白偉琴，卡楚拉，烏志勇，苗 苗,塔 娜，格日勒?qǐng)D

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010010)

豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一種較常見的、侵染性較高的、具有包膜結(jié)構(gòu)的、單股正鏈RNA病毒，屬于α冠狀病毒屬[1-2]?；蚪M全長(zhǎng)約28 kb，可編碼4種主要結(jié)構(gòu)蛋白，分別為纖突蛋白(S)、膜糖蛋白(M)、核衣殼蛋白(N)和小膜蛋白(E)[3]。其中，S蛋白屬于一種Ⅰ型糖蛋白，分布在病毒粒子最外層，與其他冠狀病毒S蛋白一樣，PEDV S蛋白也是定位于病毒粒子表面的一種二聚體結(jié)構(gòu)糖蛋白，在調(diào)節(jié)特定宿主細(xì)胞受體糖蛋白的相互作用、病原體侵入宿主細(xì)胞后的介導(dǎo)及刺激自然宿主誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。在表位疫苗的研究中選定能與主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類(MHCⅡ)有效匹配的肽序列尤為重要，因?yàn)镸HCⅡ-Ag易向輔助T細(xì)胞遞呈抗原，從而有望觸發(fā)細(xì)胞免疫和體液免疫兼?zhèn)涞拿庖邞?yīng)答，因此選擇S2基因B細(xì)胞表位(EpitopeS2)作為靶位序列。

副干酪乳桿菌作為一種常見的食品級(jí)微生物，在乳制品、飲料及保健食品中均能分離到，并在食品工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用[5]。利用非致病性和侵襲性的副干酪乳桿菌作為抗原傳遞載體應(yīng)用于疫苗研究領(lǐng)域，不僅能發(fā)揮乳酸菌本身的益生作用，還能避免制備純化病毒抗原的繁瑣流程，并有效刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[6]。乳酸菌S-層蛋白(S-layer protein，SLP)是蛋白質(zhì)狀的細(xì)胞包膜結(jié)構(gòu)[7]，可作為外部顯示的輔助蛋白和糖蛋白[8]，其作為融合蛋白還具備以下特點(diǎn)：首先，SLP是乳酸菌的特殊結(jié)構(gòu)，能在菌體表面組裝成納米級(jí)晶格結(jié)構(gòu)，將抗原表位嵌入到這些晶格中更有利于病毒抗原與宿主相關(guān)細(xì)胞接觸形成有效刺激[9]；其次，SLP具有增加宿主細(xì)菌黏附作用，可有效延遲細(xì)菌在腸道中滯留時(shí)間[10]。被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建S-層融合蛋白，在人或動(dòng)物的免疫接種中應(yīng)用。為更好地觸發(fā)免疫應(yīng)答，將EpitopeS2基因嵌入到乳酸菌SLP基因序列中構(gòu)建融合基因SLP-EpitopeS2，利用SLP的佐劑效應(yīng)使得表位肽更好地發(fā)揮作用。

本研究將SLP-EpitopeS2融合基因克隆到表達(dá)載體pTRK892中構(gòu)建重組質(zhì)粒pTRK-SLP-EpitopeS2，并將其電轉(zhuǎn)化至副干酪乳桿菌構(gòu)建重組副干酪乳桿菌來表達(dá)EpitopeS2抗原蛋白，以期為PEDV新型活菌載體疫苗相關(guān)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 副干酪乳桿菌由本實(shí)驗(yàn)室從傳統(tǒng)馬奶酒中分離并保存；重組質(zhì)粒pGEX-SLP-EpitpeS2由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建及保存[11]；大腸桿菌MC1061菌株、乳桿菌表達(dá)載體pTRK892均購(gòu)自Addgene公司。

1.1.2 主要試劑及儀器 PEDV B細(xì)胞表位單克隆抗體(McAb)委托吉爾生化(上海)有限公司制備；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自北京聚合美生物科技有限公司；增強(qiáng)型DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。

