賈 斌，毛小雨，許馨予，楊鵠雋，張慧敏，3，左 鋒，2*

（1 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院 黑龍江大慶 163319 2 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 國家雜糧工程技術(shù)研究中心 黑龍江大慶 163319 3 糧食副產(chǎn)物加工與利用教育部工程研究中心 黑龍江大慶 163319）

機(jī)體受生活環(huán)境、年齡等多因素的影響，體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與消除平衡逐漸被打破，多余的自由基會(huì)對生物大分子造成一定的損傷[1-2]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，食物源抗氧化劑對人體健康有積極的作用，比如紫花蕓豆在體內(nèi)消化后的蛋白質(zhì)水解物可以改善或減少氧化還原狀態(tài)標(biāo)記，經(jīng)常食用蕓豆可緩解一些慢性疾病發(fā)生，如心腦血管疾病、Ⅱ型糖尿病和肥胖等[3]。來源豐富的植物蛋白原料經(jīng)人體消化后，產(chǎn)生的肽段的抗氧化活性較高，其中較短的肽具有較強(qiáng)的自由基猝滅作用，易于人體吸收[4-5]。

人體攝入食物后，經(jīng)過胃腸消化這一復(fù)雜過程中消化環(huán)境的變化以及組分間的相互作用，對食物中營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收產(chǎn)生影響[6]。齊寶坤等[7]采用胃部模擬消化方式對大豆分離蛋白（SPI）進(jìn)行處理，通過中紅外光譜發(fā)現(xiàn)經(jīng)胃蛋白酶的消化后，SPI 的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變。石嘉懌等[8]以大米谷蛋白為原料，通過體外模擬腸部消化，比較不同消化時(shí)間下胰蛋白酶對大米谷蛋白內(nèi)源熒光和二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶作用于β-折疊使谷蛋白結(jié)構(gòu)展開，內(nèi)源熒光強(qiáng)度增加，蛋白質(zhì)生物活性明顯增強(qiáng)。Sarker 等[9]以紅蕓豆為原料，通過酶解發(fā)現(xiàn)水解液的抗氧化活性高于抗壞血酸（AA），能較好地抑制酸奶中氧化物質(zhì)生成，與對照組相比，可延緩酸奶中45.8%的氧化物質(zhì)生成。Shan 等[10]報(bào)道豆科植物蛋白具有多樣性，在人體內(nèi)豆類蛋白水解物不僅以氨基酸的方式吸收，還以多肽的形式消化吸收，根據(jù)其結(jié)構(gòu)性質(zhì)、氨基酸組成和序列排序變化對蛋白水解物的抗氧化活性產(chǎn)生影響。有關(guān)蕓豆蛋白及水解物具有較高的抗氧化活性已有大量報(bào)道，然而，經(jīng)人體消化后，特別是胃腸不同消化時(shí)期，其蛋白水解物的抗氧化活性、氨基酸組成及結(jié)構(gòu)變化鮮有報(bào)道。

本文采用體外模擬胃腸道消化模型，研究胃腸不同消化階段蕓豆蛋白的抗氧化活性、氨基酸含量、巰基含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)及微觀結(jié)構(gòu)，解析蕓豆蛋白水解物的抗氧化及結(jié)構(gòu)特征，為紫花蕓豆蛋白（KPI）的精深加工及開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫花蕓豆，黑龍江省林甸縣。

胃蛋白酶、胰蛋白酶，賽國生物科技公司；DPPH、VC 標(biāo)準(zhǔn)品、ABTS，阿拉丁試劑公司；（TAOC）檢測試劑盒，北京索萊寶公司；氯化鉀、鐵氰化鉀、溴化鉀等其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

