張 峰綜述 劉 利審校

腦海綿狀血管畸形（cerebral cavernous malformations，CCM）是由桑椹樣擴(kuò)大的不規(guī)則血管形成的，缺乏平滑肌、彈性組織和完整的基底膜，因此血管壁薄，易滲漏[1]。CCM的發(fā)病率約為0.5%，以中樞神經(jīng)系統(tǒng)多見，導(dǎo)致頭疼、中風(fēng)、癲癇發(fā)作和局灶性神經(jīng)功能缺失。CCM 發(fā)病形式包括散發(fā)性CCM（sporadic CCM，SCCM）和家族性CCM（familial CCM，F(xiàn)CCM），其中FCCM 與染色體7q 的CCM1（KRIT1）、染色體7p 的CCM2（OSM）和染色體3q 的CCM3（PDCD10）基因有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，參與CCM 損傷的信號(hào)通路有：MEKK3-Krüppel樣因子（Krüppellike factor，KLF）2/4、RhoA/ROCK、內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT）、血小板反應(yīng)蛋白1（thrombospondin 1，TSP1）丟失、促炎狀態(tài)、氧化應(yīng)激和自噬[2，3]。本文主要介紹KLF2、KLF4在CCM信號(hào)通路中所起的作用。

1 KLF2、KLF4結(jié)構(gòu)和功能

KLF家族是真核生物體內(nèi)一類結(jié)構(gòu)高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，其C-末端有3個(gè)連續(xù)高度保守的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域，通過(guò)結(jié)合靶基因啟動(dòng)子GC 富含序列，調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)；其N-末端屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域，高度變異，通過(guò)結(jié)合特異蛋白質(zhì)，介導(dǎo)多種因子的轉(zhuǎn)錄。KLF4在人體內(nèi)表達(dá)廣泛，主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，其特征是：因作用靶基因的不同，具有轉(zhuǎn)錄活化或轉(zhuǎn)錄抑制的雙重調(diào)節(jié)作用。KLF4 通過(guò)對(duì)其下游靶基因的調(diào)控，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及血管生成和腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4]。KLF2可受血流切應(yīng)力的誘導(dǎo)，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞多種功能基因的表達(dá)，參與調(diào)節(jié)炎癥、凝血、血管舒縮和血管生成等多種過(guò)程[5]。KLF2和KLF4之間有許多共同的靶點(diǎn)，但它們對(duì)共同調(diào)控的啟動(dòng)子在親和力方面存在個(gè)體差異，因而表現(xiàn)出特異性。Zhou 等[6]發(fā)現(xiàn)，CCM 小鼠模型的早期形成與KLF2、KLF4的過(guò)度表達(dá)和Rho/ROCK活性的增加有關(guān)。當(dāng)CCM 蛋白缺陷后，激活MEKK3-MEK5-ERK5-MEF2 信號(hào)軸，使轉(zhuǎn)錄因子KLF2、KLF4 表達(dá)增加[7]，KLF2 可進(jìn)一步激活下游RhoA/ROCK信號(hào)通路，而KLF4則激活其下游的EndMT信號(hào)通路[8]，KLF2 與KLF4 二者也可共同作用于TSP1，使其表達(dá)減少，從而促進(jìn)CCM的發(fā)展及其出血性演變[9]。目前認(rèn)為，KLF2、KLF4 是CCM 早期發(fā)展和進(jìn)展的關(guān)鍵，可以作為CCM發(fā)病機(jī)制的研究重點(diǎn)。

2 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

2.1 KLF2/4 與MEKK3-MEK5-ERK5-MEF2 信 號(hào) 軸有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路表達(dá)于所有真核生物內(nèi)，是將細(xì)胞上接收的刺激信號(hào)傳遞到相應(yīng)蛋白所必需的信號(hào)通路。因此，MAPK通路在細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、分化、生長(zhǎng)和增殖等過(guò)程中起著非常重要的作用。MAPK 激酶激酶3（MAPK kinase kinase 3，MEKK3）是MAPK 信號(hào)通路中重要的節(jié)點(diǎn)，通過(guò)磷酸化激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶激酶5（Mitogen/extracellular signal-regulated kinase kinase 5，MEK5），進(jìn)一步激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶5（extracellular signal-regulated protein kinase 5，ERK5）從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。Maddaluno 等[7]發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)三種CCM蛋白相互作用形成的蛋白質(zhì)復(fù)合物（CCM signaling complex，CSC）是MEKK3 級(jí)聯(lián)反應(yīng)的抑制因子。當(dāng)CSC 蛋白缺陷后，會(huì)激活MEKK3，激活MEKK3-MEK5-ERK5信號(hào)途徑。磷酸化ERK5可以通過(guò)調(diào)節(jié)肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A、2C的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)一步促進(jìn)KLF2、KLF4的表達(dá)[8，9]。Cuttano等[10]發(fā)現(xiàn)，敲除KLF4基因表達(dá)可顯著降低CCM1小鼠病死率，并適度改善血管病變。