SDS-PAGE電泳儀購(gòu)自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司；激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自卡爾蔡司光學(xué)(中國(guó))有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)重組質(zhì)粒pGEX-SLP-EpitopeS2基因序列設(shè)計(jì)引物，序列如下：F：5′-GCTGAATTCTACTAGAAAGGAAAATCATCT-ATGAAGAAAAATTTAAGAATCGTTAGCGC-TG-3′；R：5′-AGAGCGGCCGCTTATCTAAAGT-TTGCAACCTTAAC-3′，下劃線處分別為EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)。引物由上海桑尼生物工程有限公司合成。

1.2.2 重組質(zhì)粒pTRK-SLP-EpitopeS2的構(gòu)建及鑒定 利用上述合成的引物，以重組質(zhì)粒pGEX-SLP-EpitopeS2為模板PCR擴(kuò)增SLP-EpitopeS2融合基因，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切目的基因，將目的基因與經(jīng)相同酶切處理的pTRK892表達(dá)載體用T4 DNA連接酶4 ℃過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061感受態(tài)細(xì)胞，從含有1.5%紅霉素(Em)的LB瓊脂培養(yǎng)基中篩選陽性克隆，陽性克隆經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定。

1.2.3 重組副干酪乳桿菌的構(gòu)建及鑒定 將副干酪乳桿菌制備為副干酪乳桿菌感受態(tài)細(xì)胞。將重組質(zhì)粒pTRK-SLP-EpitopeS2與副干酪乳桿菌感受態(tài)細(xì)胞混合冰浴5 min，將混合物轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)完成后添加800 μL含有0.500 mol/L蔗糖、0.020 mol/L MgCl2和0.005 mol/L CaCl2的MRS液體培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，37 ℃培養(yǎng)3 h。將200 μL細(xì)菌懸浮液均勻涂布于含有0.2%紅霉素的MRS固體培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h，直至形成單個(gè)菌落，將單個(gè)菌落接種于5 mL MRS液體培養(yǎng)基(Em+)中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，取少量菌液進(jìn)行PCR鑒定。將鑒定正確的重組副干酪乳桿菌菌液與 50%甘油1∶1混合，-80 ℃保存。

1.2.4 SDS-PAGE鑒定重組副干酪乳桿菌中SLP-EpitopeS2的表達(dá) 將pTRK-SLP-EpitopeS2菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，二代菌以1∶100(V/V)接種于MRS液體培養(yǎng)基(Em+)中，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48 h進(jìn)行蛋白表達(dá)。取1 mL菌液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，4 ℃、5 000×g離心10 min。沉淀用預(yù)冷的PBS洗滌3次，加入50 μL 1×SDS上樣緩沖液重懸沉淀，100 ℃煮沸5 min變性，冰浴5 min，12 000×g離心10 min，取20 μL蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)染色液染色1 h，考馬斯亮藍(lán)染色脫色液脫色1～2 h，觀察是否有目的蛋白。

1.2.5 Western blotting 鑒定重組副干酪乳桿菌中SLP-EpitopeS2的表達(dá) SDS-PAGE結(jié)束后，將蛋白凝膠通過半干轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)上，用5%脫脂奶粉室溫封閉3 h，然后將NC膜于PEDV B細(xì)胞表位單克隆抗體(1∶500稀釋)中4 ℃ 孵育過夜，次日NC膜用含0.05% Tween的PBST洗滌3次，每次10 min，然后與HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶5 000稀釋)室溫孵育2 h，用PBST洗滌3次，每次10 min。洗滌完后用增強(qiáng)型DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色觀察。

1.2.6 間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)鑒定 將載玻片用多聚賴氨酸處理30 min，并將D600 nm值約為1.0的重組副干酪乳桿菌(含pTRK-SLP-EpitopeS2質(zhì)粒)和對(duì)照副干酪乳桿菌(不含質(zhì)粒)用4%多聚甲醛固定在載玻片上，在1∶100稀釋的PEDV B細(xì)胞表位單克隆抗體中避光孵育45 min，用PBS洗滌2次后，樣品在1∶100稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 抗體中避光孵育30 min，并用PBS洗滌3次，然后通過激光共聚焦顯微鏡觀察和拍照記錄。

