鄭會珍，普 浩，繆榮浩，甘 露，葛曉敏，巴音查汗，李永暢，郭慶勇

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

牛環(huán)形泰勒蟲病是一種蜱傳性血液原蟲病，由寄生于牛的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞內(nèi)環(huán)形泰勒蟲(T.annulata)引起，急性感染時可致宿主高熱、貧血、黃疸及體表淋巴結(jié)腫大等癥狀[1-2]。小亞璃眼蜱與亞洲璃眼蜱作為媒介蜱導(dǎo)致其發(fā)病具有明顯的季節(jié)性和地域性[3]。牛環(huán)形泰勒蟲病高發(fā)病率和高死亡率導(dǎo)致牛產(chǎn)奶量及產(chǎn)肉量降低，給養(yǎng)牛業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了畜牧業(yè)的健康發(fā)展[4]。近年來，由于耐藥性寄生蟲的進(jìn)化和傳播及疫苗的缺乏為寄生蟲病的控制和消除帶來極大挑戰(zhàn)，早發(fā)現(xiàn)、早治療是目前解決該病的方法。

烯醇化酶(2-phospho-D-glyceratehydrolyase,enolase)在糖酵解中通過催化2-磷酸甘油酸形成磷酸烯醇式丙酮酸為宿主提供能量。enolase在多種生物體內(nèi)高度保守[5]，有多種生物學(xué)功能，enolase可與纖溶酶原(plasminogen，Plg)、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)n)結(jié)合，從而對宿主產(chǎn)生影響[6]。研究發(fā)現(xiàn)，不同位置的enolase可對瘧原蟲產(chǎn)生不同影響，在表面可能參與紅細(xì)胞入侵；囊泡內(nèi)可能參與食物泡形成，而細(xì)胞核內(nèi)的enolase可能在轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮作用[7]。enolase可位于卵細(xì)胞表面，但配子細(xì)胞、配子和受精卵表面不存在。瘧原蟲入侵時，動合子表面的enolase不僅結(jié)合蚊子中腸上皮受體來入侵其中腸，且賴氨酸肽段(DKSLVK)可結(jié)合動合子表面的纖溶酶原激活寄主纖溶系統(tǒng)來侵染宿主[8]。Sato等[9]發(fā)現(xiàn)，enolase也可用于瘧疾免疫診斷。由于enolase的保護(hù)性抗原特性[10-12]，對其深入研究可使人們更清楚其在寄生蟲入侵宿主、供能中的相關(guān)作用，也為潛在的疫苗候選抗原、診斷治療方法和藥物篩選研究奠定基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)克隆了牛環(huán)形泰勒蟲新疆株enolase基因并分析其編碼蛋白質(zhì)的遺傳進(jìn)化關(guān)系，預(yù)測enolase的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、三級結(jié)構(gòu)模型、亞細(xì)胞定位、構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)并通過抗原性分析對其理論抗原位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記，以期為后續(xù)為牛環(huán)形泰勒蟲enolase基因特性、候選疫苗、藥物靶點(diǎn)的相關(guān)研究提供思路和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

pGEX-4T-1(+)表達(dá)載體及牛環(huán)形泰勒蟲標(biāo)準(zhǔn)陽性、陰性血清均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動醫(yī)學(xué)學(xué)院寄生蟲實(shí)驗(yàn)室保存；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ、T4 DNA連接酶均購自TaKaRa公司；2×TaqMasterMix、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pMD19-T載體、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自TIGEN公司；質(zhì)粒小劑量提取試劑盒購自O(shè)mega公司；大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞和蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均購自寶信生物科技有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗牛IgG抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 目的基因克隆及測序

