法（Duncan’s Multiple Ranger Test，DMRT）。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣調(diào)包裝對菜心貨架期衰老和品質(zhì)的影響

2.1.1 貨架期間不同氣調(diào)包裝處理菜心葉片相對電導(dǎo)率的變化

菜心采后還要進(jìn)行生理代謝，隨時(shí)間推移會(huì)逐漸衰老。研究說明，在逆境脅迫或衰老過程中，植物細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與清除平衡會(huì)被破壞，引起膜脂過氧化，進(jìn)而破壞膜系統(tǒng)[14]。由圖1可以發(fā)現(xiàn)，因貨架時(shí)間延長，不同包裝處理的菜心葉片相對電導(dǎo)率都呈上升趨勢，說明菜心葉片因貨架時(shí)間的延長而不斷衰老、變質(zhì)。而經(jīng)過PE、PP和BOPP等自發(fā)氣調(diào)包裝處理的菜心葉片相對電導(dǎo)率始終低于沒有包裝的菜心，說明自發(fā)氣調(diào)包裝處理降低了菜心葉片細(xì)胞膜破壞程度，有效延緩了衰老速度。此外，以PP包裝的菜心的葉片相對電導(dǎo)率較低。

2.1.2 貨架期間不同氣調(diào)包裝處理菜心葉片黃化指數(shù)的變化

由圖2可看出，菜心在貨架期間，黃化指數(shù)逐漸上升。跟未經(jīng)包裝的對照組相比，經(jīng)過PE、PP和BOPP自發(fā)氣調(diào)包裝處理的菜心葉片黃化指數(shù)較低，表明氣調(diào)包裝能有效使菜心葉片黃化程度降低，從而保持良好的外觀品質(zhì)。在3種不同氣調(diào)包裝處理中，PP薄膜包裝處理的菜心黃化指數(shù)低于PE包裝和BOPP包裝處理，但PP和BOPP之間差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 不同自發(fā)氣調(diào)包裝的菜心貨架期葉片相對電導(dǎo)率的變化圖

圖2 不同自發(fā)氣調(diào)包裝的菜心貨架期葉片黃化指數(shù)的變化圖

2.1.3 貨架期間不同氣調(diào)包裝處理菜心葉片葉綠素?zé)晒庵担‵v/Fm）的變化

在貨架期間，對比自發(fā)氣調(diào)包裝與不包裝菜心葉片的葉綠素?zé)晒庵担▓D3），可以看出PE、PP和BOPP 3種氣調(diào)包裝處理明顯延緩了菜心葉片的葉綠素?zé)晒庵到档?，并且PP包裝處理的菜心葉綠素?zé)晒庵底罡撸砻鳉庹{(diào)包裝處理能夠延緩菜心葉片葉綠素的降解，尤其以PP包裝效果最好。

圖3 不同自發(fā)氣調(diào)包裝的菜心貨架期葉片葉綠素?zé)晒庵礔v/Fm的變化圖

2.1.4 貨架期間不同氣調(diào)包裝處理菜心葉片總?cè)~綠素含量的變化

新鮮菜心葉片葉綠素含量為2.29 mg.g-1（圖4），未經(jīng)包裝處理的菜心貨架期第1 d后，葉綠素含量顯著下降，為新鮮菜心葉片的70%。3種自發(fā)氣調(diào)包裝可有效延緩葉片葉綠素降解，在前2 d貨架期內(nèi)，以PP包裝處理對菜心葉片的護(hù)綠效果最好，貯藏2 d后葉綠素含量維持為新鮮菜心葉片的65%；但在第3 d和第5 d，3種自發(fā)包裝處理之間的菜心葉片葉綠素含量沒有明顯差異，但仍比未經(jīng)包裝的菜心高。

圖4 不同自發(fā)氣調(diào)包裝的菜心貨架期葉片總?cè)~綠素含量的變化圖

2.1.5 貨架期間不同氣調(diào)包裝處理菜心失重率的變化

由于蒸騰作用及呼吸消耗，菜心產(chǎn)品質(zhì)量在貯藏過程中逐漸下降，影響其商品性能。由圖5可看出，未經(jīng)包裝處理的菜心在貨架期間失重率高達(dá)56.91%，而氣調(diào)包裝有效緩解菜心質(zhì)量的損失，保持了水分含量。貨架第5 d時(shí)，經(jīng)PE、PP和BOPP氣調(diào)包裝的菜心的失重率分別為0.92%、0.59%和0.71%，并且3種氣調(diào)包裝處理對菜心失重率的影響沒有顯著性差異（P＞0.05）。