冷凍干燥機(jī)，德國CHRISTA 公司；U-2019 型紫外-可見分光光度計(jì)，日本HITACHI 公司；DYCZ-24K 型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；TENSOR27 傅里葉變換紅外光譜儀，德國Bruker公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紫花蕓豆蛋白（KPI）的制備 參照馬文鵬等[11]的方法略作修改。蕓豆浸泡、去皮、烘干、粉碎過60 目篩后，石油醚脫脂烘干。蕓豆粉按1∶12 與水混合，pH 值調(diào)至9 后攪拌90 min，離心收集上清液，對沉淀2 次提取。收集2 次上清液pH 值調(diào)至4.5，離心后將沉淀去離子水水洗3 次，將pH值調(diào)至中性，離心后凍干得KPI。

1.3.2 體外模擬胃腸連續(xù)消化 將紫花蕓豆蛋白（KPI） 分散在去離子水中配置成50 mg/mL 溶液，以中性磷酸鹽緩沖液作溶劑，將KPI 緩沖液與人工模擬胃液緩沖液[12]（6.9 mmol/L KCI 溶液，0.9 mmol/L KH2PO4溶液，25 mmol/L NaHCO3溶液，47.2 mmol/L NaCl 溶液，0.1 mmol/L MgCl2（H2O）6溶液，0.15 mmol/L CaCl2（H2O）2溶液） 等體積混合，pH 值調(diào)至3.0 后添加胃蛋白酶，37 ℃恒溫反應(yīng)結(jié)束后加入等體積人工模擬小腸緩沖液（6.8 mmol/L KCI 溶液，0.8 mmol/L KH2PO4溶液，85 mmol/L NaHCO3溶液，38.4 mmol/L NaCl 溶液，0.33 mmol/L MgCl2（H2O）6溶液，0.6 mmol/L CaCl2（H2O）2溶液），pH 值調(diào)至7.0 后加入胰蛋白酶，消化期間維持溫度37 ℃、pH 值7.0 穩(wěn)定。對不同時(shí)間（0.5，2，3 h）上清液進(jìn)行取樣，滅酶、冷卻和低溫高速離心后收集上清液冷凍干燥，部分沉淀用于電泳。

1.3.3 紫花蕓豆蛋白及消化產(chǎn)物水解度及溶解度測定 采用鄰苯二甲醛（OPA）法對KPI 消化過程的水解度[13]進(jìn)行測定。將0.1 mol/L 的中性磷酸緩沖液與不同消化階段樣品配制成5 mg/mL 溶液（下同），與OPA 試劑（1∶20）混合后，避光3 min，340 nm 處測吸光度值。水解度（DH）按式（1）計(jì)算。

式中：h——樣品水解肽鍵數(shù)；htot取決于原料總肽鍵數(shù)（蕓豆htot=7.72）。

溶解度測定參考Mirmoghtadaie 等[14]報(bào)道的方法。

1.3.4 紫花蕓豆蛋白及消化產(chǎn)物抗氧化活性

1.3.4.1 總抗氧化能力測定 總抗氧化能力 （TAOC）測定試驗(yàn)使用試劑盒，試驗(yàn)方法見說明書。

1.3.4.2 還原能力測定 將不同消化階段的KPI在超純水中配制成5 mg/mL 的溶液。取2 mL 配制好的0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液和2 mL 1%鐵氰化鉀與2 mL 蛋白樣液40 ℃下混勻，再加2 mL 三氯乙酸溶液（10%）離心，將上清液2 mL 與超純水（2 mL）、氯化鐵溶液（1%，0.6 mL）混勻，待測液顏色由黃轉(zhuǎn)藍(lán)時(shí)700 nm 處測吸光度。以超純水做空白對照[15]。

1.3.4.3 DPPH 自由基清除能力測定 取KPI 消化液0.5 mL 避光條件下與3.5 mL DPPH （1×10-4mol/L，95%乙醇）混勻，靜置30 min，734 nm 處測吸光度A1，超純水替換KPI 消化液作對照組A2，乙醇替換DPPH 作空白組A3[16]。

DPPH 按公式（2）計(jì)算：

1.3.4.4 ABTS 測定 參照Pihlanto 等[17]的方法和步驟測定ABTS。0.1 mL KPI（5 mg/mL）與3.9 mL ABTS 工作液混勻，在734 nm 處，6 min 內(nèi)完成吸光度A1測定，95%乙醇代替KPI 溶液測空白值A(chǔ)0。

