孫宇石，楊森，林慧慶*

(1武漢大學(xué)人民醫(yī)院胸外科，武漢430060；2武漢大學(xué)第一臨床學(xué)院，武漢430060)

間質(zhì)性肺病(interstitial lung disease，ILD)是許多自身免疫病的常見并發(fā)癥，雖然系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)患者并發(fā)ILD的發(fā)病率較低(1%～15%)，但I(xiàn)LD嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，增加了死亡風(fēng)險(xiǎn)[1]。SLE病程超過10年、50歲后發(fā)病、反復(fù)發(fā)作的急性狼瘡肺炎病史[2]、雷諾現(xiàn)象、抗核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP )抗體、硬化癥和甲襞毛細(xì)血管鏡檢查異常的患者更易患SLE-ILD[3]。

白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8) 濃度增高可作為活動(dòng)性SLE和 SLE-ILD的有效生物標(biāo)志物[4]，且IL-8水平與肺纖維化的嚴(yán)重程度相關(guān)[5]。作為中性粒細(xì)胞的強(qiáng)效趨化劑與激活劑，IL-8與肺纖維化的相關(guān)性提示了中性粒細(xì)胞與肺纖維化的相關(guān)性。

中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)是中性粒細(xì)胞在體外特定刺激下形成的一種纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[6]，其主要成分為DNA和組蛋白，除了具有殺滅病原微生物的作用外，還可能參與自身免疫反應(yīng)。在SLE患者多部位組織活檢中發(fā)現(xiàn)NETs存在[7,8]，因此NETs在結(jié)締組織病及ILD中的作用逐漸被重視。

1 NETs的基本介紹

Brinkmann等[6]在體外利用佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)、脂多糖((lipopolysaccharide，LPS) 或IL-8刺激被分離出的中性粒細(xì)胞，可形成一種胞外纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，即NETs。DNA是NETs的主要成分[6]，肽基精氨酸脫亞胺酶4(peptidylarginine deiminase 4，PAD4)、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)、瓜氨酸組蛋白(citrullinated histone H3，citH3)、內(nèi)源性抗菌肽LL-37[9]、胞質(zhì)蛋白[10]、白細(xì)胞介素-17(interleukin-17，IL-17)等也參與了NETs的構(gòu)成。NETs形成的過程稱為中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)形成或凋零(NETosis)。目前普遍認(rèn)為NETosis是細(xì)胞的一種死亡途徑。根據(jù)刺激物的不同和過程的差異，目前認(rèn)為NETosis有3種形式。

1.1 自殺式NETosis

在PMA、自身抗體或膽固醇結(jié)晶的刺激下，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶被蛋白激酶C(protein kinase C，PKC) /Raf/絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MEK)/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)通路激活并產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，并在輔因子Ca2+的輔助下激活PAD4，導(dǎo)致染色體解聚[10]。同時(shí)NE和MPO轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中破壞核膜，釋放染色質(zhì)到胞質(zhì)中并被顆粒蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白修飾。最后，NETs 通過破壞的質(zhì)膜釋放，中性粒細(xì)胞死亡[11]。此途徑中ROS的產(chǎn)生對于激活PAD4至關(guān)重要，所以被稱為NOX依賴性途徑[12]。

1.2 活性NETosis

該方式由補(bǔ)體受體(complement receptor 3，CR3)或Toll樣受體2(Toll-like receptors 2，TLR2) 誘導(dǎo)，也可直接通過Toll樣受體4(toll-like receptors 4，TLR4) 或間接通過由TLR4 激活的血小板誘導(dǎo)。PAD4以不依賴ROS的途徑被激活，并誘導(dǎo)染色質(zhì)解聚，同時(shí)NE破壞核膜。與自殺式不同的是，染色質(zhì)通過囊泡排出，質(zhì)膜保持完整，中性粒細(xì)胞仍具有生物活性[11]。

1.3 伴線粒體DNA釋放的活性NETosis

在粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和LPS或補(bǔ)體因子5a刺激中性粒細(xì)胞的情況下，線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)以依賴ROS的方式被釋放到細(xì)胞外[13]，該過程不影響中性粒細(xì)胞的功能和壽命[14]，是先天免疫的重要組成部分，但具體的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

急性創(chuàng)傷和后續(xù)手術(shù)患者中性粒細(xì)胞中檢測出NETs生成，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR)證實(shí)由mtDNA組成，并且含有大量超氧化物[15]。在肺移植后原發(fā)性移植物功能障礙和化學(xué)誘導(dǎo)肺損傷過程中也存在mtDNA釋放增加。mtDNA是細(xì)胞損傷標(biāo)志物和炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)劑，通過Toll樣受體9(Toll-like receptors 9，TLR9)促進(jìn)了自殺式NETosis的形成，導(dǎo)致嚴(yán)重的組織損傷[16,17]。