2.2 TLR4、CDC42 與MEKK3-KLF2/4 Toll 樣受體4（toll like receptors 4，TLR4）可識(shí)別病原微生物細(xì)胞壁上的保守成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）。LPS作為Ⅰ型急性期反應(yīng)蛋白可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生炎癥免疫反應(yīng)。TLR4也是一種保守的Ⅰ型跨膜蛋白，可以將細(xì)胞外刺激傳遞到細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與多種疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程。Tang 等[11]在CCM1 小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)革蘭氏陰性細(xì)菌膿腫，會(huì)顯著增加CCM病變表型的嚴(yán)重程度，提示TLR4可能是MEKK3 的上游靶點(diǎn)。當(dāng)革蘭氏陰性細(xì)菌產(chǎn)生LPS 后，可被TLR4 蛋白識(shí)別，進(jìn)一步通過(guò)TLR4-MEKK3-KLF2/4信號(hào)途徑來(lái)加速CCM的形成。

細(xì)胞分裂周期蛋白42（cell division cycle 42，CDC42）是Ras 超家族GTP 酶中的核心成員，位于細(xì)胞質(zhì)，包含191個(gè)氨基酸，主要參與調(diào)解細(xì)胞骨架中肌動(dòng)蛋白重排與調(diào)控蛋白激酶，并通過(guò)在與GTP 結(jié)合/活化狀態(tài)和與GDP 結(jié)合/失活狀態(tài)之間循環(huán)切換，從而在復(fù)雜的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中起到開關(guān)作用。當(dāng)CDC42 功能喪失后，會(huì)損害腦內(nèi)皮細(xì)胞的發(fā)芽、分支形態(tài)發(fā)生、軸向極性以及其在腦組織中的正常分布。Castro等[12]發(fā)現(xiàn)，CDC42也參與CSC之間的相互作用并形成復(fù)合物，當(dāng)腦內(nèi)皮細(xì)胞CDC42 缺失后，也通過(guò)激活MEKK3-MEK5-ERK5 信號(hào)通路，進(jìn)而導(dǎo)致KLF2、KLF4的過(guò)表達(dá)，誘導(dǎo)CCM的形成。

2.3 KLF2 與RhoA/ROCK 信 號(hào) 通 路RhoA 是 一 種 小的GTP 結(jié)合蛋白，具有高度保守的GDP/GTP 結(jié)合區(qū)、GTP酶活性區(qū)、靶區(qū)和膜定位結(jié)構(gòu)。作為一種分子開關(guān)，RhoA 的主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞生長(zhǎng)和基因表達(dá)，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著重要的作用。RhoA 的功能主要是通過(guò)ROCK實(shí)現(xiàn)的，ROCK有ROCK1和ROCK2兩種異構(gòu)體，在激酶結(jié)構(gòu)域的水平上有65%的總體同源性和92%的相似性。Richardson等[13]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)體內(nèi)出現(xiàn)任何一種CCM蛋白缺陷，都會(huì)激活MEKK3-KLF2-RhoA-ROCK1/2-pMLC 信號(hào)通路，最終導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白應(yīng)激纖維的增加、細(xì)胞黏附性的降低以及血管通透性增加；當(dāng)抑制KLF2 表達(dá)時(shí)，CCM1 小鼠模型中病變表現(xiàn)出99%的恢復(fù)，且組織學(xué)上只有少量的小靜脈擴(kuò)張。