ABTS 采用公式（3）計(jì)算：

1.3.5 超濾分級(jí)及分級(jí)產(chǎn)物抗氧化活性測定 對胃腸連續(xù)消化樣品超濾分級(jí)，選用不同分子質(zhì)量大小超濾膜（100，50，30，10 ku）分段分級(jí)。

根據(jù)前期測定的抗氧化活性結(jié)果，選用胃腸連續(xù)消化0.5，2，3 h 的凍干樣品，適度稀釋后進(jìn)行超濾分級(jí)，分析不同分子質(zhì)量100～50 ku，50～30 ku，30～10 ku，＜10 ku 的紫花蕓豆蛋白模擬消化產(chǎn)物對抗氧化活性（測定方法同1.3.4.1、1.3.4.2、1.3.4.3、1.3.4.4 節(jié)）的作用效果。

1.3.6 SDS-PAGE 參照Yadav 等[18]的方法并適當(dāng)調(diào)整。分別取1.3.2 節(jié)中的KPI 溶液和酶解液1 mL，加入1 mL 0.125 mol/L Tris-HCl 緩沖液，水浴煮沸3 min，離心后收集上清液用于電泳。電泳條件：濃縮膠5%，分離膠質(zhì)14%，上樣量10 μL，恒壓模式下進(jìn)行。

1.3.7 傅里葉變換中紅外（MIR-FTIR）光譜測定取200 mg 烘干后的KBr 與2 mg 凍干粉混勻研磨成細(xì)粉，壓片機(jī)制透明薄片，設(shè)置參數(shù)為掃描次數(shù)32 次，間隔0.1 s，在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.3.8 紫花蕓豆蛋白及消化產(chǎn)物巰基含量測定 采用Ellman 法測定KPI 及消化產(chǎn)物的巰基含量。參照Tang 等[19]的方法稍加調(diào)整。取配制好的1 mL 樣品液（5 mg/mL）分別加入到5 mL 無添加和添加尿素（8 mol/L）的Tris-Gly 緩沖液中，對暴露巰基和總巰基含量進(jìn)行測定。在緩沖液中加入40 μL Ellman's 試劑 （5 mg/mL），412 nm 處測吸光度。

1.3.9 紫花蕓豆蛋白及消化產(chǎn)物氨基酸含量測定 參照韓晶[20]的測定方法進(jìn)行前處理，將處理好的濾液利用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行測定。

1.4 掃描電鏡（SEM）

將KPI 及消化后的凍干樣品真空下電鍍噴金，適當(dāng)調(diào)整位置和放大倍數(shù)后掃描觀察。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 體外模擬消化期間消化產(chǎn)物溶解度、水解度分析

紫花蕓豆蛋白模擬消化在不同時(shí)期的溶解度、水解度變化如圖1所示。由圖1a 可知，天然蕓豆蛋白溶解度為（58.47±0.33）%。經(jīng)胃部胃蛋白酶處理的蛋白樣液溶解度為（68.72±1.02）%，與天然紫花蕓豆蛋白相比提升了17.53%，這是因?yàn)槭|豆蛋白分子結(jié)構(gòu)致密，分子中亞基依靠二硫鍵、疏水相互作用相交聯(lián)[21]，在胃蛋白酶水解作用下，使蕓豆蛋白中巰基斷裂，分子質(zhì)量變小，肽鏈變得疏松，親水基團(tuán)更多被暴露，不溶性基團(tuán)含量降低，促使胃部水解產(chǎn)物具有更好的溶解性；進(jìn)一步經(jīng)歷腸部消化階段后，蕓豆蛋白水解物的溶解度為（66.34±1.12）%，與胃部消化相比溶解度下降了3.46%，這是因?yàn)殡S水解程度進(jìn)一步加深，暴露出大量的疏水性和巰基基團(tuán)，在疏水性基團(tuán)與二硫鍵作用下，小分子肽鏈相互交聯(lián)形成了大分子難溶性成分[22]。由圖1b 可知，蕓豆蛋白初始水解度幾乎為零，蕓豆蛋白經(jīng)過胃部消化后水解度為（9.67±0.72）%，經(jīng)腸道胰蛋白酶水解后，因胃蛋白酶與胰蛋白酶對肽鏈作用位點(diǎn)不同，在兩種酶協(xié)同作用下，其水解度達(dá)到（21.30±1.05）%，與胃部消化相比胃腸水解度增加了120.27%。李鵬飛[23]研究表明，在酶解作用下隨著植物蛋白DH 增加，酶解產(chǎn)物平均分子質(zhì)量通常也會(huì)降低，并且低分子質(zhì)量水解產(chǎn)物具有更好的抗氧化性能。

