魏占楠，葉英*，敏飛，才讓加，王樹林，梁欣悅

1. 青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院（西寧 810016）；2. 青海省同仁市工業(yè)商務(wù)和信息化局（西寧 811300）

同仁黃果梨俗稱酸果，《中國植物志》一書中以黃果命名。同仁黃果梨是青海省黃南藏族自治州同仁縣的特產(chǎn)，同仁縣隆務(wù)地區(qū)被譽為中國的“黃果之鄉(xiāng)”，黃果梨是白梨系統(tǒng)的青海地方梨品種之一，受獨特的自然因素的影響，造就同仁黃果梨果實碩大、皮薄松軟、色澤金黃、酸甜適度、清香沁人、汁多籽少、耐貯藏、營養(yǎng)豐富[1]的特點。同仁黃果梨在生津止渴、清痰化瘀、清熱解表、消食調(diào)胃，保肝護(hù)胃等方面具有獨特的醫(yī)藥、保健功能，是天然的綠色保健品的優(yōu)質(zhì)原料。

枸杞作為營養(yǎng)豐富的小漿果類食品，果實中的功能成分主要是枸杞多糖、黃酮和類胡蘿卜素，這些功能成分與枸杞果實的抗氧化活性密切相關(guān)[2]，其中胡蘿卜素具有很強的抗氧化能力[3-4]；菊花味甘苦，有散風(fēng)清熱、消炎解毒等功效[5]，其中黃酮類化合物具有抗菌、降血脂、抗氧化等良好的保健功能[6-8]；100%純沙棘原漿富含黃酮及不飽和脂肪酸等活性成分，具有顯著的抗氧化與保健功能[9-10]。

試驗以黃果梨浸膏、菊花浸膏、枸杞浸膏和100%純沙棘原漿為原料，研制黃果梨口服液，測定口服液抗氧化能力，為同仁黃果梨產(chǎn)品開發(fā)提供理論基礎(chǔ)，并提高加工利潤和產(chǎn)品層次，使青海省黃果梨擁有廣泛的市場前景。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

黃果梨（采摘自青海省同仁縣）；枸杞（采摘自寧夏頭茬特技枸杞）；菊花（上海梅家塢茶業(yè)有限公司）；100%純沙棘原漿（寧夏福壽康大健康生物科技有限公司）；白砂糖（食品級，北京廚大媽食品集團(tuán)有限公司）；果膠酶（食品級，河南萬邦實業(yè)有限公司）；纖維素酶（食品級，河南萬邦實業(yè)有限公司）；ABTS（上海源葉生物科技有限公司）；等。

R-1050型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長城科工茂有限公司）；LR10M型多功能智能離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司）；MultskanSky型微量核酸蛋白測定儀（Thermo Fisger Scientific）；721N型可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）；DHG-9070A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；KQ-800D型臺式醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗儀（東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司）；WF-B2000榨汁機(jī)（永康市天歌電器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃果梨口服液配比優(yōu)化試驗

1.2.1.1 黃果梨口服液的制備

工藝流程：原材料預(yù)處理→凈化→浸提→濾液→濃縮液→分裝→灌封→滅菌→成品。

操作要點：取黃果梨，洗凈，通過榨汁機(jī)得到黃果梨汁，果膠酶[11]和纖維素酶[12]加入量控制在0.15%，水浴酶解后過濾，抽濾，得到澄清梨汁，后將其在60℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)1 h至黏稠狀，得到黃果梨浸膏。枸杞、菊花采用煎煮法浸提，在加水量10倍、提取時間1.5 h、煎煮次數(shù)2次，浸提液在60 ℃的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)1 h至黏稠狀，得到枸杞、菊花浸膏。按單因素試驗設(shè)計的口服液原料配方比進(jìn)行配制，加入0.05%的黃原膠[13]作為穩(wěn)定劑，攪拌混勻后，以4 500 r/min離心15 min，過濾，分裝至棕色口服液瓶中，密封。巴氏殺菌105 ℃，30 min，自然冷卻至室溫，即得成品。