1.2.7 重組副干酪乳桿菌膜蛋白提取及鑒定 參考尹瓊芳等[12]氯化鋰(LiCl)提取SLP的方法,將擴(kuò)大培養(yǎng)的重組副干酪乳桿菌菌液分裝至50 mL離心管中，4 ℃、5 000 r/min離心5 min，收集菌體沉淀，沉淀用預(yù)冷的PBS洗滌3次，用8 mL 4 mol/L 的LiCl重懸菌沉淀，室溫?fù)u床孵育1 h，孵育結(jié)束后4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清。上清液于0.01 mol/L PBS(pH 7.4)中4 ℃透析，用聚乙二醇濃縮蛋白樣品溶液，取少量蛋白用1.2.4和1.2.5的方法分別進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pTRK-SLP-EpitopeS2鑒定結(jié)果

重組質(zhì)粒pTRK-SLP-EpitopeS2 PCR鑒定結(jié)果顯示，成功擴(kuò)增出大小為1 400 bp的條帶，與插入的SLP-EpitopeS2融合基因大小一致；EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定結(jié)果顯示，獲得大小分別為1 400 和4 700 bp的條帶(圖1)，與預(yù)期大小相符，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，不存在堿基缺失和基因突變，表明重組質(zhì)粒pTRK-SLP-EpitopeS2構(gòu)建成功。

M1，DL2000 DNA Marker；1，重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物；2，陰性對(duì)照；M2，DL5000 DNA Marker；3，重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物 M1，DL2000 DNA Marker；1，PCR product of recombinant plasmid；2，Negative control；M2，DL5000 DNA Marker；3，Double enzyme digestion products of recombinant plasmid圖1 重組質(zhì)粒pTRK-SLP-EpitopeS2鑒定結(jié)果Fig.1 Identification results of recombinant plasmid pTRK-SLP-EpitopeS2

2.2 重組副干酪乳桿菌鑒定結(jié)果

經(jīng)電轉(zhuǎn)化得到的單菌落稀釋后進(jìn)行 PCR 鑒定，在1 400 bp 處出現(xiàn)目的條帶(圖2)，表明重組質(zhì)粒pTRK-SLP-EpitopeS2成功轉(zhuǎn)入副干酪乳桿菌中。

2.3 SDS-PAGE鑒定SLP-EpitopeS2的表達(dá)

SDS-PAGE鑒定結(jié)果顯示，重組副干酪乳桿菌在48 ku處出現(xiàn)一條明顯的條帶，與目的蛋白預(yù)計(jì)大小相符，而副干酪乳桿菌陰性對(duì)照則在相應(yīng)位置處沒有出現(xiàn)條帶(圖3A)，根據(jù)SDS-PAGE結(jié)果可初步判定SLP-EpitopeS2融合基因在副干酪乳桿菌中得到了表達(dá)。

2.4 Western blotting 鑒定SLP-EpitopeS2的表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示，重組副干酪乳桿菌可與PEDV B細(xì)胞表位單克隆抗體進(jìn)行特異性結(jié)合，在48 ku處出現(xiàn)一條高特異性的條帶，而副干酪乳桿菌陰性對(duì)照則未出現(xiàn)任何條帶(圖3B)。表明融合基因SLP-EpitopeS2在副干酪乳桿菌中成功表達(dá)。

M，DL2000 DNA Marker；1、2，重組副干酪乳桿菌PCR產(chǎn)物；3，副干酪乳桿菌PCR產(chǎn)物 M，DL2000 DNA Marker；1 and 2，PCR products of recombinant Lactobacillus paracasei；3，PCR product of Lactobacillus paracasei圖2 重組副干酪乳桿菌鑒定Fig.2 Identification of recombinant Lactobacillus paracasei

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2，陰性對(duì)照；3，SLP-EpitopeS2蛋白表達(dá) M，Protein Marker；1 and 2，Negative control；3，SLP-EpitopeS2 protein expression圖3 SLP-EpitopeS2蛋白表達(dá)的SDS-PAGE(A)和Western blotting(B)鑒定Fig.3 SDS-PAGE (A) and Western blotting (B) identification of SLP-EpitopeS2 protein expression