圖1 不同消化時(shí)期溶解度（a）及水解度（b）變化Fig.1 The change of solubility （a） and degree of hydrolysis （b） in different digestion periods

2.2 蕓豆蛋白及消化產(chǎn)物SDS-PAGE 電泳分析

蕓豆蛋白及模擬胃腸消化產(chǎn)物電泳圖譜如圖2所示。蕓豆蛋白分子質(zhì)量分布在66 ku 以下，其中45 ku 亞基條帶主要是球蛋白[24]，31～20 ku 處存在的幾條亞基條帶，可能為蕓豆蛋白中的小分子球蛋白和植物凝集素[25]。從圖2可以看出：蕓豆蛋白經(jīng)過胃部模擬消化后，因酶解作用45 ku 亞基條帶明顯減小，但仍然存在未被酶解的球蛋白，這可能是部分球蛋白在胃部酸性條件下，以二聚體或三聚體形式穩(wěn)定存在，胃蛋白酶較難將其完全水解所致[26]；在31～20 ku 處存在的幾條亞基條帶經(jīng)胃蛋白酶水解成＜20 ku 小分子肽段，但蛋白水解不完全仍有條帶殘留。在經(jīng)歷腸道消化后，在胃蛋白酶與胰蛋白酶協(xié)同作用下45 ku 球蛋白亞基條帶繼續(xù)減小，并且胃部未完全消化的31～20 ku的亞基條帶會(huì)繼續(xù)發(fā)生水解作用，使＜14.4 ku 亞基條帶明顯加深。由此可知，腸部消化產(chǎn)物平均分子質(zhì)量與胃部相比明顯降低。

圖2 紫花蕓豆蛋白及模擬胃腸消化產(chǎn)物SDS-PAGE 圖譜Fig.2 SDS-PAGE profile of purple kidney bean protein and simulated gastrointestinal digestion products

2.3 蕓豆分離蛋白及消化產(chǎn)物抗氧化活性分析

不同酶作用的肽鏈位點(diǎn)不同，隨著水解度與溶解度升高，肽鏈被酶切割變短，小分子肽段增加，水解液的抗氧化性能增強(qiáng)[27]。蕓豆蛋白模擬消化在不同時(shí)期抗氧化活性變化如表1所示。

從表1可知，蕓豆蛋白總抗氧化為（0.66±0.12）mg prot/mL，經(jīng)胃部及胃腸消化后，總抗氧化能力呈現(xiàn)不斷上升趨勢。胃部消化過程中，總抗氧化能力達(dá)到（2.45±0.36）mg prot/mL，與蕓豆蛋白相比提升了271.21%，經(jīng)過腸部消化結(jié)束后，總抗氧化能力達(dá)到（3.07±0.41）mg prot/mL，與胃部消化相比總抗氧化能力進(jìn)一步提升了25.31%。蕓豆蛋白消化產(chǎn)物鐵還原能力、ABTS 清除率在經(jīng)歷胃腸不同消化時(shí)期也呈現(xiàn)了上升趨勢。這表明蕓豆蛋白經(jīng)歷胃腸消化后，胃蛋白酶和胰蛋白酶對蕓豆蛋白水解的位點(diǎn)不同，共同作用下水解蕓豆蛋白使蛋白水解生成更多的小分子多肽并暴露了具有特異性酶切位點(diǎn)[28]，使消化產(chǎn)物中的小分子多肽與ABTS+、鐵離子更好的發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，提升了消化產(chǎn)物的鐵還原能力、ABTS+清除率。

