吳紅艷 石 巖 李秀鑫 安 琪

(齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

萬壽菊具有較高的營養(yǎng)保健價值，其花、葉可入藥，有清熱化痰、補血通經(jīng)的功效[1]。由萬壽菊提取分離制成的葉黃素產(chǎn)品可作為食品及飼料著色劑使用，同時在預防視網(wǎng)膜黃斑病變和艾滋病、提高人和動物免疫力、預防心腦血管疾病、作為新型飲料等方面具有卓越的生理功能[2]。萬壽菊葉黃素提取后常用的純化方法有柱色譜法、結晶法、高效逆流色譜法等，相比較而言，柱色譜法具有成本低廉、操作簡單等特點，其中，大孔樹脂被廣泛應用于多酚、生物堿、黃酮等植物活性成分的分離純化[3-5]。李育楠[6]采用HZ816樹脂純化玉米黃粉中的葉黃素，以V無水乙醇∶V乙酸乙酯為9∶1作洗脫劑進行洗脫，較皂化后葉黃素的純度(92.17%)提高了4.32%。目前，從萬壽菊中制備高純度葉黃素的研究較少，且一些有關葉黃素純化方法的研究存在純度低、工藝復雜以及溶劑有毒性等問題，影響了萬壽菊花資源的開發(fā)利用[7-8]。試驗擬確定大孔樹脂純化萬壽菊中葉黃素的工藝條件，進一步提高葉黃素的純度，以期為后續(xù)工業(yè)化研究和開發(fā)萬壽菊中葉黃素類產(chǎn)品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多力葵花油：佳格投資(中國)有限公司；

Tween80、Span80、氫氧化鉀：河北市光復精細化工有限公司；

葉黃素標準品(純度≥90%)：上海源葉生物科技有限公司；

無水乙醇：河北市天力化工研究所；

萬壽菊顆粒：廣州立達爾生物科技股份有限公司；

X-5、S-8、D-352、D-101、HP-20大孔樹脂：南昌市廣富藥品有限公司。

1.2 儀器與設備

水浴恒溫振蕩器：SHA-C型，河北閱近儀器有限公司；

可見分光光度計：722N型，濟南易農(nóng)儀器有限公司；

電子天平：BSA124S-CW型，德國賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；

磁力攪拌器：IKAC-MAG HS-4型，艾卡(廣州)儀器設備有限公司；

pH計：Sartorius譜及型，上海儀電科學儀器股份有限公司；

層析柱：1.5 cm×56 cm，河北慶傅儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-52AA型，湖南雅陽儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 葉黃素粗制品的制備 萬壽菊顆粒粉碎過80目篩，按m萬壽菊粉∶V葵花籽油微乳液為1∶50 (g/mL)將萬壽菊粉和葵花籽油微乳液混合均勻，添加1%纖維素酶。45 ℃恒溫水浴中振蕩2.0 h，用0.45 μm濾膜抽濾，收集濾液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得葉黃素粗提物。

1.3.2 葉黃素粗制品的皂化 按m葉黃素粗提物∶VKOH-C2H5OH溶液為5∶6 (g/mL)將葉黃素粗提物與0.15 g/mL 的KOH-C2H5OH溶液混合均勻，50 ℃下超聲皂化58 min，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到濃縮液備用。

1.3.3 大孔樹脂純化葉黃素

(1) 最佳大孔樹脂的選擇：分別選取X-5、D-352、D-101、HP-20、S-8 5種大孔樹脂，將純品葉黃素分別與不同體積分數(shù)的乙醇混合均勻，制備成不同的葉黃素—乙醇稀釋液，用葉黃素—乙醇稀釋液吸附大孔樹脂，真空抽濾，測定447 nm處吸光度值，并計算其吸附率。

(2) 靜態(tài)吸附劑的選擇：將純品葉黃素分別與不同體積分數(shù)的乙醇混合均勻，制備成不同的葉黃素—乙醇稀釋液，在不同溫度、吸附時間、pH下進行吸附，真空抽濾，測定447 nm處吸光度值，并計算其吸附率。

(3) 上樣濃度對靜態(tài)吸附的影響：將純品葉黃素分別與不同體積分數(shù)的乙醇混合均勻，制備成不同的葉黃素—乙醇稀釋液，將稀釋液配制成不同濃度的上樣液，采用大孔樹脂進行吸附，真空抽濾，測定447 nm處吸光度值，并計算其吸附率。

(4) 靜態(tài)解析劑的選擇：用超純水對已吸附葉黃素的HP-20大孔樹脂進行清洗，清洗液置于100 mL錐形瓶中，分別加入不同體積分數(shù)的乙醇，制備成不同的葉黃素—乙醇稀釋液，不同溫度、解析時間、pH下進行解析，真空抽濾，測定447 nm處吸光度值，并計算其解析率。

(5) HP-20型大孔樹脂動態(tài)條件優(yōu)化：分別考察上樣質(zhì)量濃度(流速0.4 mL/min，pH 6.0)和上樣流速(pH 6.0，質(zhì)量濃度0.01 mg/mL)對動態(tài)吸附吸附率的影響。