1.2.1.2 黃果梨口服液感官評價

表1 黃果梨口服液感官評分表

選擇10位品評員組成感官評定小組，參照趙儷穎等[14]的感官評分標(biāo)準(zhǔn)對制備的黃果梨口服液的色澤、香味、滋味和組織形態(tài)做出評定。

1.2.1.3 黃果梨口服液單因素試驗

固定其他因素及相應(yīng)水平，以黃果梨感官評分為指標(biāo)，研究黃果梨浸膏、枸杞浸膏、菊花浸膏、白砂糖、100%純沙棘原漿的添加量對黃果梨口服液感官評分的影響。設(shè)計各因素水平：黃果梨添加量10%，20%，30%，40%和50%；枸杞浸膏添加量15%，25%，35%，45%和55%；菊花浸膏添加量5%，10%，15%，20%和25%；白砂糖添加量8%，12%，16%，20%和24%；100%純沙棘原漿添加量1%，2%，3%，4%和5%，進(jìn)行單因素試驗，確定最佳添加量。

1.2.1.4 黃果梨口服液配比響應(yīng)面試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以黃果梨浸膏添加量、枸杞浸膏添加量、菊花浸膏添加量、白砂糖添加量和100%純沙棘原漿添加量為影響因素，以感官評分的分?jǐn)?shù)為響應(yīng)值，進(jìn)行五因素三水平的響應(yīng)面試驗。試驗因素水平設(shè)計見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計因素水平表 單位：%

1.2.2 黃果梨口服液成分測定

1.2.2.1 總黃酮含量測定

參考史巧霞等[15]的方法，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=20.422x-0.013 5，R2=0.999 5。采用Na NO2-Al(NO3)3比色法[16]測定總黃酮的吸光度，并按式（1）計算樣品中總黃酮含量（mg/g）。

式中：c為提取液總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；v為提取液總體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；M為樣品質(zhì)量，g。

1.2.2.2 總多酚含量測定

參考許玲玉等[17]的方法，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=7.627 9x-0.189 9，R2=0.999 5。并按式（2）計算樣品中總多酚含量（mg/g）。

式中：c為提取液總多酚的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液總體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.2.3 多糖含量測定

參考侯演林等[18]的方法，采用苯酚-硫酸法，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=0.085 1x+0.021 5，R2=0.999 5。并按式（3）計算樣品中多糖含量（mg/g）。

式中：c為多糖中葡萄糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V為定容體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為黃果梨干粉質(zhì)量，g。

1.2.2.4 可溶性固形物測定

參考NY/T 2637—2014《水果和蔬菜可溶性固形物含量的測定 折射儀法》測定樣品中可溶性固形物含量。

1.2.3 黃果梨口服液體外抗氧化活性研究

1.2.3.1 DPPH、O2-·、H2O2、·OH自由基清除率測定

根據(jù)劉仙俊等[19]的方法，測定黃果梨口服液對DPPH自由基、超氧陰離子（O2-·）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（·OH）的清除率，按照式（4）計算出供試樣的自由基清除率。

式中：Ax為樣品吸光度；Ax0為陽性對照吸光度；A0為空白對照吸光度。

1.2.3.2 ABTS自由基清除率測定

ABTS自由基清除率測定根據(jù)劉茂等[20]的方法，待測樣品和ABTS工作液以1∶4混合，室溫避光反應(yīng)10 min后，在734 nm波長處測吸光度。以抑制率表示自由基清除能力大小，按式（5）計算[21]。

式中：Asample為樣品+ABTS工作液的吸光度；Asampleblack為樣品+去離子水的吸光度；Acontrol為去離子水+ABTS工作液的吸光度；Acontrolblack為去離子水的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗中圖表均采用Origin 2018繪制。采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行試驗數(shù)據(jù)分析，試驗統(tǒng)計數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD，n=3）表示，以P＜0.05表示顯著性差異，P＜0.01表示極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃果梨口服液配比工藝優(yōu)化試驗結(jié)果

2.1.1 黃果梨口服液配比單因素試驗結(jié)果

2.1.1.1 白砂糖添加量對黃果梨口服液感官評分的影響

白砂糖添加量對黃果梨口服液感官評分的影響見圖1（a）。隨著白砂糖添加量的增加，黃果梨口服液的感官評分呈現(xiàn)線上升后下降趨勢，白砂糖添加量小于12%時，酸味大于甜味，口感不協(xié)調(diào)；白砂糖添加量大于12%時，黃果梨口服液口感偏甜，掩蓋梨汁原有的風(fēng)味，口感較膩，可接受度較低。白砂糖添加量12%時黃果梨口服液酸甜適度，滋味純正，協(xié)調(diào)柔和，可作為矯味劑以均衡黃果梨偏酸的口感，酸甜口感層次分明，風(fēng)味最佳。故確定白砂糖添加量12%時口感最佳。

