包曉瑋，魏晨業(yè)，劉曉祿，江峻峰，孫嘉莉，徐 均

（1 新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院 烏魯木齊 830052 2 新疆沙棘精深加工工程技術研究中心 新疆克孜勒蘇柯爾克孜自治州 845350）

近年來，惡性腫瘤發(fā)病率顯著增高，據(jù)了解，全球范圍內(nèi)約20%的男性和17%的女性具有一定的患癌風險[1]。在亞洲地區(qū)，癌癥死亡的人數(shù)占全球癌癥死亡總?cè)藬?shù)的50%，其中肝癌是現(xiàn)今較為多見的惡性腫瘤之一，患者自身的生命安全始終得不到有效保障。據(jù)2021年統(tǒng)計數(shù)據(jù)，肝癌是全球第六大常見高發(fā)癌癥，也是癌癥相關死亡的第三大原因，僅次于肺癌和結(jié)直腸癌[2]，且惡性腫瘤具有早期診斷率低、臨床治愈率低的特點，尚無有效的治療方法。目前主要采用手術及放化療等手段進行癌癥治療。此外，使用放療、化療等治療手段對人體產(chǎn)生的毒副作用較大，在治療過程中，藥物對腫瘤細胞的識別作用不強，在消除腫瘤細胞的同時，也損害了正常細胞的生長發(fā)育，對病患后期的身心健康及生活質(zhì)量都造成重大的影響。探尋毒副作用小的有效抗腫瘤藥物，降低病患的惡性腫瘤死亡率，改善其生存質(zhì)量，已成為廣大醫(yī)學工作者亟待解決的問題。多糖作為常見的天然活性物質(zhì)，成為抗腫瘤研究的熱點之一。目前已報道香菇多糖[3]、槐角多糖[4]、板栗種仁多糖[5]等具有一定抗腫瘤作用，而有關沙棘多糖的相關研究并不多見。本文以人肝癌細胞（Hep-G2）為研究對象，探討沙棘多糖SBP-3 組分對腫瘤細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Hep-G2 人肝癌細胞，武漢普諾賽生命科技有限公司；CCK-8 試劑盒、DMEM 高糖培養(yǎng)基，美國Hyclone 公司；Annexin V-FITC 凋亡試劑盒，碧云天生物試劑公司；BCA 試劑盒，上海易色醫(yī)療科技有限公司；p-p38 抗體、MMP-2 抗體、MMP-9抗體，上海戶實醫(yī)藥科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-IFD 超凈工作臺，蘇州安泰有限公司；SC3614 高速離心機，中佳有限公司；UCTR30-2 倒置光學顯微鏡，上海普赫有限公司；HERACELL1150i 細胞恒溫培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific 公司；Multiscan MK3 酶標儀，美國Thermo Scientific 公司；BG-Power 600i 電泳儀，北京百晶生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 沙棘多糖SBP-3 的制備、分組及細胞培養(yǎng) 根據(jù)魏晨業(yè)等[6]的研究方法，采用DEAE-52 纖維素柱分離純化，得到酸性多糖SBP-3。將沙棘多糖SBP-3 組分用不含血清的DEAE 培養(yǎng)基配成質(zhì)量濃度為0.625，1.25，2.5，5 mg/mL 和10 mg/mL的多糖組，以不加多糖的組作為空白對照組。

將凍存Hep-G2 細胞復蘇后，置于5% CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 CCK-8 法檢測Hep-G2 細胞增殖率 將Hep-G2 細胞按2×104個/孔的密度接種于96 孔板，每孔90 μL，設立3 個復孔。分別加入不同濃度的沙棘多糖溶液10 μL，使其終質(zhì)量濃度分別為62.5，125，250，500，1 000 μg/mL，培養(yǎng)24 h 和48 h 后，每孔加10 μL CCK-8，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培育4 h。用酶標儀檢測450 nm 處吸光度OD 值，計算細胞增殖抑制率。計算公式[7]：