1.3.4 吸附率、解析率的計算 分別按式(1)、式(2)計算吸附率和解析率。

(1)

(2)

式中：

Q吸——吸附率，%；

Q解——解析率，%；

Aa——葉黃素稀釋液的吸光度值；

Ab——大孔樹脂吸附葉黃素后濾液的吸光度值；

Ac——大孔樹脂解析葉黃素后濾液的吸光度值。

1.3.5 高效液相色譜檢測純化后葉黃素純度 準確稱量1 mg葉黃素，將其完全溶解至10 mL甲醇中，稀釋制成0.1 mg/mL的標準溶液。C18反相色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙酸乙酯，柱溫30 ℃，進樣量1 μL，流速0.5 mL/min，檢測波長447 nm。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 所有試驗重復3次，采用Origin和Excel軟件進行圖表繪制，通過SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析，字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2 結果與討論

2.1 最佳大孔樹脂的選擇

由圖1可知，大孔樹脂種類對色素的純化效果存在差異，吸附率從高到低依次為大孔樹脂HP-20>D-101>X-5>S-8>D-352。HP-20、D-101、S-8 3種大孔樹脂均屬于非極性，根據(jù)相似相溶的原理，如果樹脂的極性接近吸附顆粒的極性，則其吸附能力會更好。S-8和D-352是極性樹脂，葉黃素是脂溶性色素，幾乎不溶于水所以其吸附率較低。大孔樹脂HP-20的解析率最高，是因為該樹脂具有表面積大和孔徑大的特點，更有助于色素的吸附和解析。故選取大孔樹脂HP-20對萬壽菊中的葉黃素進行純化。

圖1 大孔樹脂對葉黃素吸附率和解析率的影響

2.2 靜態(tài)吸附劑的選擇

由圖2可知，當乙醇體積分數(shù)<80%時，吸附率與乙醇體積分數(shù)呈正比，是因為乙醇使大孔樹脂發(fā)揮作用，使其得到了充分的溶脹，因此其吸附能力增強即吸附率高；當乙醇體積分數(shù)>80%時，吸附率呈下降趨勢，可能是由于大孔樹脂的吸附達到了飽和，故選擇體積分數(shù)為80%的乙醇溶液作為吸附劑。

圖2 乙醇體積分數(shù)對葉黃素吸附率的影響

2.3 上樣質(zhì)量濃度對靜態(tài)吸附的影響

由圖3可知，隨著上部樣品質(zhì)量濃度的增加，吸附量先增大后減小。當上樣質(zhì)量濃度>0.01 mg/mL時，吸附速率趨于下降。上樣質(zhì)量濃度太高，雜質(zhì)含量增加，葉黃素與大孔樹脂之間的接觸面積減少，可能會影響大孔樹脂對葉黃素的吸附[9]。因此，選擇0.01 mg/mL的樣品質(zhì)量濃度作為最佳吸附條件。

圖3 上樣質(zhì)量濃度對葉黃素靜態(tài)吸附率的影響

2.4 靜態(tài)吸附單因素試驗

2.4.1 溫度對靜態(tài)吸附率的影響 由圖4可知，當溫度為30 ℃時，HP-20型大孔樹脂靜態(tài)吸附率最高，當溫度>30 ℃時，吸附率呈下降趨勢。溫度越高，葉黃素的穩(wěn)定性越差，其稀釋液更容易揮發(fā)，故吸附率降低[10]。因此，選取靜態(tài)吸附溫度為30 ℃。

80%乙醇，pH 5.0，吸附時間2 h

2.4.2 吸附時間對靜態(tài)吸附率的影響 由圖5可知，隨著吸附時間的增加，靜態(tài)吸附速率先增大后趨于穩(wěn)定。當吸附時間>3 h時，吸附速率無明顯變化，HP-20大孔樹脂已處于吸附飽和狀態(tài)。因此，選擇靜態(tài)吸附時間為3 h。

80%乙醇，pH 5.0，溫度30 ℃

2.4.3 pH對靜態(tài)吸附率的影響 由圖6可知，當稀釋液的pH為3.0～6.0時，葉黃素的吸附率呈上升的趨勢，當稀釋液的pH>6.0時，吸附率下降。這可能是由于弱酸條件下，葉黃素易與大孔樹脂發(fā)生氫鍵作用，使其更容易吸附在大孔樹脂上[13]，因此選取pH為6。

80%乙醇，溫度30 ℃，吸附時間2 h

2.5 靜態(tài)吸附正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇溫度、吸附時間和pH為試驗因素，以大孔樹脂吸附率為考察指標，進行三因素三水平正交試驗優(yōu)化靜態(tài)吸附工藝條件，試驗因素水平見表1，試驗設計及結果見表2。

表1 靜態(tài)吸附正交試驗因素水平表

由表2可知，各因素對大孔樹脂吸附率的影響順序為溫度>吸附時間>pH，最佳試驗組合為A2B1C3，即溫度30 ℃，吸附時間2.0 h，pH 7.0，測得平均吸附率為(96.35±0.032)%(n=3)。