表1 蕓豆蛋白及消化產(chǎn)物抗氧化測定Table 1 Antioxidant determination of kidney bean protein and digested products

與胃部消化后的蛋白水解物相比，進(jìn)一步腸部消化后蕓豆蛋白水解物的DPPH 清除能力略有降低，并且差異性顯著。這是胃部消化水解后，一些肽被分解成小片段暴露出部分疏水性氨基酸殘基，DPPH 自由基被穩(wěn)定，而經(jīng)過腸部消化后疏水性氨基酸減少，親水性氨基酸增多，難以與脂溶性DPPH 自由基結(jié)合[29]，這與表3疏水性氨基酸變化一致。

2.4 不同分子質(zhì)量的蕓豆蛋白模擬胃腸道消化產(chǎn)物的抗氧化能力分析

為深入研究經(jīng)胃腸模擬消化后抗氧化能力的分布情況，通過超濾分級(jí)四種不同分子質(zhì)量紫花蕓豆蛋白消化的抗氧化能力如圖3所示。從圖3a可知，消化0.5 h 時(shí)，分子質(zhì)量在100～50 ku 總抗氧化活性低于＜10 ku 的多肽，隨消化時(shí)間延長，兩者差距減小，但分子質(zhì)量＜10 ku 消化產(chǎn)物仍表現(xiàn)出最強(qiáng)總抗氧化能力，即小分子肽段顯示出較強(qiáng)抗氧化性。郭曉娟[30]對羽扇豆蛋白進(jìn)行超濾分析研究酶水解產(chǎn)物的總抗氧化能力時(shí)也發(fā)現(xiàn)，在＞10 ku、3～8 ku 和＜3 ku 3 個(gè)組分中，發(fā)現(xiàn)＜3 ku 分子質(zhì)量的胰酶水解產(chǎn)物表現(xiàn)出最強(qiáng)的總抗氧化能力。從圖3b～3d 可知，隨著分子質(zhì)量的減小以及消化時(shí)間的延長，鐵還原能力、DPPH 清除能力、ABTS清除能力也持續(xù)增加。但是在0.5 h 時(shí)，不同分子質(zhì)量鐵還原能力、DPPH 清除能力變化平緩，陳樹俊等[31]對核桃粉酶解、超濾后也發(fā)現(xiàn)，≤5 ku 的多肽的鐵還原能力、DPPH 清除能力均高于另外3 種多肽（5～10、10～30 和≥30 ku），說明此時(shí)蕓豆蛋白水解不完全，F(xiàn)e3+、脂溶性DPPH 與消化產(chǎn)物的螯合能力較弱。

圖3 不同分子質(zhì)量紫花蕓豆蛋白模擬胃腸道消化產(chǎn)物的抗氧化能力Fig.3 Different molecular weight purple kidney bean protein simulates the antioxidant capacity of gastrointestinal digestive products

2.5 蕓豆蛋白及胃腸消化產(chǎn)物MIR-FTIR 分析

經(jīng)紅外測定去卷積化處理后得蕓豆蛋白及消化產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)定量信息見表2。

