張坤 李芳 肖東杰 高德海 孫志軍 劉華

隨著細(xì)胞生物學(xué)的進(jìn)步，細(xì)胞治療作為一種新型療法登上歷史舞臺，其中間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）在新型冠狀病毒肺炎、脊髓損傷等難治性疾病中取得了顯著進(jìn)展［1-2］。MSC 已被證實(shí)可從多個(gè)組織器官中分離獲得。而取材臍帶及胎盤的MSC 由于無需采取有創(chuàng)性操作，屬于產(chǎn)后醫(yī)療廢棄物，其體外提取簡單，不受倫理限制，低免疫源性，成為較好的MSC 種子細(xì)胞來源。不同組織來源和培養(yǎng)條件的MSC 具有不同的生物學(xué)特性，這成為影響MSC 藥品研發(fā)的挑戰(zhàn)與難點(diǎn)。近年來，有研究比較了不同MSC 的生物學(xué)特性，例如擴(kuò)增能力、表面標(biāo)記能力、多向分化能力、免疫調(diào)節(jié)及基因表達(dá)差異等［3-4］。盡管MSC 的具體治療機(jī)制尚不清楚，但MSC 分泌的細(xì)胞因子在促進(jìn)組織再生和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答方面都發(fā)揮重要作用［5］。

本研究的目的是使用人細(xì)胞因子芯片檢測臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UC-MSC）與胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞（P-MSC）細(xì)胞因子的分泌情況。細(xì)胞因子表達(dá)水平的檢測，有助于更好地探索MSC 的作用機(jī)制，為臨床選擇MSC 類型提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

材料與方法

一、試劑與耗材

MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA、重組堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、表皮生長因子（EGF）均購自美國Gibco 公司，膠原酶Ⅰ購自美國Worthington公司。鼠抗人單克隆抗體CD13-PE、CD34-PE、CD44-PE、CD45-FITC、CD73-PE、CD90-PE、CD105-FITC、HLA-DR-FITC 均購自美國BD 公司。油紅O、茜素紅S 染色試劑購自武漢谷歌生物科技有限公司，硝酸銀試劑購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。OriCellTMMSC 成脂/成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒購自廣州賽業(yè)生物科技有限公司公司。TGF-β1、ICAM-1 ELISA 試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，IL-1β ELISA 試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。RNAex Pro Reagent、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自湖南艾科瑞生物工程有限公司，UltraSYBR Mixture 試劑購自北京康為世紀(jì)公司。細(xì)胞因子（QAH-CAA-1000）芯片購自瑞博奧（廣州）生物科技股份有限公司。

二、方 法

1. MSC 的分離培養(yǎng)

人體組織標(biāo)本采集已獲得濟(jì)南市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（2021-093-02），樣本采集前獲得所有供者知情同意，臍帶取自山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬中心醫(yī)院產(chǎn)科，通過貼壁法獲得UC-MSC［6］。P-MSC來自山東醫(yī)科元多能干細(xì)胞生物工程有限公司。每組經(jīng)分離得到7 株細(xì)胞，P5 代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2. MSC 的多向分化能力鑒定

MSC 以4×104或2×104細(xì)胞/孔的密度接種于6 孔板中，按照說明書，在成脂或成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化液中培養(yǎng)14～21 d 后進(jìn)行油紅O、硝酸銀和茜素紅S 染色，顯微鏡下拍照。使用ImageJ 軟件進(jìn)行定量分析。

3. MSC 的流式細(xì)胞術(shù)鑒定

消化后的MSC 加入下列抗體：FITC-HLA-DR、PE-CD34、FITC-CD45、PE-CD13、PE-CD44、PECD73、PE-CD90、FITC-CD105。孵育20 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗1 次，BD FACSCalibur 流式細(xì)胞儀檢測，F(xiàn)lowJo 軟件進(jìn)行分析。

4.細(xì)胞培養(yǎng)上清的獲取

將MSC 以4×105細(xì)胞/孔的密度接種于6 孔板中。細(xì)胞貼壁用PBS 洗滌兩次，加入含有2%FBS 的MEM 中培養(yǎng)。收集48 h 的條件培養(yǎng)基，1107×g 離心10 min，上清-80 ℃保存。

