余美玲 馬翔 董淑英 童旭輝

肝細(xì)胞癌（肝癌）是我國(guó)第四高發(fā)的惡性腫 瘤，其致死率在所有惡性腫瘤中排名第二［1］。細(xì)胞縫隙連接（GJ）是細(xì)胞之間的一種蛋白質(zhì)連接通道，由特殊的通道蛋白［連接蛋白（Cx）］組成［2］。研究顯示，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程往往伴隨著Cx表達(dá)的降低或者缺失，而上調(diào)或恢復(fù)腫瘤細(xì)胞中的Cx 表達(dá)水平，可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化，降低細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，逆轉(zhuǎn)耐藥［3-6］。Cx32在正常肝細(xì)胞表達(dá)的主要連接蛋白中占90%，是肝細(xì)胞縫隙連接最主要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［7］。在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，Cx32 表達(dá)水平會(huì)明顯下降［7］。Src/局部黏著斑激素（FAK）信號(hào)通路在多種腫瘤細(xì)胞中持續(xù)性激活，Src 是一種相對(duì)分子量為60 kDa 的非受體酪氨酸激酶。對(duì)于人源的Src 而言，主要的磷酸化位點(diǎn)包括激酶區(qū)負(fù)責(zé)活化的pTyr416位點(diǎn)和C 端尾鏈抑制性的pTyr530 位點(diǎn)。當(dāng)激活時(shí)，Src 在酪氨酸殘基 416 位點(diǎn)自磷酸化，因此在本研究中主要分析了p-Src Y416 的表達(dá)水平。Src可以激活Src 蛋白的細(xì)胞質(zhì)復(fù)合物蛋白，如FAK。人FAK 含有6 個(gè)可以被磷酸化的酪氨酸，Tyr397、Tyr407、Tyr576、Tyr577、Tyr861、Tyr925。 筆 者在前期研究證實(shí)，肝癌細(xì)胞中Cx32 是Src/FAK 信號(hào)通路的上游調(diào)控因子［4］。為進(jìn)一步探討Cx32、Src/FAK 信號(hào)通路在預(yù)測(cè)肝癌患者預(yù)后中的作用，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上對(duì)97 例接受肝癌根治性手術(shù)的患者進(jìn)行隨訪，分析肝癌組織中Cx32、Src/FAK 的表達(dá)水平與患者預(yù)后之間的關(guān)系。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

收集2014 年1 至12 月在蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科接受根治性手術(shù)的97 例患者的肝癌組織標(biāo)本和相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本（距離肝癌病灶2 cm 的肝組織）。所有標(biāo)本均經(jīng)中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋， 5 μm 厚連續(xù)切片。所有患者術(shù)前都未接受放射治療、化學(xué)治療和免疫治療等相關(guān)治療。對(duì)患者進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間至2019 年12月，最終入組97 例。本研究方案經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)：［2020］第120 號(hào)），患者均已簽署知情同意書(shū)。

二、方 法

1. 臨床資料收集

收集97 例患者的臨床資料，包括年齡、性別、是否肝硬化、是否乙型肝炎、腫瘤最長(zhǎng)直徑、有無(wú)包膜、甲胎蛋白水平、腫瘤分化程度、生存與否或死亡時(shí)間。分層分析時(shí)將肝癌分化程度依據(jù)《肝臟活檢病理解讀（第2 版）》分為高分化（肝癌組織接近正常組織，惡性程度低）、中分化（肝癌組織與正常組織差別不大，中度成熟，中度惡性程度）、低分化（肝癌組織與正常組織相差大，成熟度差，惡性度高）3 種情況；根據(jù)甲胎蛋白水平分為 ≤400 μg/L 和＞ 400 μg/L 2 種情況。

2. 免疫組織化學(xué)（免疫組化）染色法檢測(cè)

使用免疫組化染色法檢測(cè)Cx32、磷酸化-Src（p-Src）Y416、 總Src（total Src）、 磷 酸 化FAK（p-FAK）Y925、總FAK（total FAK）在肝癌組織以及相應(yīng)癌旁組織中的蛋白表達(dá)：取病理組織切片脫蠟，梯度乙醇水化，枸櫞酸鹽緩沖液（pH =6.0）高溫修復(fù)，3% 過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶后滴加血清封閉；然后將切片與一抗在4 ℃孵育過(guò)夜，復(fù)溫后滴加二抗室溫下孵育 15 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色5 min；蘇木精復(fù)染，脫水透明后中性樹(shù)膠封片。以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：＜5%為（-），5%～10% 為（+），11%～50% 為（++），51%～75%為（+++），＞75%為（++++）［8］。分層分析時(shí)將不表達(dá)和表達(dá)（+）歸為低表達(dá)，表達(dá)（++ ～++++）歸為高表達(dá)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 20.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)。采用單因素Cox 回歸分析收集到的肝癌手術(shù)患者的各項(xiàng)指標(biāo)與肝癌術(shù)后患者的生存預(yù)后是否有關(guān)。將單因素Cox 回歸分析結(jié)果中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)納入多因素Cox 回歸模型（納入法），分析肝癌術(shù)后患者生存的影響因素。通過(guò)繪制生存曲線(xiàn)（Kaplan-Meier 法）以及對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)（Log-rank test）探討Cx32、p-Src Y416、p-FAK Y925 蛋白表達(dá)與患者生存時(shí)間的關(guān)系。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、研究對(duì)象的基本信息