參考GenBank中登錄的牛環(huán)形泰勒蟲enolase基因序列(登錄號：HQ_646253)和原核表達(dá)載體pGEX-4T-1(+)圖譜酶切位點(diǎn)，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物。引物序列為：pGEX4T-1-enolase-F：5′-CGCGGATCCATGCAA-TTTTTAGATTCCAGAGG-3′(下劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn))；pGEX4T-1-enolase-R：5′-CCGCTCGAGCAGCTCTTCTTCGATGC-3′(下劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn))。使用DNA提取試劑盒提取牛環(huán)形泰勒蟲DNA并以其為模板，PCR擴(kuò)增牛環(huán)形泰勒蟲新疆株enolase基因。PCR反應(yīng)體系13 μL：2×TaqMasterMix 6.5 μL,上、下游引物各0.5 μL，DNA模板 1 μL，ddH2O 4.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，50.75 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行切膠回收，目的片段連接至pMD19-T載體(pMD19-T-enolase)后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，于37 ℃、180 r/min搖菌1 h后涂布于Amp+的培養(yǎng)板，于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定后送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI-BLAST上比對。

1.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

在NCBI中通過BLAST獲得不同物種的enolase蛋白氨基酸序列，如小泰勒蟲(XP_764336)、東方泰勒蟲(XP_009692141)、馬泰勒蟲(XP_004831211)、牛巴貝斯蟲(XP_001611923)、卵形巴貝斯蟲(XP_028865010)、雙芽巴貝斯蟲(XP_012768952)、殘留瘧原蟲(XP_028532717)、岡地弓形蟲(AAG60329)。使用Mega 7.0軟件的最大似然法，將分析重復(fù)數(shù)設(shè)置為1 000，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 enolase重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定

提取pMD19-T-enolase、pGEX-4T-1(+)質(zhì)粒，用BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后用T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，于37 ℃、180 r/min搖菌1 h后涂布于Amp+的培養(yǎng)板，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落培養(yǎng)后進(jìn)行PCR、雙酶切鑒定，將陽性菌株(pGEX-4T-1-enolase)送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.5 enolase重組蛋白誘導(dǎo)條件的篩選

將pGEX-4T-1-enolase菌液于37 ℃、180 r/min在10 mL LB液內(nèi)擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)菌液D650 nm值達(dá)到0.4～0.6時取1 mL菌液作為誘導(dǎo)前對照樣品，加入1.0 mmol/L IPTG在0～6 h每小時取樣進(jìn)行誘導(dǎo)時間篩選；加入不同濃度IPTG(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mmol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)濃度篩選；確定最佳誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)濃度后在16、25和37 ℃進(jìn)行誘導(dǎo)溫度篩選。使用SDS-PAGE對篩選的條件進(jìn)行分析和驗(yàn)證。

1.6 enolase重組蛋白純化及Western blotting分析

將陽性菌液復(fù)蘇后在200 mL LB培養(yǎng)基(Amp+)擴(kuò)大培養(yǎng)，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)2.5 h，待菌液D650 nm值達(dá)到0.4～0.6時，取1 mL菌液作為誘導(dǎo)前(0 h)對照，加入0.6 mmol/L IPTG在25 ℃誘導(dǎo)5 h，收集菌液沉淀，超聲破碎，分別收集上清和沉淀進(jìn)行蛋白可溶性分析，并進(jìn)行蛋白純化。通過SDS-PAGE鑒定后以牛環(huán)形泰勒蟲陽性血清(1∶100)和兔抗GST標(biāo)簽抗體(1∶2 500)作為一抗、兔抗牛 IgG-HRP(1∶10 000)和羊抗兔IgG-HRP(1∶10 000)作為二抗，經(jīng)Western blotting鑒定重組蛋白的表達(dá)。

1.7 enolase蛋白生物信息學(xué)分析

將測序正確的核苷酸序列通過軟件翻譯為氨基酸序列進(jìn)行生物學(xué)信息分析，軟件網(wǎng)站及功能見表1。

表1 生物信息學(xué)分析軟件網(wǎng)址及其功能Table 1 Website and function of bioinformatics analysis softwares

