黎 兵，何 維，向加林，楊 艷，楊小理△

1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，貴州遵義 563000；2.遵義醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，貴州遵義 563000

原發(fā)性肝癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，每年新確診的肝癌病例數(shù)位居惡性腫瘤第6位[1]。在我國(guó)，肝癌患者的5年生存率僅為14.1%[1]，是僅次于胰腺癌的第2大致死癌癥。盡管近年來肝癌的治療取得了很大進(jìn)展，但其治療的選擇和臨床結(jié)局仍很有限。由于肝癌在遺傳、代謝、分子機(jī)制及臨床癥狀方面存在極大的異質(zhì)性，使得其早期診斷和癌基因靶向治療的設(shè)計(jì)極具挑戰(zhàn)性。一些研究試圖闡明肝癌細(xì)胞產(chǎn)生和存活的潛在機(jī)制，因?yàn)檫@些研究可以為肝癌的治療提供新的干預(yù)措施或靶點(diǎn)。細(xì)胞生存和死亡之間的平衡對(duì)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，其中自噬起重要作用[2]。自噬是一個(gè)高度保守的分解代謝過程，它可以循環(huán)利用胞內(nèi)成分來保護(hù)細(xì)胞，同時(shí)也可以在一定條件下殺死細(xì)胞[3]。研究表明，自噬在肝癌的發(fā)生和進(jìn)展中可能發(fā)揮雙刃劍的作用，靶向自噬或與其他化療藥物聯(lián)合阻斷自噬可能是治療肝癌的潛在策略[4]。

LAG1長(zhǎng)壽保證基因2(LASS2)，又被稱為腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因1(TMSG-1)、神經(jīng)酰胺合酶2(CERS2)，在肝癌[5]、乳腺癌[6]、膀胱癌[7]等惡性腫瘤的浸潤(rùn)和生長(zhǎng)發(fā)揮抑癌作用。LASS2能通過促進(jìn)神經(jīng)酰胺的合成誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞保護(hù)性自噬[8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)LASS2過表達(dá)增加了HepG2胞內(nèi)活性氧(ROS)[9]，最新的研究表明ROS可作為第二信使直接參與細(xì)胞存活的調(diào)節(jié)，并能誘導(dǎo)自噬的發(fā)生[10]。然而LASS2過表達(dá)是否激活HepG2肝癌細(xì)胞的自噬并影響其存活，目前未見相關(guān)報(bào)道。本研究以HepG2肝癌細(xì)胞株為研究模型，檢測(cè)LASS2過表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞自噬、凋亡的影響及探討其可能的信號(hào)通路。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器 HepG2購自中科院上海細(xì)胞庫；Adv-GFP、Adv-LASS2-GFP重組腺病毒由北京百奧川生物科技有限責(zé)任公司合成；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)α、p-AMPKα、Raptor、p-Raptor、Beclin-1、LC3A/B一抗購自CST公司；GAPDH、SQSTM1、BCL2、Bax一抗購自華安生物技術(shù)有限公司；Trizol(總RNA抽取試劑盒)、實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)試劑購自TAKARA寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；全蛋白提取試劑盒購自凱基生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自上海雅酶生物科技公司；LASS2抗體購自Abcam公司；Annexin Ⅴ-APC/7AAD凋亡檢測(cè)試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；FACSA Ⅱ流式細(xì)胞儀(FACS Calibur型，BD公司)；Chemi-DocTM凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 HepG2肝癌細(xì)胞采用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基、置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將HepG2細(xì)胞分為3組：空白對(duì)照組(n=3)、空載組(n=3，重組腺病毒Adv-GFP感染細(xì)胞)和實(shí)驗(yàn)組(n=3，重組腺病毒Adv-LASS2-GFP感染細(xì)胞)，轉(zhuǎn)染48 h后根據(jù)各實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行收集樣品。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2qRT-PCR檢測(cè)LASS2 mRNA表達(dá)情況 感染48 h后，提取各組細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度與純度，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中待用。以β-actin作為內(nèi)參，qRT-PCR檢測(cè)分析LASS2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平(反應(yīng)條件：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s；60 ℃、34 s，40個(gè)循環(huán)；融解曲線：95 ℃、15 s；60 ℃、60 s；95 ℃、15 s)，以2-ΔΔCt計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。目的基因引物序列：β-actin上游5′-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3′，下游5′-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3′；LASS2上游5′-ATCGTCTTCGCCATTGTT-3′，下游5′-CGGTCACTGCGTTCATCT-3′。

1.2.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 將呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HepG2細(xì)胞接種至96孔板中，次日感染Adv-GFP、Adv-LASS2-GFP，分別在感染0、24、48、72 h，加入100 μL DMEM以及10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h后，于酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定各吸光度(A)值并制作生長(zhǎng)曲線。