NETs是具有生物活性的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，依賴其生物及物理性質(zhì)在抵抗病原微生物方面發(fā)揮了提高抗菌物質(zhì)濃度、減少毒力因子和殺滅細(xì)菌、作為物理屏障限制細(xì)菌傳播和減少蛋白酶等物質(zhì)對于臨近組織損傷的作用。但是，NETs是一把雙刃劍，組蛋白復(fù)合物的釋放可能會(huì)導(dǎo)致自身免疫病[6]。

2 NETs在SLE-ILD發(fā)病機(jī)制中的作用

2.1 NETs與SLE的關(guān)系

在SLE患者血清中普遍存在的核糖核蛋白免疫復(fù)合物(ribonucleoprotein immune complexes，RNP-IC)介導(dǎo)的NETosis在SLE發(fā)病機(jī)制中有重要作用。由于SLE樣本中ROS 產(chǎn)生受損[18]，所以氧化的mtDNA依賴線粒體ROS被釋放至細(xì)胞外[19]。SLE患者中存在獨(dú)特的低密度粒細(xì)胞 (low-density granulocytes，LDG)，具有更強(qiáng)的自發(fā)性NETosis能力[20]，導(dǎo)致更多mtDNA、LL-37和 IL-17的暴露[21]，進(jìn)一步增加了NETosis的發(fā)生率。胞外的mtDNA通過環(huán)鳥甘酸-腺苷酸合酶(cyclin GMP-AMP synthase，cGAS)-干擾素基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes，STING)途徑刺激漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞中Ⅰ型干擾素(interferon，IFN)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[22]，導(dǎo)致靶細(xì)胞釋放的炎癥細(xì)胞因子顯著增加。

NETs的主要成分為DNA，可被脫氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease，DNase)降解。DNase1 抑制劑的存在，或抗體與NETs結(jié)合從而阻止 DNase1進(jìn)入NETs都可能導(dǎo)致NETs降解被抑制。NETs的清除受損導(dǎo)致NETs-IgG免疫復(fù)合物形成，自身抗體產(chǎn)生增多。NETs清除異?？赡軈⑴c了狼瘡腎炎的形成[23]。

2.2 NETs與肺纖維化的關(guān)系

在博來霉素(bleomycin，BLM)誘導(dǎo)的肺纖維化模型中檢測到支氣管肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞數(shù)量升高，且肺組織免疫熒光染色可觀察到NETs 的出現(xiàn)，表明中性粒細(xì)胞的遷移和 NETs 的形成參與了肺纖維化進(jìn)程[24]。

使用PAD抑制劑可抑制NETosis、減輕肺纖維化程度；PAD基因敲除小鼠的炎性基因(IL-6、IFN-γ、TNFα)表達(dá)、纖維化基因(CTGF、FGF2、Eln、Fn1、ColⅠa1、TGF-β1、α-SMA)表達(dá)及肺纖維化程度均降低[24]。因此可以推斷NETs需依賴PAD4實(shí)現(xiàn)促纖維化和促炎作用。DNase處理的中性粒細(xì)胞產(chǎn)生解整合素金屬蛋白酶1(recombinant A disintegrin and metalloprotease 1，ADAM1)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、結(jié)締組織生長因子2(connective tissue growth factor，CCN2)明顯降低，分泌膠原蛋白的肌成纖維細(xì)胞[25]分化減少。

轉(zhuǎn)化生長因子-β1 (transforming growth factor-β1，TGF-β1) /Smad2/3通路是TGF-β參與纖維化的經(jīng)典通路[26]，且是抗纖維化藥物吡非尼酮的作用靶點(diǎn)[27]。PAD4基因敲除小鼠經(jīng)BLM刺激后TGF-β1表達(dá)下調(diào)[24]，但阻斷TGF-β1對NETs誘導(dǎo)的α-SMA表達(dá)無影響[7]。因此至少存在另一條通路與TGF-β1通路并列位于NETs的下游，共同參與肺纖維化的形成過程。

2.3 NETs與SLE-ILD 的關(guān)系

IL-8是中性粒細(xì)胞的強(qiáng)效趨化劑和激活劑[5]，與CXC趨化因子受體1/2(CXC chemokine receptor1/2，CXCR1/2)結(jié)合可促進(jìn)炎癥反應(yīng)、血管生成、有絲分裂和增殖[28]。IL-8可作為活動(dòng)性SLE和 SLE -ILD的有效生物標(biāo)志物[4]，且IL-8的水平與肺纖維化的嚴(yán)重程度相關(guān)[5]。IL-8是沙度利胺改善肺間質(zhì)纖維化的作用靶點(diǎn)[29]。另外，IL-8/CXCR2 軸誘導(dǎo) NETs 生成，通過不同的下游通路參與了動(dòng)脈粥樣硬化[28]、乳腺癌、慢性淋巴性白血病[30]等疾病的進(jìn)程。