由表2知，KPI 二級(jí)結(jié)構(gòu)中含量最高的是β-折疊，Byanju 等[32]分析4 種豆類蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化也發(fā)現(xiàn)α-螺旋不作為蕓豆蛋白的主要結(jié)構(gòu)，而β-結(jié)構(gòu)是蕓豆蛋白的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)。經(jīng)模擬胃腸道連續(xù)消化后，KPI 消化產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角含量先增加后減少，β-折疊先減少后增加，無規(guī)則卷曲含量減少。其中，隨著KPI 在胃部消化期間酶解程度不斷加深，與蕓豆蛋白相比，β-折疊變化顯著，由41.14%減少到34.63%，β-轉(zhuǎn)角含量大幅增加，表明胃蛋白酶的水解使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被展開，空間結(jié)構(gòu)上較為緊湊的β-折疊被破壞，轉(zhuǎn)變?yōu)檩^松散的β-轉(zhuǎn)角維持穩(wěn)定蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)[33]。在腸部消化期間，隨消化時(shí)間延長且消化環(huán)境由強(qiáng)酸性轉(zhuǎn)變?yōu)橹行裕|豆蛋白穩(wěn)定結(jié)構(gòu)重新恢復(fù)，β-折疊由34.63%增加到41.29%。曾琪等[34]研究pH 值處理對黑豆分離蛋白結(jié)構(gòu)時(shí)也同樣發(fā)現(xiàn)，pH 值由強(qiáng)酸性逐漸提升至近中性時(shí)，蛋白質(zhì)中β-折疊含量顯著上升，這與本文研究結(jié)果一致。

表2 酰胺I 帶擬合蕓豆蛋白及消化產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)組成Table 2 Amide I band fitting kidney bean protein and digestion product secondary structure composition

2.6 體外模擬消化期間蕓豆蛋白消化產(chǎn)物巰基含量變化分析

由圖4可知，與紫花蕓豆蛋白相比，消化后的暴露巰基、總巰基含量不斷下降。經(jīng)胃部消化后的暴露巰基、總巰基含量為 （5.85±0.29）μmol/g、（7.11±0.37）μmol/g，與蕓豆蛋白相比下降40.12%，36.69%，這是由于在胃部消化期間，蛋白分子水解后相互聚集，部分巰基形成二硫鍵，形成較為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致暴露巰基、總巰基含量下降；進(jìn)一步經(jīng)過腸道消化后，消化產(chǎn)物的暴露巰基、總巰基降至（4.94±0.23）μmol/g、（6.14±0.20）μmol/g，這可能是在胰蛋白酶作用下，蛋白分子進(jìn)一步舒展，巰基基團(tuán)間空間阻礙被解除，游離巰基之間易形成二硫鍵，進(jìn)而導(dǎo)致巰基含量降低。也有研究表明，半胱氨酸（Cys）含有活性巰基，經(jīng)過胃腸連續(xù)消化后半胱氨酸（Cys）含量降低也會(huì)導(dǎo)致巰基含量下降[35]，這與表3半胱氨酸含量變化相同。

圖4 紫花蕓豆蛋白及模擬消化期間消化產(chǎn)物的巰基含量變化Fig.4 Changes in sulfhydryl content of purple kidney bean protein and digested products during simulated digestion

2.7 模擬消化期間蕓豆蛋白胃腸消化產(chǎn)物游離氨基酸含量變化分析

蕓豆蛋白水解后，氨基酸從母體蛋白中釋放出來，Chen 等[36]發(fā)現(xiàn)His、Tyr、Cys 等許多氨基酸及其衍生物具有將電子轉(zhuǎn)移到自由基的能力，對蛋白水解液的抗氧化性有一定的提升作用。KPI及消化產(chǎn)物游離氨基酸含量變化如表3所示。

由表3可知，經(jīng)胃部消化后，與蕓豆蛋白相比，酶解作用水解出更多的游離氨基酸，必需氨基酸總量占總氨基酸含量的比例由14.903%增加到37.853%，而含硫氨基酸總量由2.73 μg/g 減少為2.67 μg/g，這與巰基含量變化趨勢（圖4）保持一致。疏水性氨基酸含量增幅明顯，由10.98 μg/g 增加到21.59 μg/g，這些氨基酸能夠使短肽與脂溶性自由基相互作用，進(jìn)而提高消化產(chǎn)物的抗氧化能力。與胃部消化相比，經(jīng)胰蛋白酶消化后，腸部消化產(chǎn)物含硫氨基酸總量由2.67 μg/g 減少為2.08 μg/g，必需氨基酸占比增多，這與肽鍵持續(xù)裂解導(dǎo)致較短肽（三肽和二肽）和游離氨基酸大量積累有關(guān)[37]。同時(shí)，胃部、腸部模擬消化的疏水性氨基酸含量變化與脂溶性DPPH 自由基清除變化趨勢相同（表1），表現(xiàn)為先增加后減少。

