王 瓊，趙明君，董 靜，趙 運，陳 凱，馬淑慧，胡子恒△

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，陜西咸陽 712000；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，陜西咸陽 712000)

近幾十年來，心肌梗死(myocardial infarction，MI)仍然是全球主要的死亡原因之一，其發(fā)病率和病死率高居不下[1]。MI缺血會導(dǎo)致心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等發(fā)生細(xì)胞凋亡[2]。若能在MI發(fā)生前或發(fā)生時改善缺血心肌內(nèi)皮細(xì)胞存活，可減輕心臟組織損傷，有利于心臟損傷組織與血管的重建修復(fù)[3]，從而降低病重率與病死率。

炎癥與氧化應(yīng)激失衡在MI過程中起著核心作用，缺血時心肌細(xì)胞活性氧及其代謝產(chǎn)物增多，出現(xiàn)氧化應(yīng)激失衡，從而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生[4]。核因子-κB(NF-κB)通路作為經(jīng)典炎癥通路，與氧化應(yīng)激失衡密切相關(guān)[5]，是研究與開發(fā)MI治療藥物的重要突破口。茯苓為常用中藥之一，具有藥食同源的特性。研究發(fā)現(xiàn)，茯苓的有效藥用成分以多糖為主，具有調(diào)節(jié)機體免疫、抗腫瘤、抗炎、抗氧化等藥理作用[6-7]。目前尚缺少茯苓在MI相關(guān)疾病中作用的研究報道，因此，本研究主要從茯苓多糖的抗氧化與抗炎作用探討其是否能減輕MI導(dǎo)致的組織損傷，為臨床用藥提供實驗基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

雄性SD大鼠40只，無特殊病原體(SPF)級，體重210～230 g，購自成都達碩實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2020-030。

1.1.2儀器與試劑

茯苓多糖(純度≥98%)購自成都埃法生物科技有限公司；異丙腎上腺素(isoproternol，ISO)購自上海禾豐制藥有限公司；白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；磷酸化NF-κB抑制蛋白α(p-IκB-α)、IκB激酶β(IκK-β)、p-P65 NF-κB和β-actin均購自美國Cell Signaling Technology公司。CytationTMC10全自動酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司，XSP-8CA顯微鏡購自上海光學(xué)儀器廠，蛋白質(zhì)電泳儀、多功能凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1實驗分組、給藥與造模[8]

將40只大鼠分為空白組、模型組、茯苓多糖高劑量組、茯苓多糖低劑量組，每組10只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行給藥處理：空白組與模型組給予生理鹽水，茯苓多糖高、低劑量組分別灌胃茯苓多糖水溶液(200、100 mg/kg)，持續(xù)7 d。于第6、7天給藥1 h后造模，除空白組外，其余各組大鼠背部皮下多點注射ISO(85 mg/kg)，以心電圖S-T段升高作為造模成功的標(biāo)志。

1.2.2氯化三苯四氮唑(TTC)染色觀察大鼠MI面積

第7天造模后30 min，進行TTC染色操作：右頸總動脈注射1%依文思藍(lán)溶液2 mL，待觀察到大鼠口唇變藍(lán)時快速取出心肌組織，預(yù)冷生理鹽水清理表面血液與多余的染液，在-20 ℃下冷凍20 min，取出后沿平行房室溝方向進行切片，厚度約2 mm，將薄片在1% TTC溶液中室溫染色20 min，再使用10%甲醛固定24 h，拍照并分析各組大鼠心肌組織壞死區(qū)域。

1.2.3蘇木素-伊紅(HE)染色觀察大鼠心肌組織病理學(xué)變化

收集各組大鼠心肌組織，4%多聚甲醛固定過夜，制備石蠟切片后使用HE染色，觀察大鼠心肌組織病理學(xué)變化情況。

1.2.4熒光TUNEL染色觀察大鼠心肌組織中細(xì)胞凋亡情況

收集各組大鼠心肌組織，放入4%多聚甲醛中固定過夜，制備石蠟切片。使用TUNEL熒光試劑盒染色，觀察心肌組織中細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5分光光度計法檢測大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)超氧化物歧化酶(SOD)活性與丙二醛(MDA)水平

收集各組大鼠腹主動脈血，4 000 r/min離心10 min，按分光光度計檢測試劑盒說明書檢測血清SOD活性、MDA水平。

1.2.6ELISA檢測大鼠血清炎癥因子水平

收集各組大鼠腹主動脈血，4 000 r/min離心10 min，按ELISA試劑盒說明書檢測血清IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α水平。