皮肌炎(dermatomyositis，DM) /多發(fā)性肌炎(polymyositis，PM)患者存在LL37和血漿游離DNA依賴性的NETs增多[31]。NETs通過TLR9/微小核糖核酸7(microRNA7, miR7)/Smad2信號(hào)通路，參與人肺成纖維細(xì)胞的增殖及其向肌成纖維細(xì)胞的分化，促進(jìn)了肺纖維化形成[32]。另外，DM/PM-ILD的患者血清DNase1活性顯著降低。NETs下游通路的過度激活和清除異常共同導(dǎo)致了多發(fā)性肌炎相關(guān)間質(zhì)性肺病(polymyositis-ILD，PM-ILD)的形成。

在非特異性間質(zhì)性肺炎(nonspecific interstitial pneumonia，NSIP)患者的肺組織活檢中，α-SMA陽性的成纖維細(xì)胞附近發(fā)現(xiàn)了NETs[7]。由于各種自身免疫病的機(jī)制聯(lián)系密切，且SLE-ILD與PM-ILD的病理類型都是NSIP，所以NETs的清除異常很可能也是SLE-ILD的機(jī)制。

在活動(dòng)性SLE炎癥微環(huán)境條件下，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)和內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞表達(dá)應(yīng)激反應(yīng)蛋白(regulated in development and DNA damage responses 1，REDD1)，通過REDD1/自噬/NETs/組織因子(tissue factor,TF)/凝血酶軸參與了SLE 的終末器官損傷，NETs中的成分白細(xì)胞介素-17A(interleukin-17A，IL-17A)參與了纖維化進(jìn)程[8]。HIF-1α和ET-1誘導(dǎo)的REDD1/自噬/NETs 軸可能為SLE-ILD的上游通路，增加NETs生成；與PM-ILD相似，SLE-ILD中很可能也存在DNase活性降低從而使NETs清除受阻。積累的NETs通過TF/凝血酶軸和 IL-17A 參與組織炎癥和纖維化，導(dǎo)致SLE終末器官損傷。

在SLE背景下RNP-IC誘導(dǎo)NETs和mtDNA釋放[12]，一方面導(dǎo)致中性粒細(xì)胞線粒體功能障礙，線粒體來源的ROS增多，激活TGF-β參與ILD形成；另一方面mtDNA釋放至胞外，通過cGAS-STING途徑增加干擾素α(interferon-α , IFN-α)分泌，加重了SLE的組織損傷[33,34]。

3 NETs相關(guān)治療

3.1 重組人DNase

重組人DNase已被批準(zhǔn)用于少數(shù)肺部疾病的治療，但需考慮長期使用的副作用[35]。免疫吸附治療[23]、替代性核酸酶和糖皮質(zhì)激素對于改善DNase1活性有一定的效果[31]。

3.2 ROS清除抑制劑

在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)ROS清除劑可抑制線粒體ROS，降低SLE程度和Ⅰ型IFN反應(yīng)[12, 19]，并改善肺纖維化。

3.3 阻斷ET-1、HIF-1α/REDD1/自噬/NETs通路的藥物

ET-1受體拮抗劑(如波生坦)和 HIF-1α 抑制劑(如 L-抗壞血酸)，自噬抑制劑(如羥氯喹)，針對IL-17A(如蘇金單抗)和 TF/凝血酶軸(如凝血酶抑制劑)的藥物是針對該通路各靶點(diǎn)的潛在有效藥物[8]。

3.4 PAD4抑制劑

PAD4抑制劑可顯著下調(diào)Ⅰ型IFN調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[36]，但同時(shí)可能導(dǎo)致SLE模型中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide oxidase，NOX)來源的ROS減少[18,19]，有加重疾病的風(fēng)險(xiǎn)。

4 總 結(jié)

NETs在SLE-ILD 的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要的作用。SLE炎癥微環(huán)境中的ET-1、HIF-1α/REDD1/自噬軸和RNP-IC分別促進(jìn)了NETs的釋放，同時(shí)DNase1的活性降低使NETs無法有效清除，導(dǎo)致mtDNA的胞外積累、ROS產(chǎn)生、TGF-β1激活，并依賴cGAS/STING/IFN-α途徑和TF/凝血酶途徑參與組織炎癥，依賴IL-17A和其他可能機(jī)制參與纖維化。因此進(jìn)一步探索NETs相關(guān)通路與SLE-ILD的關(guān)系至關(guān)重要，未來需要更多臨床前及臨床研究加以論證。