康 濤，郭曉敏，王 濤，雷 琦，楊 謙，郭荷娜

(陜西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科，陜西 西安 710068)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)，又名震顫麻痹，是除了阿爾茲海默病外的第二大中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，多發(fā)于中老年人[1]。帕金森病的病理機(jī)制復(fù)雜，近年來對神經(jīng)退行性病變發(fā)病機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的腦內(nèi)慢性炎癥反應(yīng)可能是其重要病理特征之一[2]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最主要的免疫細(xì)胞，腦部炎癥發(fā)生后，小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生并釋放大量的炎癥因子到病變區(qū)，進(jìn)一步加重大腦的炎癥損傷[3-4]。因此，如何減少小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)是減輕大腦繼發(fā)性損傷的關(guān)鍵所在。

NLRC3是含有CARD(Caspase-recruitment domain)結(jié)構(gòu)域的NOD樣受體家族3的簡稱，在多種疾病中起抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)控細(xì)胞增殖、抑制腫瘤發(fā)生的作用[5-6]。據(jù)報(bào)道，提高NLRC3的表達(dá)可抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路介導(dǎo)的腦脊髓炎[7]。另有研究表明，NLRC3參與調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育[8]。然而，NLRC3在小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用及分子機(jī)制尚不清楚。本研究通過過表達(dá)小膠質(zhì)細(xì)胞BV2中的NLRC3，來探究其對LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響以及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫；一抗抗體與二抗抗體均購自Abcam公司；BCA蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hy Clone公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司；Ad-NLRC3-GFP(Ad-NLRC3)及其對照空載體Ad-CONl7-GFP(Ad-NC)腺病毒購自上海吉?jiǎng)P基因公司；PCR引物由上海生工生物科技有限公司完成；一氧化氮(NO)測定試劑盒購自南京建成生物技術(shù)有限公司；ELISA試劑盒購自北京東哥生物科技公司；二氧化碳培養(yǎng)箱購自上海力申科學(xué)儀器有限公司；羅氏96熒光定量PCR儀購自美國Roche Applied Science公司；iMark酶標(biāo)儀購自美國BIO-RAD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2常規(guī)培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清及雙抗)中，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱，隔天換液，細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)傳代，傳至第三代后給予LPS刺激，24 h之后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將生長狀況良好的BV2細(xì)胞計(jì)數(shù)后均勻接種于6孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右，按復(fù)合感染指數(shù)(MOI)=100加入腺病毒液感染48 h。之后利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的GFP熒光強(qiáng)度。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR：根據(jù)Trizol法提取細(xì)胞中總RNA，并檢測總RNA的完整性及純度，接著利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，再使用熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量檢測。NLRC3上游引物序列為5’-CTACCCAAGGCATTCAGCCA-3’，下游引物序列為5’-ACACCTCTTGCTTCCTCGTG-3’；內(nèi)參基因GAPDH上游引物序列為5’-CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3’，下游引物序列為5’-TGCTTCACCACCTTCTTGATG-3’。PCR循環(huán)程序?yàn)?5 ℃預(yù)熱3 min，94 ℃變性20 s，59 ℃退火30 s，72℃延伸20 s，共35個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對表達(dá)量。

1.2.4 Western blot：收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。使用BCA蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒測定蛋白含量，將蛋白上樣至SDS-PAGE中，130 V恒壓電泳2 h；濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；用含5%脫脂奶粉的Tris緩沖液封閉1 h，裁剪后與一抗4 ℃孵育過夜；TBST清洗膜8 min，重復(fù)4次，加相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h；TBST重復(fù)清洗膜4次，用ECL法顯像，用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.2.5 CCK-8法檢測細(xì)胞活力：利用不同濃度LPS(0.1、1、2、5 g/ml)處理小膠質(zhì)細(xì)胞，每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。48 h后加入10 μl CCK-8試劑并繼續(xù)孵育4 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度。

1.2.6 比色法檢測NO含量：將小膠質(zhì)細(xì)胞分為未處理組，LPS處理組，LPS+Ad-NC處理組，LPS+Ad-NLRC3處理組，每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。48 h后裂解細(xì)胞，按照檢測試劑盒說明書檢測NO含量。

1.2.7 ELISA測定白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平:將小膠質(zhì)細(xì)胞分為未處理組，LPS處理組，LPS+Ad-NC處理組，LPS+Ad-NLRC3處理組，每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。48 h后收集培養(yǎng)基上清液，然后嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩個(gè)樣本均數(shù)比較使用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本間比較使用ANOVA方差分析；P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LPS處理對BV2細(xì)胞活力的影響 使用不同濃度LPS(0.1、1、2、5 g/ml)處理BV2細(xì)胞后，其細(xì)胞活力分別為(98.67±6.38)%、(85.24±2.64)%、(78.37±8.11)%、(69.55±4.77)%。與未處理組相比，1、2、5 g/ml LPS處理組的細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)，而0.1 g/ml LPS處理組與未處理組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見圖1。