圖5 不同自發(fā)氣調(diào)包裝的菜心貨架期失重率的變化圖

2.1.6 貨架期間不同自發(fā)包裝的菜心葉片維生素C含量的變化

維生素C是一種營養(yǎng)物質(zhì)，極容易分解。果蔬在貨架期間維生素C含量迅速下降。如圖6所示，菜心新鮮葉片維生素C含量為83.87 mg/100 g，未經(jīng)包裝處理的菜心貨架期間維生素C含量下降很快，至第5 d，維生素C含量僅為初期新鮮葉片的22.3%。自發(fā)氣調(diào)包裝處理能夠顯著（P＜0.05）延緩菜心葉片維生素C含量的下降，以PP包裝延緩效果最好。貨架期第5 d，PE、PP和BOPP包裝處理的菜心葉片中維生素C含量分別為初期新鮮葉片的35%、48%和42%。

圖6 不同自發(fā)氣調(diào)包裝的菜心貨架期維生素C含量的變化圖

2.2 自發(fā)氣調(diào)包裝對菜心葉片相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.2.1 菜心葉片總RNA的提取

本實(shí)驗(yàn)使用植物RNA提取試劑盒提取菜心葉片總RNA，1.2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖7所示。

隨著時(shí)間的延長，沒有經(jīng)過任何包裝處理的菜心發(fā)生嚴(yán)重的失水、黃化和衰老現(xiàn)象，導(dǎo)致其RNA降解嚴(yán)重，所以本實(shí)驗(yàn)只提取了第0 d、1 d、2 d和3 d的RNA。

圖7 菜心葉片總RNA電泳圖

2.2.2 貨架期不同自發(fā)氣調(diào)包裝菜心葉片BrPAO和BrAPX基因表達(dá)特性

（1）BrPAO和BrAPX基因qRT-PCR引物的篩選。qRT-PCR技術(shù)對引物的要求很高，根據(jù)NCBI上登錄的菜心PAO和APX等2個(gè)基因的序列，按熒光定量引物要求，設(shè)計(jì)了它們的熒光引物。溶解曲線分析顯示，引物的溶解曲線峰值單一、峰形聚攏，如圖8所示。說明此次所設(shè)引物滿足熒光定量的實(shí)驗(yàn)要求，可用于接下來的表達(dá)分析。

圖8 BrAct1、BrPAO和BrAPX基因qRT-PCR引物的溶解曲線分析圖

（2）貨架期不同自發(fā)氣調(diào)包裝的菜心葉片BrPAO和BrAPX基因的表達(dá)特性。qRT-PCR結(jié)果顯示，伴隨著貨架期菜心葉片衰老的發(fā)生，葉片BrPAO和BrAPX的表達(dá)總體呈上調(diào)的趨勢（圖9）。

未經(jīng)包裝的菜心葉片BrPAO和BrAPX基因表達(dá)水平上升最明顯，至貨架第3 d，BrPAO和BrAPX基因表達(dá)水平分別為0 d時(shí)的4.18和17.69倍。經(jīng)過PE、PP和BOPP自發(fā)氣調(diào)包裝后，延緩了BrPAO和BrAPX基因表達(dá)的增強(qiáng)，至貨架第3 d，PE、PP和BOPP自發(fā)氣調(diào)包裝的菜心葉片BrPAO分別為對照的45.31%、36.05%和42.35%，BrAPX分別為對照的26.96%、18.89%和17.80%。這些結(jié)果說明自發(fā)氣調(diào)包裝處理延緩菜心衰老進(jìn)程，維持菜心品質(zhì)，可能與其延緩了菜心葉片葉綠素降解基因BrPAO和維生素C代謝基因BrAPX的表達(dá)有關(guān)。

3 結(jié)論與討論

脫鎂葉酸加氧酶（Pheophorbide A Oxygenase，PAO）是葉綠素降解途徑之一的關(guān)鍵酶。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析顯示，貨架期間菜心葉片BrPAO基因表達(dá)因衰老加劇而增強(qiáng)，PE、PP和BOPP等3種自發(fā)氣調(diào)包裝均可顯著（P＜0.05）抑制BrPAO基因表達(dá)的增強(qiáng)，說明自發(fā)氣調(diào)包裝能夠延緩菜心葉片葉綠素的降解。抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate Peroxidase，APX）是維生素C代謝途徑的關(guān)鍵酶。貨架期間，隨葉片衰老的進(jìn)程，菜心BrAPX的基因表達(dá)增強(qiáng)，與不包裝相比，PE、PP和BOPP等3種自發(fā)氣調(diào)包裝均降低了BrAPX基因表達(dá)水平，表明自發(fā)氣調(diào)包裝能夠抑制菜心葉片維生素C的降解。

在本試驗(yàn)中，PE、PP以及BOPP等自發(fā)氣調(diào)包裝處理均能有效地延緩貨架期菜心相對電導(dǎo)率、失重率、黃化指數(shù)的降低，延緩貨架期菜心葉片總?cè)~綠素濃度、葉綠素?zé)晒庵?、維生素C含量的升高，表明自發(fā)氣調(diào)包裝能夠有效延緩菜心衰老和品質(zhì)的劣變。