97 例肝癌患者中，男72 例、女25 例，年齡25～78 歲、中位年齡55 歲；肝硬化77 例（79%），乙型肝炎66 例（68%）；甲胎蛋白＞ 400 μg/L 28例（29%）；低分化17 例（18%），中分化70 例（72%），高分化10 例（10%）；肝癌標(biāo)本無(wú)包膜82 例（85%）；腫瘤最大直徑＞ 5 cm 54 例（56%）；隨 訪5 年 最 終 生 存55 例（57%）， 死 亡42 例（43%）。

二、Cx32、Src/FAK 蛋白在肝癌組織以及相應(yīng)的癌旁組織中的表達(dá)情況

免疫組化染色結(jié)果顯示，肝癌組織的Cx32蛋白表達(dá)陽(yáng)性率低于相應(yīng)的癌旁組織，其p-Src Y416、 total Src、 p-FAK Y925、total FAK 的蛋白表達(dá)陽(yáng)性率均高于相應(yīng)的癌旁組織（P 均＜ 0.05），見(jiàn)表1 及圖1。97 例肝癌組織以及相應(yīng)癌旁組織中各蛋白的具體表達(dá)情況見(jiàn)表2。

圖1 肝癌組織與癌旁組織的Cx32、p-Src Y416、p-FAK Y925、total Src、total FAK 蛋白表達(dá)比較（免疫組化染色，×200）

表1 97 例肝癌組織以及相應(yīng)的癌旁組織中Cx32、Src/FAK 蛋白的表達(dá)情況［例（%）］

表2 97 例肝癌組織以及相應(yīng)的癌旁組織中Cx32、Src/FAK 蛋白的具體表達(dá)情況［例（%）］

三、97 例肝癌根治性術(shù)后患者死亡的單因素和多因素Cox 回歸分析結(jié)果

單因素回歸分析顯示，肝癌患者死亡有8 項(xiàng)可疑影響因素，分別為年齡、腫瘤分化程度、腫瘤直 徑、Cx32、p-Src Y416、total Src、p-FAK Y925、total FAK 蛋白的表達(dá)（P 均＜ 0.05）。多因素回歸分析顯示，性別、甲胎蛋白＞ 400 μg/L、乙型肝炎、包膜、腫瘤長(zhǎng)徑和total FAK 的蛋白表達(dá)均非肝癌患者死亡的影響因素（P 均＞ 0.05）。高表達(dá)Cx32 的肝癌患者死亡的風(fēng)險(xiǎn)可能為低表達(dá)Cx32 患者的12%（P ＜ 0.05）；高表達(dá)p-Src 的肝癌患者死亡的風(fēng)險(xiǎn)是低表達(dá)p-Src 肝癌患者的14.306 倍（P＜ 0.05）；高表達(dá)p-FAK 的肝癌患者死亡的風(fēng)險(xiǎn)是低表達(dá)p-Src 肝癌患者的12.152 倍（P ＜ 0.05）。另外，年齡和高表達(dá)Total Src 為獨(dú)立危險(xiǎn)因素，中分化（與低分化對(duì)照）為獨(dú)立保護(hù)因素（P 均＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 97 例肝癌患者單因素和多因素分析結(jié)果

四、Cx32、p-Src Y416、p-FAK Y925 與97例肝癌術(shù)后患者總體生存時(shí)間的關(guān)系

生存分析顯示，肝癌患者中Cx32 高表達(dá)者與Cx32 低表達(dá)者的生存率分別為46.39%、10.31%（log-rankχ2= 23.856，P ＜ 0.001）；p-Src Y416 低表達(dá)者與p-Src 高表達(dá)者的生存率分別為45.36%、11.34%（log-rankχ2= 56.637，P ＜ 0.001）；p-FAK Y925 低表達(dá)者與p-FAK Y925 高表達(dá)者的生存率分別為42.27%、14.43%（log-rankχ2= 43.599，P ＜0.001），見(jiàn)圖2。