5.細(xì)胞因子的芯片檢測

按照說明書檢測上清液中80 種細(xì)胞因子的表達(dá)量。采用激光掃描儀掃描信號，使用QAHCAA-1000 的數(shù)據(jù)分析軟件來分析。

6.差異表達(dá)蛋白（DEP）篩選及KEGG 通路富集分析

檢測的原始數(shù)據(jù)用軟件歸一化后進(jìn)行DEP 篩選。篩選條件如下：①logFC ＞ log2（1.2），差異閾值為1.2；②校正后P ＜ 0.05，并以聚類熱圖進(jìn)行可視化。對分泌量前20 的細(xì)胞因子進(jìn)行KEGG通路富集分析。挑選的標(biāo)準(zhǔn)是落在某個(gè)KEGG 上細(xì)胞因子數(shù)目≥2， P ＜ 0.05，取前20 個(gè)富集的信號通路結(jié)果制圖。

7. ELISA 檢測細(xì)胞因子的表達(dá)

為驗(yàn)證芯片檢測結(jié)果，使用人ELISA 試劑盒按照說明書分別檢測培養(yǎng)上清中IL-1β、人細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）和TGF-β1 的表達(dá)水平。每個(gè)樣品做3 個(gè)復(fù)孔。

8.實(shí)時(shí)PCR（RT-PCR）檢測相關(guān)基因的表達(dá)

TRIzol 法抽提MSC 總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒按步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA 為模板，引物序列見表1，分別擴(kuò)增，以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）作為PCR 的內(nèi)參基因。RT-PCR 反應(yīng)條件：95 ℃10 min，95 ℃ 15 s，63 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。

表1 引物列表

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

芯片數(shù)據(jù)使用來自Bioconductor 的limma 分析，2 組比較采用moderated t 檢驗(yàn)。本文其他數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，比較采用t 檢驗(yàn)。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。柱狀圖均采用GraphPad Prism 6 軟件繪制，圖像分析采用ImageJ 軟件分析。

結(jié) 果

一、MSC 分化能力比較

流式細(xì)胞術(shù)檢測P5 代MSC 細(xì)胞表面標(biāo)志物，結(jié)果顯示UC-MSC 和P-MSC 高表達(dá)CD13、CD44、CD73、CD90 和CD105（＞ 95%），低表達(dá)HLA-DR、CD34 和CD45（＜ 2%）。兩種MSC 表面標(biāo)志物的表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞ 0.05），見表2。

表2 流式細(xì)胞術(shù)檢測MSC 的表面標(biāo)志物表達(dá)（n = 7）

光鏡下觀察UC-MSC 和P-MSC 細(xì)胞呈長梭形，經(jīng)過3 周的成脂和成骨誘導(dǎo)分化，油紅O 染色可以觀察到MSC 呈橘紅色，有脂滴形成。硝酸銀及茜素紅S 染色可以在MSC 細(xì)胞質(zhì)中觀察到黑色和橘紅色的鈣鹽沉積。這說明人臍帶及胎盤來源的MSC 均具有成脂和成骨分化能力。脂肪細(xì)胞及骨鈣化結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)顯示兩種細(xì)胞成脂（t = 1.370，P =0.220）、成骨（t = 2.252，P = 0.065）分化能力差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞ 0.05），見圖1。

圖1 UC-MSC 和P-MSC 的培養(yǎng)形態(tài)及多向分化潛能

二、UC-MSC 和P-MSC 細(xì)胞因子分泌的表達(dá)

收集條件培養(yǎng)基，通過芯片分析80 種細(xì)胞因子的相對表達(dá)水平。芯片結(jié)果顯示，UC-MSC 與P-MSC 上清中前10 位高表達(dá)細(xì)胞因子依次為胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4（IGFBP-4）、IGFBP-3、IGFBP-6、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP）-1和TIMP-2、IL-6、TGF-β1、 肝 細(xì) 胞 生 長 因 子（HGF）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）和人細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）；低表達(dá)或不表達(dá)的因子依次為EGF、IL-17、IL-12p40、B 淋巴細(xì)胞趨化因 子（BLC）、TNF-β、IL-13、MIP-1δ、Eotaxin-2、IL-12p70、血小板衍生生長因子-BB（PDGF-BB），見表3、4。