1.2.4Annexin V-APC/7 AAD雙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 感染48 h后，采用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化并收集各組HepG2細(xì)胞，嚴(yán)格按試劑說明書操作，用冷PBS洗滌2次，收集細(xì)胞、加入500 μL的Binding Buffer重懸細(xì)胞，依次添加5 μL Annexin V-APC和5 μL 7-AAD，充分混勻并在室溫下避光孵育15 min后，置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)并采用Cell Quest軟件分析各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.5Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞LASS2、自噬、凋亡相關(guān)蛋白及AMPKα/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mTORC1)信號(hào)通路相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染48 h后，按照全蛋白提取試劑盒說明書提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法定量蛋白濃度，經(jīng)蛋白變性、分裝并暫存于-80 ℃。每個(gè)泳道上樣量為20 μg，10%或12.5%SDS-PAGE分離各組細(xì)胞蛋白并電轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂牛奶在室溫下封閉2 h，4 ℃一抗(參照各一抗廠家推薦稀釋比)孵育過夜。二抗(羊抗鼠、羊抗兔二抗稀釋倍數(shù)均為1:5 000)室溫孵育2 h，洗膜、成像，測(cè)量條帶灰度值并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，計(jì)算LASS2、BCL2、Bax、SQSTM1、Beclin-1、LC3A/B、t-AMPKα、p-AMPKα、t-Raptor、p-Raptor蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1LASS2在HepG2肝癌細(xì)胞過表達(dá)的驗(yàn)證 實(shí)驗(yàn)組LASS2 mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)水平較空白對(duì)照組、空載組明顯上調(diào)(P<0.001)，LASS2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平較空白對(duì)照組上調(diào)51.6倍，其蛋白表達(dá)水平上調(diào)40倍，而空白對(duì)照組和空載組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2過表達(dá)LASS2對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用 與空白對(duì)照組、空載組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力在24 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而48 h、72 h的細(xì)胞活力分別為空白對(duì)照組的(57.6±3.0)%和(23.8±0.3)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；空白對(duì)照組和空載組細(xì)胞活力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這表明過表達(dá)LASS2抑制了HepG2肝癌細(xì)胞增殖的，見圖1。

注：與對(duì)照組及空載組比較，***P<0.001。

2.3過表達(dá)LASS2對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞凋亡的影響 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001),空白對(duì)照組和空載組未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HepG2各組細(xì)胞的凋亡率

2.4過表達(dá)LASS2對(duì)HepG2細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的影響 與空白對(duì)照組、空載組相比，實(shí)驗(yàn)組凋亡相關(guān)蛋白BCL2相對(duì)表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.001)，同時(shí)Bax蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.001)，空白對(duì)照組與空載組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這表明過表達(dá)的LASS2促進(jìn)HepG2肝癌細(xì)胞凋亡，見圖2。

注：與空白對(duì)照組及空載組比較，***P<0.001；NS表示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5過表達(dá) LASS2對(duì)HepG2細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3A/B 、SQSTM1的影響 與空白對(duì)照組、空載組相比，實(shí)驗(yàn)組SQSTM1蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯較低(P<0.001)，而Beclin-1、LC3A/B蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào)(P<0.001)；空白對(duì)照組和空載組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

注：與空白對(duì)照組及空載組比較，***P<0.001；NS表示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6LASS2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬和凋亡與AMPKα/mTORC1信號(hào)通路的關(guān)系 與空白對(duì)照組、空載組相比，實(shí)驗(yàn)組p-AMPKα/t-AMPKα的比值和p-Raptor/t-Raptor比值均明顯上調(diào)(P<0.001)，空白對(duì)照組和空載組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

注：與空白對(duì)照組及空載組比較，***P<0.001；NS表示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

多數(shù)研究認(rèn)為L(zhǎng)ASS2是一個(gè)抑癌基因，在腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移起抑制作用并可促其凋亡。SU等[11]研究提出TMSG1/LASS2可能通過caspase依賴的線粒體途徑抑制HEK293和293T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，LASS2過表達(dá)可促HepG2肝癌細(xì)胞、Hepa1-6肝癌細(xì)胞ROS生成增多[9,12]。然而，內(nèi)源性ROS主要在線粒體或由還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶產(chǎn)生，線粒體是否存在LASS2的作用靶點(diǎn)本課題組對(duì)此進(jìn)行了深入研究，并率先揭示LASS2可能與線粒體復(fù)合物Ⅰ活性主要調(diào)節(jié)因子——NDUFS2相互作用介導(dǎo)了線粒體活性氧(mtROS)的生成[12]。而mtROS的積累可使線粒體膜通道開放并影響線粒體的功能，研究認(rèn)為線粒體功能的嚴(yán)重?fù)p害可引起自噬、凋亡[13]。