式中：OD1——含多糖樣品吸光度；OD2——不含多糖樣品吸光度。

1.3.3 流式細胞術檢測Hep-G2 細胞的凋亡率按1.3.2 節(jié)方法處理Hep-G2 細胞，通過CCK-8試驗選擇不同濃度沙棘多糖溶液作為凋亡試驗的劑量，即用125，250，500 μg/mL 作用細胞，培養(yǎng)24 h 和48 h 后，用PBS 溶液反復洗滌細胞，使其混合均勻，加入胰蛋白酶（不含EDTA）消化，觀察細胞是否從培養(yǎng)板壁上脫落。將0.5 mL 細胞懸液轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，加入1.25 μL Annexin V-FITC混勻后加入10 μL PI，室溫避光反應15 min，用流式細胞儀檢測[8]。

1.3.4 劃痕試驗檢測Hep-G2 細胞遷移能力 將Hep-G2 細胞接種于6 孔板中，用顯微鏡觀察細胞生長密度達到80%后，用移液器吸頭將細胞垂直劃傷，用PBS 貼壁緩慢加入潤洗，分別加入不同質(zhì)量濃度的沙棘多糖溶液（125，250，500 μg/mL）培養(yǎng)48 h 后，置于顯微鏡下觀察并拍照[9]。

1.3.5 Transwell 小室檢測Hep-G2 細胞侵襲能力 將Hep-G2 細胞接種于Transwell 板[10]，上室中加入含1%血清的細胞懸液100 μL，下室中加入500 μL 含15% FBS 的各濃度組培養(yǎng)液，放入37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h 后取出小室，用PBS 反復潤洗后加入結(jié)晶紫染色5 min，清洗后用棉簽擦去內(nèi)側(cè)壞死細胞，隨機選取5 個視野觀察并計數(shù)穿越小室的侵襲性細胞數(shù)目。

1.3.6 Western blot 檢測p-p38、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平 按1.3.3 節(jié)方法處理Hep-G2 細胞，分別加入不同質(zhì)量濃度的沙棘多糖溶液（125，250，500 μg/mL）培養(yǎng)48 h，經(jīng)胰蛋白酶消化后，提取蛋白，用BCA 蛋白濃度測定試劑盒定量。通過SDS-PAGE 垂直板電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，放入5%脫脂奶粉封閉液中，封閉1 h，一抗孵育，將PVDF 膜放入稀釋好的 p-p38、MMP-2、MMP-9抗體中，4 ℃過夜。第2 天將PVDF 膜放入對應的二抗中，室溫培養(yǎng)2 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min，ECL 顯色，用凝膠成像分析儀系統(tǒng)拍照[11]，計算機掃描并分析處理結(jié)果。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理 運用SPSS 20.0 對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，結(jié)果以均數(shù)±標準差（±s）表示，圖、表采用origin 8.5 繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 SBP-3 對Hep-G2 細胞增殖的影響

CCK-8 法是一種準確度和靈敏度較高且常用于測定細胞增殖的比色法[12]。由圖1可知，與空白組相比，Hep-G2 細胞經(jīng)SBP-3 各劑量組作用24 h，對其抑制率逐漸升高（P＜0.05）。當SBP-3 質(zhì)量濃度升至1 000 μg/mL 時抑制效果最佳，達28.83%；經(jīng)SBP-3 各劑量組作用48 h，各組細胞抑制率也顯著升高（P＜0.01），其中SBP-3 質(zhì)量濃度為125，500 μg/mL 和1 000 μg/mL 時的抑制率分別為26.62%，27.3%和60.43%。以上結(jié)果說明沙棘多糖SBP-3 組分在62.5～1 000 μg/mL 濃度范圍，能夠抑制Hep-G2 細胞的增殖，且抑制率隨其濃度的增加、作用時間的延長而呈上升趨勢。