2 結(jié) 果

2.1 牛環(huán)形泰勒蟲enolase基因擴(kuò)增

牛環(huán)形泰勒蟲enolase基因PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。由圖1可知，獲得大小約為1 248 bp的enolase基因擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測序后在NCBI-BLAST比對結(jié)果顯示，enolase基因與已發(fā)表環(huán)形泰勒蟲(GenBank登錄號：HQ_646253)相似性為97.35%。

M，DL2000 DNA Marker；1、2，牛環(huán)形泰勒蟲enolase基因；3，陰性對照 M，DL2000 DNA Marker;1 and 2，enolase gene of T.annulata;3，Negative control圖1 牛環(huán)形泰勒蟲enolase基因PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖Fig.1 Electropherogram of PCR amplification results of enolase gene of T.annulata

2.2 牛環(huán)形泰勒蟲enolase系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

將牛環(huán)形泰勒蟲enolase與其他物種的氨基酸序列進(jìn)行相似性比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖2。由圖2可知，牛環(huán)形泰勒蟲enolase與小泰勒蟲(XP_764336)親緣關(guān)系較近，與殘留瘧原蟲(XP_028532717)和剛地弓形蟲(AAG60329)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 牛環(huán)形泰勒蟲enolase基因表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證

使用BamHⅠ、XhoⅠ對pGEX4T-1-enolase重組質(zhì)粒雙酶切，通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得大小分別為4 969和1 248 bp的酶切片段(圖3)，表明原核表達(dá)載體pGEX4T-1-enolase構(gòu)建成功。

2.4 牛環(huán)形泰勒蟲enolase蛋白誘導(dǎo)條件篩選

使用IPTG誘導(dǎo)pGEX-4T-1-enolase重組質(zhì)粒，結(jié)果顯示，在25 ℃、IPTG終濃度為0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)3 h時可獲得大小約為70 ku的蛋白條帶(圖4)，與預(yù)期大小一致。

圖2 基于enolase氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on enolase amino acid sequences

M1，DL8000 DNA Marker；1，pGEX-4T-1-enolase重組質(zhì)粒；2，pGEX-4T-1-enolase重組質(zhì)粒雙酶切；M2，DL2000 DNA Marker M1，DL8000 DNA Marker;1，pGEX-4T-1-enolase recombinant plasmid;2，Double enzyme digestion of pGEX-4T-1-enolase recombinant plasmid;M2，DL2000 DNA Marker圖3 pEGX-4T-1-enolase重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證Fig.3 Double restrict digestion of pGEX-4T-1-enolase recombinant plasmid

①A，誘導(dǎo)時間優(yōu)化；B，IPTG誘導(dǎo)濃度優(yōu)化；C，誘導(dǎo)溫度優(yōu)化。②M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；A1～A7，誘導(dǎo)時間分別為0、1、2、3、4、5和6 h；B1～B7，IPTG誘導(dǎo)濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mmol/L；C1，誘導(dǎo)前；C2～C4，誘導(dǎo)溫度分別為16、25和37 ℃ ①A，Optimization of induction time;B,Optimization of induction concentrations of IPTG;C,Optimization of induction temperatures.② M,Protein Marker;A1-A7,The induction time was 0,1,2,3,4,5 and 6 h,respectively;B1-B7,The induced concentrations of IPTG were 0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 and 1.2 mmol/L,respectively;C1,Before induction;C2-C4,The induction temperatures were 16,25 and 37 ℃,respectively圖4 enolase蛋白誘導(dǎo)條件篩選Fig.4 Screening of induction conditions for enolase protein

2.5 牛環(huán)形泰勒蟲enolase重組蛋白純化及Western blotting分析

重組蛋白純化后經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證后獲得大小為70 ku的單一目的蛋白(圖5A)，使用超微量分光光度計測定蛋白濃度為0.3 mg/mL。Western blotting結(jié)果顯示,enolase可與牛環(huán)形泰勒蟲陽性血清、GST標(biāo)簽發(fā)生反應(yīng)，并在70 ku處出現(xiàn)特異性條帶，陰性血清不反應(yīng)(圖5B、5C)。