2.1.1.2 菊花浸膏添加量對黃果梨口服液感官評分的影響

菊花浸膏添加量對黃果梨口服液感官評分的影響見圖1（b）。隨著菊花添加量的增加，黃果梨口服液的感官評分呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，菊花味甘苦，氣味較大[22]，經(jīng)過提取濃縮之后，菊花味濃郁，如果菊花浸膏添加量小于10%，菊花特有的甘苦味口感會下降不突出；如果菊花浸膏添加量超過10%，會影響口服液整體口感，甘苦味加重，掩蓋了黃果梨特有的清香，故確定菊花浸膏的添加量為10%時最佳。

2.1.1.3 枸杞浸膏添加量對黃果梨口服液感官評分的影響

枸杞浸膏添加量對黃果梨口服液感官評分的影響見圖1（c）。隨著枸杞浸膏的增加，黃果梨口服液的感官評分呈先上升后下降趨勢，枸杞浸膏添加量小于35%時，枸杞味比較淡，枸杞風(fēng)味不是很突出；枸杞浸膏添加量超過35%時，雖然隨著枸杞的增加量，其抗氧化活性也會隨之增加[23]，但枸杞風(fēng)味會過于濃郁，感官評分有所下降；枸杞浸膏添加量35%時，口感柔和協(xié)調(diào)，各種風(fēng)味層次分明，感官評分最高；故確定枸杞浸膏添加量35%時最佳。

2.1.1.4 黃果梨浸膏添加量對黃果梨口服液感官評分的影響

黃果梨浸膏添加量對黃果梨口服液感官評分的影響見圖1（d）。隨著黃果梨浸膏的增加，黃果梨口服液的感官評分呈先上升后下降趨勢，添加量低于40%時，枸杞風(fēng)味掩蓋黃果梨風(fēng)味，口感不協(xié)調(diào)；添加量超過40%時，具有濃郁的黃果梨香氣，但口感過酸；黃果梨浸膏添加量為40%時，黃果梨口服液風(fēng)味獨特，酸甜可口，感官評分最高；故確定黃果梨浸膏添加量40%時最佳。

2.1.1.5 100%純沙棘原漿添加量對黃果梨口服液感官評分的影響

100%純沙棘原漿添加量對黃果梨口服液感官評分的影響見圖1（e）。隨著100%純沙棘原漿的增加，黃果梨的感官評分呈先升高后降低趨勢，添加量3%時，感官評分最高，口感適中，具有黃果梨枸杞沙棘等特有的風(fēng)味；100%純沙棘原漿添加量超過3%時，黃果梨口服液的感官評分下降，沙棘特有的酸味過重，黃果梨枸杞等風(fēng)味被沙棘的香氣掩蓋，口感不協(xié)調(diào)，香氣不平衡。故確定100%純沙棘原漿添加量為3%時最佳。

圖1 黃果梨口服液配比單因素試驗結(jié)果

2.1.2 黃果梨口服液配比響應(yīng)面試驗結(jié)果

在單因素試驗分析基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計五因素三水平共46組響應(yīng)面分析試驗，試驗設(shè)計及結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

由表3可知，對試驗結(jié)果進(jìn)行多元回歸方程分析，得到回歸方程：感官評分=-173.140 63+5.412 50A+4.022 92B+1.887 50C+10.729 17D+11.937 50E+0.000 000AB-0.010 000AC-0.025 000AD+0.000 000AE-0.010 000BC-0.025 000BD+0.150 00BE+0.000 000CD-0.050 000CE-0.125 00DE-0.082 292A2-0.057 292B2-0.052 500C2-0.274 74D2-2.145 83E2，方程二次項系數(shù)均為負(fù)數(shù)，故方程有最大值，符合試計要求。

表3 Box-Behnken設(shè)計方案及結(jié)果

由表4可知，該試驗?zāi)Ｐ蚉＜0.01（極顯著），失擬項P=0.726 4（不顯著），模型相關(guān)系數(shù)R2=0.844 6，說明該模型設(shè)計較為合理，能夠擬合試驗數(shù)據(jù)，可用于黃果梨口服液原料配比的分析和預(yù)測。在所設(shè)計的試驗范圍內(nèi)各因素對黃果梨口服液的感官評分的影響依次為100%純沙棘原漿＞枸杞浸膏＞黃果梨浸膏=白砂糖＞菊花浸膏。