2.2 SBP-3 對Hep-G2 細胞凋亡的影響

根據(jù)SBP-3 對Hep-G2 細胞增殖的作用結(jié)果，選擇125，250 μg/mL 和500 μg/mL 3 個質(zhì)量濃度梯度，作用24 h 和48 h 為Hep-G2 細胞的培養(yǎng)條件，試驗結(jié)果見圖2。與空白組相比，各SBP-3 濃度組均能誘導Hep-G2 細胞產(chǎn)生凋亡作用，且細胞凋亡率隨SBP-3 濃度的增加而逐漸升高。125 μg/mL SBP-3 作用24 h，細胞凋亡率為5.23%；500 μg/mL SBP-3 時細胞凋亡率最高為6.41%。當作用時間48 h 時，細胞凋亡率極顯著上升（P＜0.01），當SBP-3 多糖質(zhì)量濃度分別為125，250 μg/mL 和500 μg/mL 時，細胞凋亡率分別為31.68%，36.59%和37.32%。SBP-3 作用48 h 的效果明顯優(yōu)于24 h，最終選擇SBP-3 作用48 h 為后續(xù)試驗條件。圖3中，Q1 表示壞死細胞；Q2 表示晚期凋亡細胞；Q3 表示早期凋亡細胞；Q4 表示正常細胞，Q2+Q3 表示凋亡細胞[13]。通過測定Hep-G2 細胞凋亡信號，發(fā)現(xiàn)48 h 內(nèi)沙棘多糖SBP-3 組分各劑量組凋亡細胞比例顯著增加，說明SBP-3 能夠誘導Hep-G2 細胞的凋亡。

2.3 SBP-3 對Hep-G2 細胞遷移的影響

腫瘤細胞在不斷發(fā)育生長的階段，當其分化速度及遷移能力在短時間內(nèi)呈現(xiàn)異常性變化時，轉(zhuǎn)化為惡性腫瘤的可能性急劇增加，將對人體的生命安全及治療產(chǎn)生巨大的危害，沙棘多糖SBP-3 對Hep-G2 細胞轉(zhuǎn)移能力的影響可通過傷口愈合試驗進行評估[14]。單層Hep-G2 細胞覆蓋在6 孔板上，在匯合細胞層的中心形成具有尖端的傷口，中央傷口的恢復率表明Hep-G2 細胞的遷移能力。當給予不同濃度的沙棘多糖SBP-3作用Hep-G2 細胞48 h，試驗結(jié)果如圖4所示。與未添加多糖的空白對照組相比，沙棘多糖SBP-3作用的各組Hep-G2 細胞的遷移能力隨其劑量的增加，得到不同程度地抑制，劃痕閉合范圍明顯減小。當SBP-3 質(zhì)量濃度增到500 μg/mL 時，對Hep-G2 細胞的抑制效果最佳，細胞遷移率僅5.59%，即SBP-3 的刺激可以顯著減少遷移到聚碳酸酯膜下側(cè)的Hep-G2 細胞數(shù)量 （P＜0.01），這表明沙棘多糖SBP-3 組分呈劑量依賴性抑制Hep-G2 細胞的遷移。

2.4 SBP-3 對Hep-G2 細胞侵襲的影響

Transwell 法檢測細胞侵襲的狀況，結(jié)果顯示：空白對照組HepG2 細胞具有較強的遷移能力[15]。培養(yǎng)48 h 后，可觀察到大量顏色深淺不一的HepG2 細胞，形狀為長梭形，且分布十分密集（圖5a）。隨著SBP-3 藥物濃度的增加，細胞穿越小室基底膜的數(shù)量明顯減少，HepG2 細胞聚集的密度顯著降低，呈零星分散狀態(tài)，由此可判斷SBP-3 使HepG2 細胞侵襲穿透能力減弱（圖5b、5c、5d）。與空白對照組相比，經(jīng)SBP-3 作用的各劑量組侵襲細胞數(shù)量在48 h 內(nèi)顯著減少（P＜0.01，圖6），且呈劑量依賴性抑制Hep-G2 細胞侵襲，即SBP-3 濃度越大，侵襲細胞數(shù)越少，其中SBP-3 質(zhì)量濃度500 μg/mL 時，細胞侵襲率僅為16.42%，抑制Hep-G2 轉(zhuǎn)移能力最佳。