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，誘導(dǎo)前；2，誘導(dǎo)后，3，超聲后上清；4，超聲后沉淀；5，純化后蛋白；6，抗GST標(biāo)簽抗體7，陰性對照；8，牛環(huán)形泰勒蟲陽性血清；9，陰性對照 M，Protein Marker;1，Before induction;2，After induction;3，Supernatant after ultrasound;4，Precipitation after ultrasound；5，Purified protein;6，Anti-GST-labeled antibody;7，Negative control;8，Positive serum for Theileria annulata;9，Negative control圖5 enolase蛋白純化(A)及Western blotting(B、C)檢測Fig.5 enolase protein purification (A) and detection by Western blotting (B and C)

2.6 enolase蛋白生物信息學(xué)分析

2.6.1 理化性質(zhì)分析 利用ProtParam程序預(yù)測牛環(huán)形泰勒蟲enolase蛋白理化性質(zhì)，推測該蛋白的分子式為C2003H3212N542O615S17，分子質(zhì)量為45.27 ku,等電點(diǎn)(pI)為5.91；帶正電氨基酸殘基(Arg+Lys)48個，帶負(fù)電氨基酸殘基(Asp+Glu)52個，蛋白親水性平均系數(shù)(GRAVY)為-0.171，不穩(wěn)定系數(shù)為28.53(<40)，屬于穩(wěn)定性蛋白。

利用Net-Phos 3.1 Server軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，enolase有38個磷酸化位點(diǎn)，絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點(diǎn)分別為19、9和10個(圖6A)。TMHMM Server v.2.0、Signal 5.0、ProtScale軟件預(yù)測結(jié)果顯示，enolase無跨膜區(qū)(圖6B)、無信號肽(圖6C)、親水性較好(圖6D)。

A，磷酸化位點(diǎn)預(yù)測；B，跨膜區(qū)預(yù)測；C，信號肽預(yù)測；D，親疏水性預(yù)測 A，Prediction of phosphorylation site;B，Prediction of transmembrane region;C，Prediction of signal peptide;D，Prediction of hydrophilicity and hydrophobicity圖6 enolase蛋白生物信息學(xué)分析Fig.6 Bioinformatics analysis of enolase protein

2.6.2 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測分析 利用SOPMA軟件預(yù)測牛環(huán)形泰勒蟲enolase蛋白的二級結(jié)構(gòu)，其中α-螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角占比分別為43.03%、33.17%、15.63%和8.17% (圖7)。

使用SWISS-MODEL軟件預(yù)測牛環(huán)形泰勒蟲enolase蛋白的三級結(jié)構(gòu)(圖8)，模板號為2akm.1.A，全局模型質(zhì)量估計(global model quality estimation，GMQE)值為0.86，表明構(gòu)建的模型合理。

線條由長到短分別代表α-螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角 The lines represent alpha helix,random coil,extended strand and beta turn from long to short圖7 enolase蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.7 Prediction of secondary structure of enolase protein

2.6.3 抗原位點(diǎn)預(yù)測 用Vaxijen 2.0 在線服務(wù)器預(yù)測enolase抗原性，默認(rèn)閾值為0.4時預(yù)測結(jié)果0.4503，表明 enolase蛋白具有較高的抗原性。由IEDB Analysis Resource預(yù)測enolase編碼的氨基酸序列有17個抗原表位(表2)。將表中的抗原位點(diǎn)使用EzMol程序進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)果如圖9所示。

A，骨架式模型；B，卡通式模型；C，空間式模型。圖9同 A，Skeleton model;B，Cartoon model;C，Spatial model.The same as fig.9圖8 enolase蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.8 Prediction of tertiary structure of enolase protein