表3 芯片檢測MSC 細(xì)胞因子表達(dá)前10 位（n = 3） 單位：pg/mL

表4 芯片檢測MSC 細(xì)胞因子表達(dá)后10 位（n = 3） 單位：pg/mL

三、篩選UC-MSC 和P-MSC 分泌細(xì)胞因子的DEP 及KEGG 通路富集分析

比較UC-MSC 和P-MSC 上清中細(xì)胞因子差異，發(fā)現(xiàn)有5 個(gè)DEP，分別為TNFRⅡ、干細(xì)胞因子（SCF）、神經(jīng)生長因子受體（NGFR）、TGF-β3 和IL-1β（P 均＜ 0.05，圖2A）。

利用clusterProfiler 軟件包對分泌量前20 的細(xì)胞因子進(jìn)行KEGG 通路富集分析，觀察這些因子在信號通路中的富集情況。選取前20 個(gè)富集的信號通路，分析發(fā)現(xiàn)分泌量前20 的細(xì)胞因子主要富集在“細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用”“TNF信號通路”和“MAPK 信號通路”等通路（P ＜ 0.05，圖2B）。

圖2 UC-MSC 和P-MSC 分泌細(xì)胞因子的聚類熱圖和KEGG 通路富集分析

四、ELISA 和RT-PCR 驗(yàn)證芯片檢測結(jié)果

通過ELISA 檢測條件培養(yǎng)基中細(xì)胞因子的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，UC-MSC 和P-MSC 表達(dá)量較高的兩個(gè)因子TGF-β1（t = 1.976，P = 0.119）、ICAM-1（t = 0.953，P = 0.377）兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P-MSC 的IL-1β 水平高于UC-MSC（t =5.176，P = 0.001）（圖3A）。此外，RT-PCR 檢測結(jié)果表明，UC-MSC 與P-MSC 相比，基因TGF-β3（t = 4.090，P = 0.002）、SCF（t = 3.552，P = 0.005）和TNFRⅡ（t = 2.374，P = 0.039）表達(dá)水平較高。IL-1β 基因在P-MSC 中的表達(dá)水平高于UC-MSC（t = 3.546，P = 0.005）。TGF-β1（t = 0.774，P =0.457）、ICAM-1（t = 1.008，P = 0.331）基因在UC-MSC 和P-MSC 之間表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3B）。ELISA 和RT-PCR 結(jié)果與細(xì)胞因子芯片結(jié)果一致。

圖3 ELISA 和RT-PCR 檢測相關(guān)因子及基因表達(dá)

討 論

由于MSC 具有自我更新、多向分化潛力和旁分泌作用，被認(rèn)為是再生醫(yī)學(xué)干細(xì)胞治療的重要種子細(xì)胞。迄今為止，骨髓MSC（BM-MSC）、脂肪MSC（A-MSC）、UC-MSC 和P-MSC 是臨床研究中最常用的干細(xì)胞［7-8］。有薈萃分析比較了不同來源的MSC 在臨床治療中的效果，發(fā)現(xiàn)不同來源的MSC 在臨床研究中發(fā)揮不同的治療作用［9-10］。

在本研究中，筆者團(tuán)隊(duì)采用相同的培養(yǎng)基，從人的胎盤和臍帶組織中分離獲得MSC。通過形態(tài)觀察，流式細(xì)胞儀分析和誘導(dǎo)分化，UC-MSC 和P-MSC 表現(xiàn)出相似的形態(tài)、表面標(biāo)志物和分化潛能。這與Li 等（2014 年）的研究結(jié)果一致。

最近研究表明，MSC 可以通過旁分泌因子來促進(jìn)鄰近細(xì)胞的增殖和分化能力［11-12］。有研究檢測了不同MSC 的細(xì)胞因子表達(dá)，如 HGF、bFGF、血管細(xì)胞黏附分子-1 和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）［13-14］。但目前還沒有系統(tǒng)地研究不同MSC 分泌的細(xì)胞因子。在本研究中，使用細(xì)胞因子芯片檢測兩種MSC 分泌的80 種細(xì)胞因子，結(jié)果顯示人胎盤與臍帶MSC 分泌的細(xì)胞因子基本一致。Park 等［15］檢測了BM-MSC 分泌的120 種細(xì)胞因子，高表達(dá)IL-6、IL-8、TIMP-2、MCP-1、VEGF和骨保護(hù)素，與本研究高表達(dá)細(xì)胞因子不同，可見不同組織來源的MSC在細(xì)胞因子分泌上存在差異。也有研究用ELISA 檢測UC-MSC 和P-MSC 中TGF-β1、HGF、VEGF 和EGF 的表達(dá)量，兩種MSC 的表達(dá)沒有差異，與筆者團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)果相同［13-14］。而在Wu 等［13］的研究中發(fā)現(xiàn)UC-MSC 分泌的bFGF 高于P-MSC，分泌的SCF 低于P-MSC，這與本研究的結(jié)果不同，這可能與胎盤的取材部位有關(guān)，他們的MSC 取自胎盤的蛻膜，本研究的則取自絨毛膜。