2.4 KLF4 與EndMT EndMT 被認(rèn)為是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）的一種亞型，是指內(nèi)皮細(xì)胞失去其自身特性而獲得間質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞樣特性的表型轉(zhuǎn)變過(guò)程。EndMT的特點(diǎn)是細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)的改變、細(xì)胞極性喪失，細(xì)胞增殖或遷移增加，最終導(dǎo)致血管生成增加，并可在炎性微環(huán)境下形成桑椹狀[14]。在正常人體內(nèi)，CSC可通過(guò)抑制小GTP酶RAS相關(guān)蛋白1的效應(yīng)器來(lái)控制內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能。在CCM蛋白缺陷的情況下，腦內(nèi)皮細(xì)胞間粘附連接減少，可誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)歷EndMT 形成CCM。EndMT 主要是由內(nèi)源性骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）6 上調(diào)介導(dǎo)的，可激活EndMT 發(fā)生有關(guān)的BMP 和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號(hào)通路[7]。Zhang 等[15]發(fā)現(xiàn)，KLF4 是CCM 蛋白缺陷后產(chǎn)生End-MT 的關(guān)鍵。BMP6 作為KLF4 的靶基因，KLF4 可以通過(guò)誘導(dǎo)BMP6 啟動(dòng)子的活性，從而誘發(fā)EndMT 的形成。研究報(bào)道，KLF4除誘導(dǎo)BMP6外，還可以直接通過(guò)與某些EndMT 標(biāo)志物啟動(dòng)子的結(jié)合來(lái)誘導(dǎo)EndMT 的產(chǎn)生，如干細(xì)胞抗原1（stem cell antigen 1，SCA1）和成纖維細(xì)胞特異性蛋白（fibroblast-specific protein 1，F(xiàn)SP1）。同時(shí)，在CCM1 小鼠模型中，KLF4基因敲除既會(huì)顯著降低EndMT典型標(biāo)志物（DNA結(jié)合抑制因子1、FPS1、SCA1）中mRNA與蛋白水平，又會(huì)導(dǎo)致與EndMT發(fā)生有關(guān)的BMP6被強(qiáng)烈抑制。

2.5 KLF2/4 與TSP1 TSP1 是一種細(xì)胞基質(zhì)糖蛋白，可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、黏附和凋亡，來(lái)維持細(xì)胞平衡；同時(shí)，TSP1 也是最有效和最具特征性的內(nèi)源性血管生成抑制劑之一，在血管生成過(guò)程中表達(dá)上調(diào)，通過(guò)抑制體內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)來(lái)抑制血管生成，從而限制血管密度。Lopez-Ramirez 等[8]發(fā)現(xiàn)，CCM 蛋白缺失后會(huì)引起KLF2 和KLF4 的過(guò)表達(dá)，從而導(dǎo)致其下游TSP1 的表達(dá)被抑制。TSP1 可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）降解，從而抑制VEGFR2 信號(hào)通路。當(dāng)TSP1 表達(dá)減少時(shí)，會(huì)增強(qiáng)VEGFR2 信號(hào)通路，從而導(dǎo)致CCM 的發(fā)生。VEGFR2 也與內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂和血管生成密切相關(guān)。當(dāng)VEGFR2活化后，可增加參與內(nèi)皮細(xì)胞滲漏、應(yīng)力纖維形成和血管生成密切相關(guān)的血管內(nèi)皮鈣粘蛋白和Beta連環(huán)蛋白磷酸化和遷移，從而誘發(fā)CCM病變形成[16]。Lopez-Ramirez 等[8]在用KLF2、KLF4來(lái)抑制TSP1表達(dá)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)誘導(dǎo)人內(nèi)皮細(xì)胞異位表達(dá)KLF2 和KLF4 后，TSP1 表達(dá)水平與CCM1 沉默后的水平相似；并發(fā)現(xiàn)KLF2 和KLF4 的過(guò)表達(dá)也可以導(dǎo)致TSP1 mRNA表達(dá)水平下降。

綜上所述，KLF2、KLF4 被MEKK3-KLF2/4 信號(hào)通路激活后，在EndMT、RhoA/ROCK 信號(hào)通路以及TSP1 表達(dá)中起到重要的橋梁作用（圖1），是CCM 發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。在CCM小鼠模型中，KLF2、KLF4基因失活可大大減少CCM 病變的形成，因此，KLF2、KLF4 可作為未來(lái)CCM 發(fā)病機(jī)制信號(hào)通路的研究重點(diǎn)。KLF2、KLF4作為新的藥物治療靶點(diǎn)，也可為不可觸及的病變提供新的治療方案，如腦干CCM、多發(fā)性CCM或位于功能區(qū)的病變。

圖1 CCM 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中與KLF2/4 有關(guān)信號(hào)通路圖