2.5 IFA結(jié)果

IFA結(jié)果顯示，重組副干酪乳桿菌幾乎全部被激發(fā)出了綠色熒光信號(hào)，而副干酪乳桿菌對(duì)照則沒有出現(xiàn)相應(yīng)的綠色熒光信號(hào)(圖4)，根據(jù)結(jié)果判斷融合基因SLP-EpitopeS2可能表達(dá)于副干酪乳桿菌表面。

A,綠色熒光下重組副干酪乳桿菌；B,白光下重組副干酪乳桿菌；C,綠色熒光下對(duì)照菌；D,白光下對(duì)照菌 A,Recombinant Lactobacillus paracasei under green fluorescence；B,Recombinant Lactobacillus paracasei under white light；C,Negative control under green fluorescence；D,Negative control under white light圖4 重組副干酪乳桿菌IFA鑒定(400×)Fig.4 IFA identification of recombinant Lactobacillus paracasei (400×)

2.6 重組副干酪乳桿菌膜蛋白鑒定結(jié)果

重組副干酪乳桿菌和副干酪乳桿菌對(duì)照經(jīng)過LiCl處理后進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting鑒定，結(jié)果重組副干酪乳桿菌在48 ku處出現(xiàn)明顯的蛋白條帶，結(jié)合IFA結(jié)果推測(cè)融合基因表達(dá)于副干酪乳桿菌菌體表面(圖5)。

M,蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，重組菌膜蛋白；2，對(duì)照菌膜蛋白；3，重組菌培養(yǎng)上清；4，對(duì)照菌培養(yǎng)上清 M，Protein Marker；1，Membrane protein of recombinant bacteria；2，Membrane protein of control bacteria；3，Culture supernatant of recombinant bacteria；4，Culture supernatant of control bacteria圖5 膜蛋白中重組SLP-EpitopeS2的SDS-PAGE(A)和Western blotting(B)檢測(cè)結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE (A) and Western blotting (B) detection results of recombinant protein SLP-EpitopeS2 in membrane protein

3 討 論

過去的幾十年，豬流行性腹瀉給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[13]，引起了公眾的高度重視。接種疫苗仍是預(yù)防和控制PEDV最有效的方法[14]。近年來，國(guó)內(nèi)外研究者在PEDV疫苗研究方面作了大量的研究工作，研制了不同種類的疫苗[15]，對(duì)控制流行性腹瀉起到了良好的預(yù)防作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，傳統(tǒng)的滅活疫苗及減毒活疫苗在不久的將來可能會(huì)被基因工程疫苗等新疫苗替代。滅活疫苗雖然安全無毒，也能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)作用，但免疫周期短，保護(hù)效果不佳[16]，減毒疫苗如果減毒不完全還可能引起疾病感染[17]，然而，表位疫苗安全穩(wěn)定，其分子質(zhì)量較小，不會(huì)引起機(jī)體的免疫抑制及排斥反應(yīng)[18]。由于表位肽本身免疫原性不高,因此可選用嗜酸乳桿菌SLP進(jìn)行融合，增強(qiáng)其免疫原性。