UC-MSC 和P-MSC 高分泌的細(xì)胞因子IGFBP，是一類與IGFs 有高度親和力并調(diào)控其作用的蛋白，IGFBP-4 能增強(qiáng)神經(jīng)元祖細(xì)胞的分化［16］。IGFBP-3是一種不穩(wěn)定的親水性蛋白，可調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、蛋白質(zhì)磷酸化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等。已有研究證明IGFBP-3 可以誘導(dǎo)血管生成［17］。IGFBP-6影響MSC 多能性和肌原性分化［18］。MSC 大量分泌的IGFBP 可能在血管生成及神經(jīng)和肌肉修復(fù)方面發(fā)揮作用。TIMP 可以通過抑制MMPs 來調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的重塑。Clarke 等（2015 年）發(fā)現(xiàn)TIMP-1和TIMP-2 可以減少M(fèi)SC 的遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞增殖并發(fā)揮抗凋亡的作用。TGF-β1 是TGF-β 超家族的關(guān)鍵成員，Li 等（2015 年）認(rèn)為MSC 分泌的TGF-β1 能降低T 細(xì)胞增殖，以幫助治療免疫性疾病。同時(shí)筆者團(tuán)隊(duì)前期研究顯示MSC 通過激活TGF-β1/Smad3/PLOD2 通路改善脊髓損傷后的功能恢復(fù)［19］。HGF 在細(xì)胞增殖分化，組織纖維化，腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥等方面起著重要作用。Yang（2015 年）發(fā)現(xiàn)MSC 可以通過旁分泌HGF穩(wěn)定急性肺損傷中的內(nèi)皮屏障功能。ICAM-1 是黏附Ig 超家族的成員，可以促進(jìn)MSC 歸巢至靶器官，并增強(qiáng)在炎癥性腸病和GVHD 模型中的免疫抑制作用［20］。有研究發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中MSC 通過ICAM-1 的表達(dá)來促進(jìn)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成，從而有助于帕金森病的恢復(fù)［21］。MSC 通過分泌大量的細(xì)胞因子在修復(fù)受損組織，促進(jìn)組織分化再生，免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮作用。Manochantr 等（2013 年）研究報(bào)道，在體外UC-MSC 和P-MSC具有相似的免疫抑制功能。在小鼠模型中，UCMSC 和P-MSC 對預(yù)防GVHD 發(fā)生具有相似的效果［22］。

本研究KEGG 通路富集分析UC-MSC 和P-MSC高表達(dá)的細(xì)胞因子，發(fā)現(xiàn)這些因子主要富集在“細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用”“TNF 信號通路”“MAPK 信號通路”等通路中，這些信號通路介導(dǎo)多種細(xì)胞過程，參與細(xì)胞增殖、分化、衰老、凋亡、免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)［23-24］。聚 類 熱 圖表明UC-MSC 和P-MSC 分泌的細(xì)胞因子基本一致，僅有5 個(gè)DEP，分別為TNFRⅡ、SCF、NGFR、TGF-β3 和IL-1β。在差異表達(dá)的細(xì)胞因子中，已有的研究證明TNFRⅡ?qū)S持MSC 再生功能，例如傷口愈合、內(nèi)皮促血管生成支持有重要作用，能夠改善阿爾茨海默病，是MSC 免疫和再生功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［25］。有研究證明TGF-β3 在體外能夠誘導(dǎo)MSC 向軟骨分化［26］。同時(shí)TGF-β3 能促進(jìn)MSC的肌腱分化能力［27］。雖然兩種MSC 在因子表達(dá)上略有差異，但其分泌量較少，且在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮的作用尚值得商榷。

本研究在體外培養(yǎng)條件下比較了UC-MSC 和P-MSC 細(xì)胞因子分泌情況，細(xì)胞因子表達(dá)情況大致相同，關(guān)于UC-MSC 和P-MSC 移植后在不同疾病模型中，是否分泌相似的細(xì)胞因子，尚需要進(jìn)一步研究。