表2 enolase編碼氨基酸抗原表位預(yù)測Table 2 Prediction of epitopes of amino acids encoded by enolase

圖9 enolase基因編碼氨基酸抗原位置標(biāo)記Fig.9 Amino acid antigen location marker encoded by enolase gene

2.6.4 亞細(xì)胞定位 通過WoLF PSORT軟件亞細(xì)胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)，enolase蛋白位于細(xì)胞各成分的可能性為細(xì)胞質(zhì)22%、核糖體5%、細(xì)胞核3%、細(xì)胞外1%、溶酶體1%，初步預(yù)測了enolase蛋白發(fā)揮功能的位置，也與之參與糖酵解的功能相印證。

2.6.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 通過STRING在線數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，從而預(yù)測出與enolase蛋白發(fā)生相互作用的蛋白。由圖10可知，能與enolase蛋白發(fā)生互作的蛋白主要有磷酸甘油酸激酶(PGK)、磷酸甘油酸變位酶(PGAM)、二磷酸核苷激酶(NDK)、熱休克蛋白70(HSP70)等。主要參與的生物過程為糖酵解、糖異生、葡萄糖代謝過程、小分子分解代謝、合成等過程，還具有催化活性和結(jié)合分子的功能。

圖中兩個GAPDH為序列及長度均不相同的旁系同源 The two GAPDH in the figure are paralogs with different sequences and lengths圖10 enolase蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.10 Protein-protein interaction network of enolase protein

3 討 論

據(jù)估計，全世界約有2.5億頭牛面臨感染蜱傳環(huán)形泰勒蟲的風(fēng)險[13-14]。然而，目前存在的治療性化合物布帕伐醌(Buparvaquone，商品名稱為Buparvex)暴露于空氣中易失效[15]，且受限于需早期治療動物疾病。此外，也有關(guān)于環(huán)形泰勒蟲耐藥菌株的報道[16]，因此，尋找新方法預(yù)防泰勒蟲非常重要。

enolase是在原核生物和真核生物[17]中被鑒定為糖酵解過程中產(chǎn)生ATP的關(guān)鍵酶，通過參與細(xì)胞的產(chǎn)能過程，從而影響細(xì)胞的生命活動。通過基因組測序發(fā)現(xiàn)，頂復(fù)門寄生蟲缺少參與三羧酸循環(huán)和β-氧化途徑所需酶的基因序列，所以頂復(fù)門原蟲(Theileriaspp.)主要通過糖酵解生成ATP[18]。本研究通過對enolase基因進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了大小為1 248 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，其與已發(fā)表的環(huán)形泰勒蟲(GenBank登錄號：HQ_646253)相似性為97.35%。成功構(gòu)建分子質(zhì)量大小為70 ku的enolase重組蛋白，且以包涵體形式表達(dá)。該蛋白與Cayir等[19]構(gòu)建的環(huán)形泰勒蟲His-enolase融合重組蛋白可溶性相似，本試驗(yàn)篩選蛋白表達(dá)條件發(fā)現(xiàn)enolase蛋白可在低溫、低劑量誘導(dǎo)劑或短時間內(nèi)產(chǎn)生高于正常的表達(dá)量，其可溶性不隨之產(chǎn)生改變，但Cayir等[19]發(fā)現(xiàn)降低溫度和濃度可改變蛋白的可溶性，可能是由于標(biāo)簽不同影響蛋白的可溶性。Western blotting結(jié)果顯示，純化后的重組融合蛋白enolase與牛環(huán)形泰勒蟲陽性血清及GST標(biāo)簽抗體發(fā)生反應(yīng)，說明該蛋白有較好的反應(yīng)原性。