乳酸菌是一類被公認(rèn)的、安全的、對(duì)動(dòng)物和人體有益的微生物，在自然界中廣泛存在[19]，且與腸道健康密切相關(guān)，能依賴自身在腸道中的定植特性定植于胃腸道中，通過自身的發(fā)酵功能分泌有機(jī)酸、抗菌素、維生素和具有生物活性的肽等物質(zhì)，乳酸菌向宿主釋放的物質(zhì)可抵抗有害菌的生長(zhǎng)繁殖，從而維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，調(diào)節(jié)胃腸道中的菌群平衡[20]。其中副干酪乳桿菌作為正常的腸道菌群，適應(yīng)胃腸道中高鹽、高酸性的環(huán)境，可在胃腸道環(huán)境中生存增殖，抗原蛋白也隨著菌體的復(fù)制而得到復(fù)制，并不斷向宿主釋放抗原蛋白。若將其開發(fā)成口服疫苗將是一個(gè)新的突破。Guo等[21]將PEDVS1基因克隆到乳球菌表達(dá)載體pNZ8149中構(gòu)建重組質(zhì)粒pNZ8149-S1，并將重組菌免疫BALB/c小鼠評(píng)價(jià)免疫原性，結(jié)果顯示，重組乳酸乳球菌可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高水平的體液免疫和黏膜免疫應(yīng)答。Li等[22]將PEDVS基因克隆到乳酸菌表達(dá)載體pVE5523中，免疫小鼠評(píng)價(jià)免疫原性，與Guo等[21]研究結(jié)果相似，可高水平地誘導(dǎo)體液免疫、細(xì)胞免疫和黏膜免疫。上述試驗(yàn)結(jié)果雖證明重組乳酸菌免疫小鼠能產(chǎn)生較高水平的體液免疫、黏膜免疫應(yīng)答，但存在由于插入片段大而導(dǎo)致對(duì)PEDV野外變異株的特異性差和抗原蛋白的表達(dá)量不高等瓶頸問題。

本試驗(yàn)首先擴(kuò)增出融合基因SLP-EpitopeS2，并將其克隆到乳桿菌表達(dá)載體pTRK892中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pTRK-SLP-EpitopeS2，并將其轉(zhuǎn)入副干酪乳桿菌中進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)。應(yīng)用食品級(jí)副干酪乳桿菌作為載體菌可避免抗原蛋白的純化等繁瑣流程，且選擇表位基因在某種程度上可克服病毒變異所帶來的中和病毒效率低等關(guān)鍵問題。SDS-PAGE和Western blotting 結(jié)果顯示，在相應(yīng)位置處出現(xiàn)特異性目的條帶，與多克隆抗體相比，選用單克隆抗體進(jìn)行Western blotting鑒定可有效減少與其他雜蛋白的交叉反應(yīng)，提高試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，根據(jù)與單克隆抗體抗的特異性結(jié)合，表明融合蛋白SLP-EpitopeS2還具備抗原性。在IFA中，成功解決了S2基因 B細(xì)胞表位肽在副干酪乳桿菌中能否有效表達(dá)的定性問題，與副干酪乳桿菌對(duì)照相比，重組副干酪乳桿菌絕大多數(shù)菌體都能激發(fā)出綠色熒光信號(hào)。但遺憾的是由于實(shí)驗(yàn)室激光共聚焦顯微鏡的性能參數(shù)所限，未能更準(zhǔn)確地證實(shí)S2表位肽是否在乳酸菌膜上定位問題。為補(bǔ)充證實(shí)該問題，使用4 mol/L高濃度的LiCl處理重組副干酪乳桿菌和副干酪乳桿菌對(duì)照，非特異性洗脫出乳桿菌表面上的膜蛋白，在這種高濃度的LiCl洗脫條件下，菌體表面混雜的膜蛋白幾乎都被洗脫下來，但對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的損傷甚微[23]。所以結(jié)合單克隆抗體高特異性識(shí)別目的融合蛋白，推測(cè)融合蛋白SLP-EpitopeS2可能在副干酪乳桿菌菌體表面表達(dá)。表達(dá)量高且展示于載體菌膜表面的蛋白是開發(fā)口服疫苗較高的優(yōu)勢(shì)[24]，但由于本試驗(yàn)尚未進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)而不能確定重組副干酪乳桿菌作為口服疫苗能否有效刺激機(jī)體產(chǎn)生高水平的免疫應(yīng)答。在今后還需通過進(jìn)一步試驗(yàn)確定其免疫原性。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)選擇乳酸菌表達(dá)載體pTRK892成功構(gòu)建了PEDV EpitopeS2 B細(xì)胞表位嵌入型SLP融合表達(dá)載體，并成功在副干酪乳桿菌中表達(dá)，為今后進(jìn)行PEDV 新型活菌載體疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。