注：與未處理組比較，*P<0.05

2.2 LPS處理對NLRC3表達(dá)的影響 qRT-PCR與Western blot檢測結(jié)果顯示，與未處理組比較，LPS處理后的BV2細(xì)胞中NLRC3的mRNA與蛋白表達(dá)量下降(圖2A、2B)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而Ad-NLRC3顯著提高了BV2細(xì)胞中NLRC3的mRNA與蛋白表達(dá)水平(P<0.05，圖2A、C)。

注：與未處理組比較，*P<0.05；與LPS+Ad-NC組比較，#P<0.05

2.3 過表達(dá)NLRC3抑制LPS誘導(dǎo)的NO釋放 NO含量檢測結(jié)果表明，LPS顯著增加了BV2細(xì)胞中NO的釋放，而Ad-NLRC3顯著抑制了LPS誘導(dǎo)的NO釋放，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見圖3。

注：與未處理組比較，*P<0.05；與LPS+Ad-NC組比較，#P<0.05

2.4 過表達(dá)NLRC3抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá) 本實(shí)驗(yàn)利用ELISA和qRT-PCR測定BV2細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子的表達(dá)水平。ELISA結(jié)果顯示，經(jīng)LPS處理的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量顯著增多，而Ad-NLRC3抑制了它們的表達(dá)(圖4A)，相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。同樣，qRT-PCR的結(jié)果顯示，Ad-NLRC3可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)(P<0.05，圖4B)。

注：與未處理組比較，*P<0.05；與LPS+Ad-NC組比較，#P<0.05

2.5 過表達(dá)NLRC3抑制LPS誘導(dǎo)的PI3K/AKT和NF-κB信號通路激活 為進(jìn)一步探究NLRC3抑制BV2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)檢測了NLRC3對PI3K/AKT和NF-κB通路的影響。LPS處理顯著上調(diào)p-AKT/AKT、p-p65/p65以及p-IκB/IκB的比值，而Ad-NLRC3顯著降低了p-AKT/AKT、p-p65/p65以及p-IκB/IκB的比值，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見圖5。

注：與未處理組比較，*P<0.05；與LPS+Ad-NC組比較，#P<0.05

3 討 論

LPS是革蘭陰性菌的產(chǎn)物，可通過激活細(xì)胞內(nèi)的NF-κB、MAPK等炎癥信號通路，引起小膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α等炎癥因子、NO等炎癥介質(zhì)的表達(dá)增加，因此被廣泛用于刺激在體或體外細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[9-10]。本研究中運(yùn)用LPS刺激小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2建立小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在給予LPS刺激后，BV2細(xì)胞中PI3K/AKT與NF-κB通路被激活，NO以及炎癥因子的表達(dá)量都顯著提高。

NLRC3是天然免疫系統(tǒng)中的一種模式識別受體，能夠感受外源入侵和內(nèi)源性的危險(xiǎn)信號。Karki等[11]在NLRC3-/-小鼠腸炎相關(guān)腸腫瘤模型的研究中發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，NLRC3-/-小鼠局部結(jié)腸組織中的炎性細(xì)胞及炎性細(xì)胞因子(IL-lβ、IL-6與TNF等)均顯著升高，免疫印跡結(jié)果顯示，IκBα磷酸化水平也顯著增加。Gültekin等[12]發(fā)現(xiàn)NLRC3通過與炎癥小體復(fù)合物相互作用來負(fù)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。此外，據(jù)報(bào)道，NLRC3可通過減少PI3K的激活來抑制小鼠肺動脈高壓炎癥[13]。Schneider等[14]稱，NLRC3可以減少LPS誘導(dǎo)的NF-κB的釋放，進(jìn)而抑制炎癥的發(fā)生。在本研究建立的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型中，NLRC3的表達(dá)量顯著降低，過表達(dá)NLRC3后，LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)受到抑制。

NF-κB是調(diào)控炎癥反應(yīng)的重要信號分子，LPS刺激可以誘導(dǎo)IκB磷酸化，NF-κB二聚體被釋放，從胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)入胞核，啟動炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[15]。而且，大量體內(nèi)體外研究表明，抑制NF-κB信號通路的激活可以有效減輕小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，這可能成為帕金森病的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)[16]。PI3K/AKT是一種參與細(xì)胞生命活動以及調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的重要信號通路[17-18]。有報(bào)道稱，LPS處理小膠質(zhì)細(xì)胞可以激活PI3K/AKT通路，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制PI3K/AKT通路的激活可以提高小膠質(zhì)細(xì)胞的抗炎作用[19-20]。另外，有研究已證實(shí)NLRC3能夠抑制NF-κB與PI3K/AKT信號通路，調(diào)控炎癥的發(fā)生[13-14]。同樣，本研究結(jié)果表明NLRC3可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中LPS導(dǎo)致的NF-κB與PI3K/AKT通路的激活。

綜上所述，過表達(dá)NLRC3可通過抑制NF-κB與PI3K/AKT信號通路抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，為延緩和治療帕金森病提供了新的思路和理論依據(jù)。