表2 靜態(tài)吸附正交試驗設計及結果

2.6 靜態(tài)解析劑的選擇

由圖7可知，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，HP-20型大孔樹脂對葉黃素的解析率增加，是由于乙醇溶液可以使大孔樹脂得到充分溶脹，同時葉黃素在乙醇中溶解度較高，使葉黃素和大孔樹脂之間的作用力減小，將其葉黃素從大孔樹脂中洗脫出來溶解于乙醇溶液中。由于無水乙醇的解析率最高，因此選取其作為大孔樹脂的解析溶劑。

圖7 乙醇體積分數(shù)對靜態(tài)解析率的影響

2.7 靜態(tài)解析單因素試驗

2.7.1 溫度對靜態(tài)解析率的影響 由圖8可知，隨著溫度的升高，解析率先增加后降低。當溫度為40 ℃時，葉黃素的解析率最高。當溫度>40 ℃時，解析率呈下降趨勢。因此選取40 ℃作為最佳解析溫度。

pH 5.0，解析時間2 h

2.7.2 pH對靜態(tài)解析率的影響 由圖9可知，當pH為3.0～5.0時，解析率隨之增加，當pH>5.0時，解析率趨于平穩(wěn)，對葉黃素的解析率無顯著性影響。為了節(jié)約實際用量，選取pH 5.0作為最佳解析條件。

溫度30 ℃，解析時間2 h

2.7.3 解析時間對靜態(tài)解析率的影響 由圖10可知，隨著解析時間的增加，解析率呈先增加后降低的趨勢。當解析時間為1～3 h時，解析率基本不變，其中2 h時的解析率最高，當解析時間>3 h后解析率出現(xiàn)了急劇下降，是因為解析時間過長，葉黃素的穩(wěn)定性變差，且無水乙醇揮發(fā)，影響解析結果。因此選取2 h為最佳解析時間。

pH 5.0，溫度30 ℃

2.8 靜態(tài)解析正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇溫度、解析時間和pH為試驗因素，以大孔樹脂解析率為考察指標，進行三因素三水平正交試驗優(yōu)化靜態(tài)解析工藝條件，試驗因素水平見表3，試驗設計及結果見表4。

表3 靜態(tài)解析正交試驗因素水平表

由表4可知，各因素對大孔樹脂吸附葉黃素解析率的影響依次為溫度>解析時間>pH，最佳工藝組合為A2B1C3，即溫度40 ℃，解析時間1.0 h，pH 7.0，測得平均解析率為(72.23±0.064)%(n=3)。

表4 靜態(tài)解析正交試驗設計及結果

2.9 HP-20型大孔樹脂動態(tài)吸附條件優(yōu)化

2.9.1 上樣質(zhì)量濃度對動態(tài)吸附的影響 由圖11可知，葉黃素的吸附量隨樣品溶液質(zhì)量濃度的增加而先增加后減少。當上部樣品質(zhì)量濃度>0.01 mg/mL時，會發(fā)生部分溶質(zhì)泄漏，導致葉黃素的損失和浪費[11]。因此，當樣品質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL時，葉黃素的動態(tài)吸附效果最好。

圖11 上樣質(zhì)量濃度對葉黃素動態(tài)吸附率的影響

2.9.2 上樣流速對動態(tài)吸附的影響 由圖12可知，葉黃素的吸光度值隨樣品溶液上樣流速的增加而增加。當上樣流速>0.4 mL/min時，吸光度值突然升高，說明葉黃素并未被大孔樹脂完全吸附便已流出[12]。因此，當上樣流速為0.4 mL/min時，葉黃素的動態(tài)吸附效果最好。

圖12 上樣流速對葉黃素動態(tài)吸附的影響

2.10 純化樣品與葉黃素標準品的對比

由圖13可知，試驗所純化的葉黃素與純品葉黃素的出峰時間基本一致，差距較小，出現(xiàn)偏差是因為樣品濃縮液中不能完全去除雜質(zhì)，但是經(jīng)過大孔樹脂吸附等一系列的提純操作可以得到純度為61.72%的萬壽菊葉黃素純度，基本達到提純目的。

圖13 上樣質(zhì)量濃度對葉黃素動態(tài)吸附率的影響

3 結論

采用大孔樹脂將葉黃素粗品進行純化，通過吸附率以及解析率對其靜態(tài)和動態(tài)條件進行優(yōu)化。結果表明：靜態(tài)試驗中，HP-20型大孔樹脂對葉黃素的吸附與解析效果最好，選取體積分數(shù)為80%的乙醇作為吸附劑，最佳靜態(tài)吸附質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL，選取無水乙醇作為解析劑。大孔樹脂對葉黃素的最佳吸附工藝條件為溫度30 ℃，吸附時間2.0 h，pH 7.0；最佳解析工藝條件為溫度40 ℃，解析時間1.0 h，pH 7.0。動態(tài)試驗中，樣品溶液的最佳吸附質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL，最佳樣品流速為0.4 mL/min。通過高效液相色譜法測定其純度可達61.72%。后續(xù)需進一步分離純化以提高葉黃素純度。