表3 蕓豆蛋白及消化產(chǎn)物游離氨基酸含量變化Table 3 Kidney bean protein and digestive products free amino acid content

2.8 掃描電鏡（SEM）圖像分析

紫花蕓豆蛋白及模擬消化產(chǎn)物的掃描電鏡圖如圖5所示。由圖5可以清晰直觀的觀察樣品的微觀外形構(gòu)造特點(diǎn)，蕓豆蛋白電鏡圖（圖5a）表面呈現(xiàn)密實(shí)光滑立體結(jié)構(gòu)。經(jīng)過胃部模擬消化后，蕓豆蛋白在酸性條件下變得松散無序，且在表面形成細(xì)密小孔，隨著水解進(jìn)行呈現(xiàn)絮狀聚集現(xiàn)象（圖5b）。經(jīng)腸道模擬消化后，與胃部消化相比，因在中性條件下蛋白微觀結(jié)構(gòu)有序性有所增加，消化產(chǎn)物表面呈現(xiàn)細(xì)密顆粒狀（圖5c）。由此可知，經(jīng)過胃部、腸道消化后，蛋白表面微觀結(jié)構(gòu)逐步發(fā)生明顯變化，表面變得無序、松散、粗糙多孔，并且蛋白結(jié)構(gòu)變化及小分子肽段產(chǎn)生從而改變了消化產(chǎn)物的抗氧化活性。

圖5 蕓豆蛋白（a）、模擬胃部消化2 h（b）及模擬腸部消化3 h（c）SEM 圖Fig.5 Kidney bean protein，simulated stomach digestion 2 h and simulated intestinal digestion 3 h SEM absorption spectrum

3 結(jié)論

紫花蕓豆蛋白在體外模擬消化過程中，蕓豆蛋白消化產(chǎn)物的溶解度、水解度顯著升高，腸道消化結(jié)束后溶解度、水解度分別達(dá)到（66.34±1.12）%、（21.30±1.05）%，與胃部消化相比水解度增加了120.27%，溶解度下降了3.46%。經(jīng)SDSPAGE 圖譜及抗氧化活性分析發(fā)現(xiàn)，蕓豆蛋白在腸道環(huán)境中持續(xù)水解導(dǎo)致消化產(chǎn)物平均分子質(zhì)量明顯降低，＜14.4 ku 亞基條帶明顯加深，與胃部模擬消化相比水解產(chǎn)物抗氧化能力顯著增強(qiáng)，總抗氧化能力、鐵還原能力、ABTS 清除率分別提升25.31%，85.76%，53.80%，而DPPH 清除能力下降了3.02%。對蕓豆蛋白酶解、超濾分級(jí)后發(fā)現(xiàn)，分子質(zhì)量＜10 ku 的多肽總抗氧化能力、鐵還原能力、DPPH 和ABTS 自由基清除能力顯著高于其它3種多肽（100～50 ku、50～30 ku、30～10 ku）。經(jīng)MIRFTIR 分析發(fā)現(xiàn)，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角含量先增加后減少，β-折疊先減少后增加，無規(guī)則卷曲含量減少。胃腸消化產(chǎn)物中暴露巰基、總巰基含量、含硫氨基酸總量隨水解程度增加持續(xù)下降，與胃部消化相比，腸部消化產(chǎn)物的暴露巰基、總巰基含量、含硫氨基酸總量分別下降了15.56%，13.64%，22.13%。SEM 掃描分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過體外模擬消化后，蛋白表面微觀結(jié)構(gòu)逐步發(fā)生明顯變化，表面變得無序、松散、粗糙多孔，與胃部消化相比經(jīng)腸道模擬消化后，蛋白微觀結(jié)構(gòu)有序性有所增加，消化產(chǎn)物表面呈現(xiàn)細(xì)密顆粒狀。