1.2.7Western blot檢測大鼠心肌組織p-IκB-α、IκK-β及p-P65 NF-κB表達水平

取各組大鼠心肌組織約50 mg，加入組織裂解液制成組織勻漿，12 000 r/min離心10 min，收集上清液，使用BCA試劑盒進行蛋白定量。加入4×上樣緩沖液在97 ℃下金屬浴加熱10 min，按30 μg蛋白上樣量進行凝膠、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，4 ℃過夜孵育一抗，稀釋倍數(shù)為IκB-α(1∶1 000)、IκK-β(1∶1 000)、P65 NF-κB(1∶1 000)、β-actin(1∶1 200)，TBST漂洗3遍后室溫孵育二抗2 h，TBST漂洗3遍后進行電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒顯影，在凝膠成像系統(tǒng)中對條帶進行曝光分析拍照，以β-actin作為蛋白內(nèi)參計算蛋白相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 茯苓多糖對MI大鼠心肌組織梗死面積的影響

TTC染色結(jié)果顯示，空白組、模型組、茯苓多糖高劑量組、茯苓多糖低劑量組大鼠MI面積比例分別為0、(14.00±1.47)%、(3.56±1.43)%、(9.32±1.46)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=72.39，P<0.05)。與空白組相比，模型組大鼠MI面積比例增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，茯苓多糖高、低劑量組大鼠MI面積比例均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

圖1 各組大鼠MI面積比例觀察(TTC染色)

2.2 茯苓多糖對MI大鼠心肌組織的病理學(xué)改變

空白組大鼠心外膜結(jié)構(gòu)完整清晰，中膜層心肌纖維呈螺旋狀排列，多集合成束，肌束間有較多結(jié)締組織和豐富的血管；心肌纖維形態(tài)正常，細(xì)胞質(zhì)染色均勻，結(jié)構(gòu)清晰；間質(zhì)內(nèi)無炎癥細(xì)胞浸潤及纖維結(jié)締組織增生；心內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞完好。模型組大鼠心肌層內(nèi)大量心肌纖維組織呈片狀變性壞死，伴炎癥細(xì)胞浸潤，見心肌纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)模糊，染色變淺，壞死細(xì)胞的細(xì)胞核深染，不規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)溶解甚至消失，壞死區(qū)域內(nèi)可見淋巴細(xì)胞或中性粒細(xì)胞聚集。茯苓多糖高劑量組大鼠心肌纖維排列較為整齊，形態(tài)較為正常，染色較為均勻，局部區(qū)域可見少量心肌纖維變性壞死，形態(tài)結(jié)構(gòu)模糊。茯苓多糖低劑量組大鼠局部心肌層內(nèi)心肌纖維灶狀壞死較為明顯，壞死心肌細(xì)胞的細(xì)胞核深染、固縮，細(xì)胞質(zhì)溶解甚至基本消失。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織病理學(xué)觀察情況(HE染色，400×)

2.3 茯苓多糖對MI大鼠心肌中細(xì)胞凋亡的影響

空白組、模型組、茯苓多糖高劑量組、茯苓多糖低劑量組大鼠心肌組織中細(xì)胞凋亡率分別為0、(35.69±5.62)%、(6.92±2.43)%、(16.37±4.13)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=52.75，P<0.05)。與空白組相比，模型組大鼠心肌組織中細(xì)胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，茯苓多糖高、低劑量組大鼠心肌組織中細(xì)胞凋亡率均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

圖3 各組大鼠心肌組織中細(xì)胞凋亡情況(TUNEL熒光染色，400×)

2.4 茯苓多糖對MI大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

與空白組相比，模型組大鼠血清SOD活性降低，MDA水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，茯苓多糖高劑量組大鼠血清SOD活性升高(P=0.02 8)，MDA水平降低(P=0.03 0)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，低劑量組指標(biāo)變化與高劑量組一致，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血清SOD活性與MDA水平比較

2.5 茯苓多糖對MI大鼠血清炎癥因子水平的影響

與空白組相比，模型組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高，IL-10水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，茯苓多糖高劑量組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低，IL-10水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.034、0.024、0.034、0.019)，低劑量組指標(biāo)變化與高劑量組一致，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較

2.6 茯苓多糖對MI大鼠心肌組織中IκK-β/IκB-α/NF-κB通路的影響

與空白組相比，模型組大鼠心肌組織中p-IκB-α、IκK-β及p-P65 NF-κB相對表達水平均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，茯苓多糖高、低劑量組大鼠心肌組織中p-IκB-α、IκK-β、p-P65 NF-κB相對表達水平均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表3、圖4。