2.5 SBP-3 對Hep-G2 細胞p-p38、MMP-2 及MMP-9 蛋白表達的影響

通過Western blot 法測定SBP-3 對Hep-G2細胞p38MAPK 信號通路中關鍵蛋白p-p38、MMP-2 及MMP-9 的表達[16]，結(jié)果表明，與空白對照Hep-G2 組相比，沙棘多糖SBP-3 各劑量組pp38、MMP-2 及MMP-9 表達水平隨SBP-3 濃度的增加而逐漸降低（P＜0.01），當SBP-3 質(zhì)量濃度達500 μg/mL 時，下調(diào)蛋白表達的能力最強，說明沙棘多糖SBP-3 能夠抑制p38 通路中p-p38、MMP-2 及MMP-9 的表達，初步推測SBP-3 呈劑量依賴性抑制p38 信號通路中相關蛋白的表達，進而降低細胞的侵襲和遷移能力并誘導Hep-G2細胞凋亡。

3 討論

正常條件下，細胞增殖和凋亡是一個動態(tài)平衡過程，若此過程中出現(xiàn)平衡失調(diào)的狀態(tài)，則可能導致腫瘤細胞的產(chǎn)生和擴散。腫瘤細胞的發(fā)展與多通道信號的傳遞密不可分[17]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated potein kinase，MAPK）級聯(lián)反應是細胞內(nèi)連接并產(chǎn)生信號的常見通路之一[18]。p38 是MAPK 信號通路中重要的子系統(tǒng)，通常參與細胞整體生長發(fā)育過程[19]，當p38 蛋白在磷酸化后才能發(fā)揮其活性，即通過磷酸化形成pp38 對Hep-G2 細胞生長、轉(zhuǎn)移及侵襲的調(diào)節(jié)。腫瘤細胞在生長過程中由于未受到正常細胞的接觸抑制，進而不斷地侵襲和排擠正常組織并突破底部基膜，當其增殖到一定體積后，通過基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloprot-einase，MMP），如IV 型膠原酶降解細胞外基質(zhì)，促使轉(zhuǎn)移通路形成，最終形成繼發(fā)性腫瘤。通過提高基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloprot-einase，MMP）表達水平，促使轉(zhuǎn)移通路形成，最終形成繼發(fā)性腫瘤。

p38MAPK 通路通過調(diào)節(jié)MMPs 的蛋白表達量，實現(xiàn)腫瘤細胞在短時間內(nèi)的遷移和侵襲。首先激活p38 信號通路中相關磷酸化蛋白，其次增強下游如MMP-2 和MMP-9 等多個結(jié)合靶點的表達與活化。唐治蓉等[20]等發(fā)現(xiàn)，當歸多糖對Hela細胞中的p38 通路產(chǎn)生抑制作用，從而降低Hela細胞的遷移率。Zheng 等[21]發(fā)現(xiàn)紅豆杉多糖能夠下調(diào)MMP-2 和MMP-9 的表達，改善黑色素瘤細胞的遷移及侵襲速率，即MMP-2 和MMP-9 主要參與腫瘤細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移過程，提示抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的表達或抑制其活性可以預防腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移[22]。本結(jié)果表明SBP-3 對Hep-G2 細胞生長、凋亡、轉(zhuǎn)移及侵襲具有一定的調(diào)節(jié)作用，推測可能通過下調(diào)p38 MAPK 通路的活性，降低MMP-2 和MMP-9 蛋白的表達，進而對Hep-G2細胞遷移及侵襲能力產(chǎn)生抑制作用，具有一定的抗腫瘤作用。多糖對腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)，即治療機制并非直接產(chǎn)生抗腫瘤作用，而是通過間接增強免疫調(diào)節(jié)，抑制腫瘤生長、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移來實現(xiàn)的[23]。多糖的結(jié)構(gòu)在一定程度上能夠影響其生物活性，后續(xù)可從分子水平研究其作用機制，闡明多糖的構(gòu)效關系，用分子修飾等方法改善其活性，更深層次探討其作用價值。

4 結(jié)論

本研究表明沙棘多糖SBP-3 能夠抑制肝癌細胞Hep-G2 的增殖、凋亡、遷移和侵襲，初步推測是通過下調(diào)p38MAPK 信號通路活性，抑制MMP-2 和MMP-9 表達，從而產(chǎn)生抗腫瘤作用。