在本課題前期研究中證實(shí)了LASS2過表達(dá)使HepG2肝癌細(xì)胞線粒體膜電位下降，且胞內(nèi)Ca2+超載，線粒體功能受損，但是否激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路和自噬需進(jìn)一步研究證實(shí)。在本研究中，流式細(xì)胞術(shù)分析及Western blot結(jié)果表明，過表達(dá)的LASS2顯著促進(jìn)HepG2肝癌細(xì)胞凋亡并上調(diào)其Bax蛋白、降低BCL2蛋白的表達(dá)，提示LASS2通過調(diào)控線粒體相關(guān)內(nèi)源性凋亡途徑介導(dǎo)肝癌細(xì)胞程序性死亡。有研究表明，下調(diào)LASS2導(dǎo)致神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SMS-KCNR細(xì)胞發(fā)生自噬和未折疊蛋白反應(yīng)[14]。不同的是，在關(guān)于心肌細(xì)胞損傷的研究中，LASS2的過度表達(dá)導(dǎo)致VLC神經(jīng)酰胺升高，導(dǎo)致胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙和線粒體自噬[15]。然而，自噬在癌癥中的作用仍不清楚，因?yàn)樗梢宰鳛槟[瘤的啟動(dòng)子或抑制劑。QU等[16]研究發(fā)現(xiàn)Beclin-1雜合子小鼠和肝臟特異性Atg5 KO小鼠在衰老時(shí)發(fā)生自發(fā)性肝腫瘤，提供了支持自噬在肝腫瘤中抑制作用的證據(jù)。本研究結(jié)果提示：LASS2過表達(dá)促使HepG2肝癌細(xì)胞中Beclin-1、LC3A/B蛋白相對(duì)表達(dá)水平增加，自噬底物蛋白SQSTM1表達(dá)降低，激活HepG2肝癌細(xì)胞自噬。這與LAW等[15]研究報(bào)道相同，與STEFKA等[14]的研究不符，這可能與不同癌癥類型和遺傳背景有關(guān)。越來越多的研究揭示，細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)與自噬誘導(dǎo)之間存在深層聯(lián)系，在每個(gè)過程的不同階段都發(fā)生串?dāng)_[17]，而這種串?dāng)_是癌癥發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)，也是肝癌治療有希望的靶點(diǎn)之一。筆者推測(cè)LASS2促HepG2肝癌細(xì)胞凋亡并激活自噬，兩者相互促進(jìn)癌細(xì)胞程序性死亡，這將為肝癌的臨床前治療選擇提供參考資料。

基于本課題前期研究基礎(chǔ)“LASS2過表達(dá)促ROS生成增加”，本研究進(jìn)一步探討過表達(dá)LASS2激活自噬、凋亡的可能信號(hào)通路。自噬的激活受營(yíng)養(yǎng)/能量傳感器的兩個(gè)關(guān)鍵組成部分AMPK和mTORC1的調(diào)節(jié)。mTORC1是mTOR激酶與mTOR調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白、MLST8、PRAS40和DEPTOR等亞基形成的復(fù)合物，是自噬的主要調(diào)節(jié)因子，還直接調(diào)節(jié)自噬過程的后續(xù)步驟[18]。激活的AMPK也可以通過Raptor磷酸化抑制mTORC1的活性，進(jìn)而啟動(dòng)自噬，且兩者之間存在一個(gè)必不可少的雙重負(fù)反饋機(jī)制，對(duì)自噬的適當(dāng)動(dòng)態(tài)特性至關(guān)重要[19]。本研究結(jié)果表明LASS2過表達(dá)激活A(yù)MPKα，促使Raptor磷酸化抑制mTORC1的活性，結(jié)合本課題前期研究結(jié)果[12]， NDUFS2作為氧感知器及線粒體復(fù)合物I產(chǎn)生ROS的主要靶點(diǎn)之一，LASS2與其互相作用介導(dǎo)了mtROS的生成，而mtROS作為第二信使通過AMPKα亞基直接激活A(yù)MPK及下游級(jí)聯(lián)信號(hào)如mTORC1信號(hào)通路，這可能是LASS2激活HepG2自噬的機(jī)制，這一結(jié)果的發(fā)現(xiàn)是不同于既往研究的。最近的研究表明，AMPK通過刺激不同的細(xì)胞過程，如凋亡、自噬、細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，通過各種信號(hào)分子發(fā)揮腫瘤抑制活性[20]，mTOR(尤其是mTORC1)信號(hào)的過度激活與致癌細(xì)胞過程有關(guān)[18]。因此，本研究推測(cè)AMPKα/mTORC1(Raptor)信號(hào)通路是LASS2激活HepG2肝癌細(xì)胞自噬和凋亡的關(guān)鍵信號(hào)通路，也是LASS2抑制肝癌進(jìn)程的可能機(jī)制，將會(huì)在后續(xù)研究中證實(shí)這一科學(xué)假設(shè)。

綜上所述，LASS2可能通過AMPKα/mTORC1信號(hào)通路誘導(dǎo)HepG2肝癌細(xì)胞自噬和凋亡，但具體作用機(jī)制有待后續(xù)深入研究，這可能為肝癌的治療提供新的理論基礎(chǔ)或新的策略。