表3 各組大鼠心肌組織中p-IκB-α、IκK-β及p-P65 NF-κB相對表達水平比較

續(xù)表3 各組大鼠心肌組織中p-IκB-α、IκK-β及p-P65 NF-κB相對表達水平比較

1：空白組；2：模型組；3：茯苓多糖高劑量組；4：茯苓多糖低劑量組。

3 討 論

MI是指流向心臟的血液減少或停止，從而引起的心肌細(xì)胞缺氧或壞死，最終導(dǎo)致心肌損傷的一種損傷類型。心肌細(xì)胞凋亡主要發(fā)生在梗死組織周圍區(qū)域。有研究發(fā)現(xiàn)，在MI小鼠中，心臟組織再生能力與速度有限，抑制心肌細(xì)胞凋亡可改善心臟功能并減少心肌組織梗死面積[9]。目前抗心肌細(xì)胞凋亡的治療手段還處于探索階段，其中新興的細(xì)胞療法對改善MI似乎沒有明顯的臨床效益[10]。中藥多糖普遍具有毒性小、作用靶點多的優(yōu)點，而茯苓多糖的抗炎、抗氧化作用突出，具有減少細(xì)胞凋亡的潛力。在本實驗中，經(jīng)過茯苓多糖預(yù)處理的大鼠在發(fā)生MI后，因心肌組織缺氧導(dǎo)致的壞死面積有效減少，心肌細(xì)胞凋亡減少，保全了組織功能，表明茯苓多糖對MI大鼠有保護作用。

造成機體氧化應(yīng)激失衡的原因很多，活性氧(ROS)過度分泌為其中一種。蛋白質(zhì)作為細(xì)胞膜的主要成分，是最先受到ROS損傷的分子之一，高水平的ROS最終導(dǎo)致細(xì)胞因脂質(zhì)過氧化而壞死。有研究發(fā)現(xiàn)，在ISO所致大鼠急性MI模型中檢測到氧化應(yīng)激失衡情況[11]。氧化應(yīng)激失衡過程中，內(nèi)源性抗氧化劑如SOD活性明顯降低，堆積的脂質(zhì)過氧化物導(dǎo)致MDA水平增加，從而促進氧自由基的產(chǎn)生，抑制內(nèi)源性抗氧化狀態(tài)[12]。在本研究中，茯苓多糖預(yù)處理后增強了大鼠心肌組織的抗氧化能力，使機體在面對MI時未出現(xiàn)嚴(yán)重的氧化應(yīng)激失衡，通過增強SOD活性與降低MDA水平抑制了心肌細(xì)胞凋亡與組織壞死。

炎癥反應(yīng)也是MI造成心肌損傷的主要原因之一。MI后心肌組織中的炎癥因子和趨化因子水平迅速升高，進一步加劇炎癥反應(yīng)、MI、心室重塑等導(dǎo)致的心功能障礙[13]。有證據(jù)表明體內(nèi)注射ISO后，在MI區(qū)域發(fā)現(xiàn)了多種細(xì)胞因子，說明ISO能誘導(dǎo)分泌大量趨化因子和炎癥因子造成MI[14]。IL-1β、IL-6和TNF-α這些因子都已被證明是造成心肌細(xì)胞凋亡、心肌組織損傷的因素。而IL-10被視為炎癥抑制因子[11]，其水平高低對MI后炎癥反應(yīng)的測定具有重要意義。在本研究中，茯苓多糖預(yù)處理能有效降低MI大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平，提高IL-10水平，說明茯苓多糖針對MI引起的炎癥有抑制效果，同時也暗示著茯苓多糖減輕MI大鼠損傷的機制可能與炎癥通路有關(guān)。

NF-κB是一種可誘導(dǎo)的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞質(zhì)磷酸化后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，然后與許多基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，激活如IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥調(diào)控基因，并增加其下游蛋白的表達[15]。IκK-β是IκB-α上游調(diào)控蛋白，當(dāng)出現(xiàn)氧化應(yīng)激或炎癥刺激后，IκB-α被IκK-β激活，出現(xiàn)磷酸化與泛素化降解，使NF-κB從復(fù)合體中分離并激活，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中參與特定基因的表達，進一步引發(fā)下游炎癥因子的釋放[16]。因此，抑制NF-κB通路有利于減少MI導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。在本研究中，茯苓多糖的預(yù)處理通過減少組織中IκK-β的表達，避免了IκB-α的磷酸化激活，使P65 NF-κB磷酸化減少，活性降低，從而減少下游基因的進一步表達，緩解了心肌組織因MI導(dǎo)致的損傷，與WU等[17]對茯苓多糖基于NF-κB抗炎的研究結(jié)果基本一致。

綜上所述，本研究基于IκK-β/IκB-α/NF-κB通路分析茯苓多糖預(yù)處理對ISO所致MI大鼠的保護作用，發(fā)現(xiàn)茯苓多糖可有效保護心肌組織因MI誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激失衡與炎癥反應(yīng)，減少心肌壞死面積與細(xì)胞凋亡數(shù)量，其作用可能與抑制IκK-β/IκB-α/NF-κB通路有關(guān)。