圖2 Cx32、p-Src Y416、p-FAK Y925 的生存曲線(xiàn)（Kaplan-Meier 法）

討 論

Cx32 是肝癌細(xì)胞最主要的連接蛋白。研究證實(shí)，Cx32 表達(dá)下降會(huì)促進(jìn)肝癌的進(jìn)展、化學(xué)治療耐藥，提高腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移能力［3-4，7］。但Cx32能否作為肝癌的預(yù)后預(yù)測(cè)因子還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。Sheen 等（2004 年）的研究顯示，低表達(dá)Cx32 mRNA 的肝癌術(shù)后患者預(yù)后差，但該研究樣本量?jī)H34 例。本研究共收集并成功隨訪97 例肝癌患者，驗(yàn)證了與低表達(dá)Cx32 的患者相比，高表達(dá)Cx32 可能是肝癌患者術(shù)后死亡的獨(dú)立保護(hù)因素，Cx32 有望成為預(yù)測(cè)肝癌術(shù)后患者預(yù)后的標(biāo)志蛋白。

Src/FAK 信號(hào)通路在多種腫瘤細(xì)胞中持續(xù)性激活［9-10］。Src 在細(xì)胞外可以激活Src 蛋白的細(xì)胞質(zhì)復(fù)合物蛋白，如FAK 等，Src-FAK 復(fù)合物與許多底物的復(fù)合物相互作用，包括Crk 相關(guān)基質(zhì)、樁蛋白和p190RhoGAP， 他們?cè)诩?xì)胞的生長(zhǎng)、增殖過(guò)程中起重要作用。Src 也可以通過(guò)SH2 區(qū)域與FAK的C 末端酪氨酸殘基結(jié)合而磷酸化而使FAK 激活，激活的FAK 調(diào)節(jié)B1 整聯(lián)蛋白的活性，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖。Src/FAK 信號(hào)通路的激活可促進(jìn)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、化學(xué)治療耐藥，筆者前期研究顯示，Src/FAK 信號(hào)通路的激活會(huì)促進(jìn)肝癌細(xì)胞對(duì)多柔比星產(chǎn)生耐藥［4］。但Src/FAK 信號(hào)通路與肝癌患者生存預(yù)后的關(guān)系仍有待于進(jìn)一步探討。Chen 等（2011 年）的研究顯示高表達(dá)的p-Src Y416 是肝癌患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，低表達(dá)患者有更長(zhǎng)的生存期。本研究顯示，高表達(dá)p-Src Y416、p-FAK Y925 是肝癌患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，進(jìn)一步明確了Src/FAK 信號(hào)通路與肝癌術(shù)后患者生存預(yù)后的關(guān)系。

結(jié)合筆者既往研究，本研究表明Src 是Cx32在腫瘤細(xì)胞中重要的下游調(diào)控因子。Sato 等（2007年）研究顯示，Cx32 可以通過(guò)抑制腎癌細(xì)胞Src的活性而抑制腫瘤的侵襲；Fujimoto 等（2005 年）通過(guò)Src-STAT3 信號(hào)通路抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的血管生成；Hada 等（2006 年）研究顯示，Cx32 通過(guò)抑制A549 肺腺癌細(xì)胞Src 的活性而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移；Sato 等（2013 年）研究表明Cx32 還可以通過(guò)抑制Src 的活性來(lái)增加長(zhǎng)春堿在人腎細(xì)胞癌中的毒性作用。上述研究均說(shuō)明，Cx32 可通過(guò)影響Src 的活性而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移以及化學(xué)治療的細(xì)胞毒性。但在肝癌細(xì)胞中Cx32 如何調(diào)控Src/FAK 信號(hào)通路尚未闡明。Finn 等（2008 年）報(bào)道，Src 能被胞質(zhì)中的蛋白激活，因此推測(cè)隨著肝癌的發(fā)生、發(fā)展、耐藥的發(fā)生，Cx32 會(huì)從細(xì)胞膜上異位至胞質(zhì)中，從而激活Src，下一步我們將進(jìn)行研究驗(yàn)證該推測(cè)。

由于本研究中Cox 多因素回歸分析中，高表達(dá)Cx32 對(duì)肝癌術(shù)后患者的影響P 值為0.049，故本研究進(jìn)一步分析Cx32、Src/FAK 信號(hào)通路與接受肝癌根治性手術(shù)后患者生存預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示，低表達(dá)Cx32、高表達(dá)p-Src Y416、p-FAK Y925 患者生存預(yù)后差，患者中位生存期明顯縮短，Cx32、p-Src Y416、p-FAK Y925 可能為肝癌術(shù)后患者預(yù)后的標(biāo)志。

本研究雖初步證實(shí)了肝癌組織中低表達(dá)Cx32、高表達(dá)p-Src Y416、p-FAK Y925 是肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但樣本量仍偏小，后續(xù)研究中將繼續(xù)增加樣本量，收集多中心的臨床數(shù)據(jù)和標(biāo)本，并設(shè)置更長(zhǎng)的隨訪期，進(jìn)一步探討Cx32、Src/FAK 信號(hào)通路與肝癌術(shù)后患者臨床預(yù)后的關(guān)系，明確Cx32、p-Src Y416、p-FAK Y925 是否能作為肝癌術(shù)后患者預(yù)后的標(biāo)志蛋白。