劉建成

寧夏回族自治區(qū)血液中心血型參比實(shí)驗(yàn)室,寧夏銀川 750011

ABO血型是發(fā)現(xiàn)和確定的人類第一個(gè)血型系統(tǒng)，其抗原性和免疫原性最強(qiáng)，能夠引起嚴(yán)重的溶血性輸血反應(yīng)、新生兒溶血癥等疾病。目前，通常采用免疫血清學(xué)方法來鑒定ABO血型，但在實(shí)際工作中經(jīng)常會(huì)遇到正反定型不相符或者凝集反應(yīng)較弱的情況，這是因?yàn)槌苏５腁BO血型之外還存在一些ABO亞型[1-2]。正確地鑒定ABO血型至關(guān)重要，B(A)亞型便是一種較為稀有的亞型，在血型鑒定時(shí)除了免疫血清學(xué)方法之外還需要通過基因分型的方法才能正確鑒定其血型，它在我國(guó)北方的獻(xiàn)血者中頻率為1/(5～10)萬(wàn)[3]。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 先證者來自于健康的獻(xiàn)血者，符合獻(xiàn)血標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)過知情同意隨后采集了先證者父親和母親的血液標(biāo)本。

1.2試劑與儀器 正定型抗-A、抗-B，反定型A細(xì)胞、B細(xì)胞(上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司)；ABO血型基因分型試劑盒(天津秀鵬公司)；全血基因組DNA提取試劑盒(天根生物公司)；DNA 聚合酶(大連TaKaRa)；測(cè)序引物(上海生工公司合成)以上所有試劑均在有效期內(nèi)；PCR擴(kuò)增儀(ABI Veriti DX)；凝膠成像儀(SYNGENE G:BOX)；Nanodrop One超微量分光光度計(jì)(基因有限公司)；3730測(cè)序儀(美國(guó)ABI公司)。

1.3免疫血清學(xué)方法 ABO正反定型檢測(cè)按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》和參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行。

1.4基因分型方法

1.4.1全血基因組DNA提取 按照試劑盒說明書操作，DNA濃度和純度經(jīng)超微量分光光度計(jì)測(cè)定，最終濃度稀釋為50 ng/μL。

1.4.2PCR-SSP檢測(cè) 按照天津秀鵬PCR-SSP擴(kuò)增說明書進(jìn)行操作，擴(kuò)增程序見表1。內(nèi)參質(zhì)控為人類生長(zhǎng)激素基因的保守片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析。

表1 PCR-SSP程序

1.4.3ABO基因測(cè)序 擴(kuò)增ABO基因第6、7外顯子進(jìn)行測(cè)序。反應(yīng)體系為30 μL，其中DNA模板3 μL，Taq酶(10 mmol/L)0.3 μL，10×緩沖液3 μL，dNTP(10 mmol/L)4 μL，測(cè)序引物(10 μmol/L)3 μL，ddH2O 16.7 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序見表2，上下游引物序列見表3，PCR產(chǎn)物純化后直接進(jìn)行測(cè)序。

表2 第6、7外顯子 PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序

表3 第6、7外顯子擴(kuò)增引物序列

1.4.4序列分析 利用軟件DNAMAN分析測(cè)序結(jié)果，與GenBank中的序列進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié) 果

2.1血型血清學(xué)結(jié)果 先證者血型呈現(xiàn)正反定型不一致，正定型與抗-A和抗-B均有凝集，抗-A為弱凝集1+，與抗-H反應(yīng)強(qiáng)凝集。反定型只與A細(xì)胞呈現(xiàn)凝集，血清學(xué)表型為AwB。先證者和家系成員血型反應(yīng)格局結(jié)果見表4。

表4 先證者及家系成員ABO血型反應(yīng)格局

2.2ABO血型基因分型結(jié)果 通過PCR-SSP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)先證者基因型為B/O，先證者父親基因型為A/O，先證者母親基因型為B/O。結(jié)合血型血清學(xué)結(jié)果先證者父親基因型和血清學(xué)結(jié)果一致為正常的A型。先證者和其母親的基因型和血清學(xué)結(jié)果不一致，進(jìn)一步通過測(cè)序發(fā)現(xiàn)先證者和母親的B基因均發(fā)生了700C>G點(diǎn)突變，與GenBank中的序列進(jìn)行比對(duì)，參照紅細(xì)胞抗原突變數(shù)據(jù)庫(kù)ABO等位基因的命名，先證者和母親ABO等位基因?yàn)锽(A)02，為雜合子。