表4 回歸方程顯著性檢驗與方差分析

2.1.3 各因素交互效應(yīng)分析

為研究各因素對感官評分的影響，繪制響應(yīng)面圖，響應(yīng)面坡度可以反映2個因素交互作用對響應(yīng)值的影響程度，坡度越大表示影響越大。等高線的形狀反映2個因素交互作用的顯著性，橢圓形表示交互作用顯著，圓形表示交互作用不顯著[24]。

圖2 各因素交互作用對感官評分影響的響應(yīng)面圖

2.1.4 驗證試驗

黃果梨口服液的原料配比根據(jù)響應(yīng)面試驗最優(yōu)條件，進(jìn)行3次驗證試驗。按響應(yīng)面優(yōu)化得到最優(yōu)條件，設(shè)定黃果梨浸膏添加量35.28%、枸杞浸膏添加量29.88%、菊花浸膏添加量10.13%、白砂糖添加量15.78%及100%純沙棘原漿添加量3.44%；平行試驗3次后，實際測得的感官評分為91分，預(yù)測值為93.40分，相對誤差只有0.97%，說明回歸模型的準(zhǔn)確性和可信度較高，驗證該模型的有效性。

2.1.5 黃果梨口服液成分及含量檢測結(jié)果

由于原料以浸膏形態(tài)加入，濃度較大，導(dǎo)致總多糖、黃酮、總多酚含量比較高，其中總黃酮含量達(dá)34.54mg/g，總多糖含量達(dá)27.86 mg/g，總酚含量達(dá)24.56 mg/g。

表5 黃果梨口服液成分含量表

2.1.6 黃果梨口服液體外抗氧化試驗結(jié)果分析

黃果梨口服液對DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除、超氧陰離子自由基（O2-·）清除率、羥基自由基（·OH）清除率、過氧化氫自由基（H2O2）清除率結(jié)果見圖3。

圖3 黃果梨口服液的抗氧化活性研究

根據(jù)劉晶晶等[25]口服液的抗氧化活性研究表明，不同質(zhì)量濃度下的口服液抗氧化活性隨著溶液質(zhì)量濃度的增大逐漸增強，浸膏的狀態(tài)加入，對提高黃果梨口服液的風(fēng)味和抗氧化能力是有益的。在阿不都維力·阿不都爾尼等[26]的玫菊口服液、史瑞琴等[27]的小球藻多糖口服液和馬濤等[28]的?；撬岽蠖沟鞍卓诜嚎寡趸钚匝芯恐芯鶎ψ杂苫幸欢ㄇ宄饔?。

DPPH·作為一種穩(wěn)定性較好的自由基，黃果梨口服液DPPH自由基清除率為60.00%；ABTS法是作為測定自由基清除率能力的較為廣泛的間接檢測方法，黃果梨口服液對其的清除率最高，為91.10%；O2-·自由基一般會導(dǎo)致細(xì)胞的損傷、衰老等，在黃果梨口服液中O2-·清除率為86.20%；·OH的氧化性極高，有強毒害性，是導(dǎo)致人體產(chǎn)生各種疾病的原因之一，黃果梨口服液對其的清除率為67.44%；H2O2對人體的傷害與自由基類似，損害人體內(nèi)生物大分子，導(dǎo)致人體細(xì)胞衰老，是產(chǎn)生各類復(fù)雜疾病的重要原因，黃果梨口服液對其的清除率為85.80%。

3 結(jié)論

試驗以黃果梨浸膏為主要原料，輔以枸杞浸膏、菊花浸膏、白砂糖、100%純沙棘原漿，以感官評分為評價指標(biāo)，通過單因素試驗和Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化，確定黃果梨口服液最佳配方：黃果梨浸膏35.28%、枸杞浸膏29.88%、菊花浸膏10.13%、白砂糖15.78%、100%純沙棘原漿3.44%。該配方所制備黃果梨口服液樣品風(fēng)味獨特，組織狀態(tài)均勻，具有黃果梨清香及枸杞、菊花和沙棘的獨特風(fēng)味，口感酸甜適宜，感官評分最高91分。在原料最佳配比條件下，對ABTS自由基、超氧陰離子自由基（O2-·）、過氧化氫自由基（H2O2）、DPPH自由基的清除率分別為91.10%，86.2%，85.8%和60%?？寡趸栽囼灧治鲲@示黃果梨口服液具有一定抗氧化性。試驗為黃果梨后續(xù)抗氧化產(chǎn)品及相關(guān)功能性產(chǎn)品的研發(fā)提供一定理論依據(jù)，為黃果梨高原特色資源的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)，但其功能特性和結(jié)構(gòu)特性等其他方面有待進(jìn)一步深探。