磷酸化是一種普遍存在的翻譯后修飾(post-translational modified，PTM)類型，是由磷酸基團(tuán)與氨基酸殘基(絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)和酪氨酸(Y))結(jié)合所引起的反應(yīng)[20]。這些特定的殘基在分子水平上表現(xiàn)出不同的功能，相應(yīng)產(chǎn)生的磷酸化反應(yīng)也調(diào)節(jié)著一些生命活動，如細(xì)胞周期控制、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)間的相互作用等過程，且識別磷酸化位點(diǎn)有助于揭示磷酸化相關(guān)生物過程的分子機(jī)制[21]。本研究預(yù)測牛環(huán)形泰勒蟲enolase蛋白有38個磷酸化位點(diǎn)，主要由蛋白激酶C/A(PKC/PKA)、肌酸激酶Ⅱ/Ⅰ(CKII/CKI)、cdc2構(gòu)成，enolase可能通過磷酸化過程從而影響細(xì)胞的部分生命活動。如Leykauf等[22]在2010年發(fā)現(xiàn)惡性瘧原蟲的頂端膜抗原1(apical membrane antigen-1，AMA1)的第610位氨基酸受環(huán)單磷酸腺苷(cAMP)調(diào)節(jié)的蛋白激酶A(PKA)控制絲氨酸磷酸化，若絲氨酸突變?yōu)楸彼釀t會導(dǎo)致磷酸化修飾失敗，從而影響蟲體入侵過程。

不同構(gòu)型、位置和數(shù)量使蛋白表現(xiàn)不同的功能[23]。α-螺旋參與構(gòu)成蛋白質(zhì)骨架，所以結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、難以形成表位嵌合抗體，但無規(guī)則卷曲及β-轉(zhuǎn)角則不同，位于蛋白表面，排列松散，易彎曲、折疊，所以能形成很好的抗原表位[24]。本研究預(yù)測發(fā)現(xiàn)，牛環(huán)形泰勒蟲enolase蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋與無規(guī)則卷曲的占比較大，而且通過預(yù)測enolase抗原表位、構(gòu)建可信的三級結(jié)構(gòu)及抗原標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，抗原位點(diǎn)大多位于表面，可能有利于宿主免疫系統(tǒng)識別和捕捉。蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位可初步預(yù)測蛋白在細(xì)胞中所處的位置進(jìn)而分析其功能[25]，本研究預(yù)測enolase主要存在于細(xì)胞質(zhì)(22%)，其次是核糖體(5%)，該結(jié)果與enolase蛋白糖酵解相關(guān)功能相一致。

在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中，每個蛋白都具有不同的特征，包括氨基酸序列、亞細(xì)胞位置和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。本研究通過STRING構(gòu)建牛環(huán)形泰勒蟲enolase蛋白的互作蛋白網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測網(wǎng)絡(luò)顯示，enolase蛋白與PGK、PGAM、NDK、HSP70等存在相互作用。Paludo等[26]分析蛋白互作網(wǎng)絡(luò)表明，enolase是網(wǎng)絡(luò)中的一個中心節(jié)點(diǎn)，除了與糖酵解和能量代謝相關(guān)的蛋白典型相互作用外，也是與不同生物過程(如轉(zhuǎn)錄、發(fā)育和凋亡等)相關(guān)的蛋白簇的一部分。Didiasova等[27]和Perconti等[28]在心肌細(xì)胞中證明，enolase-1與HSP70、α-enolase與HSPA8的相互作用可對其產(chǎn)生抗氧化應(yīng)激的保護(hù)。本研究的蛋白預(yù)測網(wǎng)絡(luò)分析可為enolase蛋白參與細(xì)胞供能、抗氧化應(yīng)激提供數(shù)據(jù)參考。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆出新疆牛環(huán)形泰勒蟲enolase基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-enolase，Western blotting結(jié)果顯示該蛋白有較好的反應(yīng)原性。生物信息學(xué)預(yù)測分析enolase蛋白可能為穩(wěn)定性親水蛋白，有38個磷酸化位點(diǎn)、17個抗原表位，主要位于細(xì)胞質(zhì)，與糖酵解相關(guān)基因PGAM及Hsp70家族存在互作。