3 討 論

截至目前，共發(fā)現(xiàn) 43個(gè)血型系統(tǒng)，400多個(gè)抗原[5-6]。ABO血型一般指A、B、O、AB 4種血型。ABO亞型是在這4種血型基礎(chǔ)上進(jìn)一步細(xì)分而命名的血型，具有遺傳基礎(chǔ)和免疫血清學(xué)特點(diǎn)，由于疾病等無法遺傳的原因?qū)е碌难透淖儾荒芊Q為亞型，有些雖然基因發(fā)生改變但是不影響免疫血清學(xué)特點(diǎn)的血型也不是亞型[7-8]。至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有60多種A亞型和30多種B亞型，A亞型有A1、A2、A3、Ax等，B亞型比A亞型少見，有B2、B3、Bx、B(A)等[9]。 ABO亞型抗原的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)以及數(shù)量與正常的ABO血型抗原存在一定差異，主要是由于基因突變、糖基轉(zhuǎn)移酶的活性、底物等原因造成的[10-11]。

B(A)亞型在ABO亞型中發(fā)生率非常低，在基因水平上被認(rèn)為是B型，在細(xì)胞水平上表達(dá)了正常的B抗原和較弱的A抗原[12]。B(A)亞型的血清學(xué)特點(diǎn)是正定型紅細(xì)胞與抗-B和抗-H凝集強(qiáng)度較強(qiáng)，與抗-A凝集較弱或者不凝集，反定型血清中含有較強(qiáng)的抗-A抗體[13-14]。本文中先證者和其母親的免疫血清學(xué)結(jié)果初步判定為AwB亞型，經(jīng)基因分型鑒定為B(A)亞型。1985年，B(A)亞型最早被發(fā)現(xiàn)，有學(xué)者闡釋了B(A)亞型的發(fā)生機(jī)制，發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)能夠編碼正常的B糖基轉(zhuǎn)移酶且該酶同時(shí)具有A糖基轉(zhuǎn)移酶的活性的等位基因，命名為B(A)01[15]。至今，共發(fā)現(xiàn)6種B(A)等位基因，分別為B(A)01、B(A)02、B(A)03、B(A)04、B(A)05、B(A)06[15]。與常見的B101基因序列相比，B(A)等位基因存在1～2個(gè)堿基的點(diǎn)突變，這些突變影響了編碼B糖基轉(zhuǎn)移酶的3個(gè)氨基酸的翻譯，導(dǎo)致B糖基轉(zhuǎn)移酶同時(shí)具有了A糖基轉(zhuǎn)移酶的活性。在我國(guó)，最常見的等位基因是B(A)02和B(A)04[16]。本文中先證者和其母親的B(A)亞型表型是由B(A)02等位基因引起的，與通常的B101基因堿基序列比對(duì)，B(A)02等位基因發(fā)生了一個(gè)nt700C>G 點(diǎn)突變，導(dǎo)致編碼翻譯的α-1,3-半乳糖轉(zhuǎn)移酶除了能夠合成B抗原之外還能合成少量的A抗原。先證者的父親為正常的A型，母親為B(A)亞型，說明先證者的B(A)02等位基因遺傳于其母親。

在鑒定ABO血型的時(shí)候，由于免疫血清學(xué)的局限性，ABO亞型的鑒定存在一定的困難，非常容易將B(A)亞型誤判為AwB型，對(duì)輸血造成了一定的風(fēng)險(xiǎn)，所以發(fā)現(xiàn)ABO血型正反不符時(shí)可以進(jìn)一步利用基因分型的方法準(zhǔn)確鑒定血型，保證安全、有效地輸血治療。B(A)亞型的獻(xiàn)血者可以加入稀有血型庫(kù)進(jìn)行保留，捐獻(xiàn)的血液可以制備成冰凍紅細(xì)胞進(jìn)行保存。若患者為B(A)亞型需要輸血時(shí)，很難找到同型血液，可以輸注O型或B型洗滌紅細(xì)胞，也可以采取自體輸血進(jìn)行治療。