譚春明 ，趙 旺 , ，馬振華 , ，于 剛

1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開(kāi)發(fā)中心，海南 三亞 572018

2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300

3. 三亞熱帶水產(chǎn)研究院，海南 三亞 572018

熱帶海參具有豐富的物種多樣性，是中國(guó)經(jīng)濟(jì)海參養(yǎng)殖開(kāi)發(fā)的物種資源庫(kù)。迄今全球被開(kāi)發(fā)利用的50多種食用經(jīng)濟(jì)海參中21種在中國(guó)海域有分布記錄，除溫帶種仿刺參(Apostichopus japonicus) 和海地瓜 (Acaudina molpadioides) 外，中國(guó)的食用經(jīng)濟(jì)海參種類多分布于南海，且主要分布于雷州半島以南海域，西南中沙海域是中國(guó)食用經(jīng)濟(jì)海參種類的集中分布區(qū)[1]。熱帶食用經(jīng)濟(jì)海參種類主要屬于刺參科和海參科，包括5個(gè)屬：刺參屬 (Stichopus)、梅花參屬 (Thelenota)、海參屬 (Holothuria)、輻肛參屬 (Actinopyga) 和白尼參屬 (Bohadschia)[2]。

海參沒(méi)有復(fù)雜的消化系統(tǒng)，也無(wú)獨(dú)立的消化腺，其消化道僅由口、咽、食道、胃、腸和排泄腔組成[3]。刺參 (S. japonicus) 的消化道管壁結(jié)構(gòu)主要由黏膜層、黏膜下層、肌層和外膜組成。其中，消化道黏膜層為單層或假?gòu)?fù)層上皮 (包含柱狀細(xì)胞、黏液細(xì)胞和立方細(xì)胞)；黏膜下層為疏松的結(jié)締組織；肌層由外環(huán)和內(nèi)縱兩部分組成；而扁平細(xì)胞及其下方薄層結(jié)締組織組成了外膜[4-6]。研究表明，多種海參具有夏眠現(xiàn)象，在此期間，其消化道的形態(tài)學(xué)和腸道功能發(fā)生顯著變化，進(jìn)而影響其自身生理指標(biāo)的變化[6]。溫度是誘導(dǎo)海參進(jìn)入休眠狀態(tài)的主要因素。通過(guò)對(duì)熱帶海參不同季節(jié)消化道指標(biāo)和組織學(xué)特征的研究，可以初步判斷熱帶海參是否具有冬眠現(xiàn)象。另外，海參的養(yǎng)殖池塘通常建在沿岸淺水區(qū)域，圍堰塘的面積較小、水體交換量有限，當(dāng)天氣發(fā)生劇烈變化時(shí)，養(yǎng)殖水體的環(huán)境條件 (如溫度、鹽度等) 會(huì)發(fā)生較大變化，嚴(yán)重抑制海參的生長(zhǎng)，可能出現(xiàn)排臟反應(yīng)或化皮現(xiàn)象，甚至導(dǎo)致海參大面積死亡[7-8]。通過(guò)調(diào)控養(yǎng)殖環(huán)境 (如溫度) 可以減少或消除海參因強(qiáng)烈應(yīng)激所帶來(lái)的不利影響，縮短休眠周期[9]。有研究指出，海參在休眠狀態(tài)下，除形態(tài)學(xué)發(fā)生變化外，其體內(nèi)消化和免疫相關(guān)酶活性也會(huì)發(fā)生顯著變化，如淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶、超氧化物歧化酶 (SOD) 和過(guò)氧化氫酶(CAT) 等，進(jìn)而對(duì)消化道功能產(chǎn)生影響[10-11]。

中國(guó)的紅腹海參 (H. edulis) 主要分布在海南島和東、中、西、南沙群島，棲息于岸礁沙底，為沉積食性海參，以珊瑚沙為食，偏好生境存在季節(jié)變化[12]。紅腹海參的生境也受水深的影響，如9月在水深6～10 m水域種群密度較大(2.65 頭·m-2)，相比水深3～6 m水域顯著增加[13]。斯里蘭卡海域的紅腹海參主要分布在10 m以淺水域，在水深12～15 m處減少，超過(guò)25 m又顯著增加[14]。紅腹海參在珊瑚礁中具有擾動(dòng)底質(zhì)生物、加速營(yíng)養(yǎng)鹽再生和保護(hù)、清潔珊瑚礁以及為其他生物提供棲息場(chǎng)所等作用[12]。然而，過(guò)度捕撈已導(dǎo)致熱帶海參的數(shù)量急劇下降，人工養(yǎng)殖迫在眉睫。為了揭示熱帶海參消化道應(yīng)對(duì)不同季節(jié)的響應(yīng)特性，本文探究了紅腹海參的攝食和生理狀況隨時(shí)間的變化，通過(guò)監(jiān)測(cè)不同季節(jié)海參的消化道指標(biāo) (活動(dòng)、飲食、濕質(zhì)量和消化道內(nèi)容物)、消化道組織學(xué)特征和相關(guān)酶活性的變化，為研究其環(huán)境適應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制及人工增養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用紅腹海參于2019年7月采捕自三亞西島，采捕時(shí)水溫為25 ℃。采捕后暫養(yǎng)于海南省陵水縣新村熱帶水產(chǎn)研究開(kāi)發(fā)中心。紅腹海參養(yǎng)殖過(guò)程中水質(zhì)參數(shù)：鹽度33±0.8，溶解氧質(zhì)量濃度大于 6.5 mg·L-1，pH 8.0±0.2，亞硝酸鹽質(zhì)量濃度小于 0.03 mg·L-1，氨氮質(zhì)量濃度小于 0.01 mg·L-1。暫養(yǎng)期間每天按時(shí)定量投喂由鼠尾藻粉、馬尾藻粉、海泥、細(xì)沙和海參配合餌料按等比例配制而成的人工配合飼料，定期換水并及時(shí)清理糞便及殘餌，定時(shí)檢查水溫和海參的生長(zhǎng)狀況。測(cè)定各種酶活性所用的試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

分別在春 (3月)、夏 (6月)、秋 (9月)、冬 (12月) 4個(gè)季節(jié)對(duì)紅腹海參的消化道組織進(jìn)行取樣。

1.2.1 消化道指標(biāo)

定期稱取海參的濕質(zhì)量 (用毛巾吸干體表水分后稱質(zhì)量)、檢測(cè)消化道形態(tài)學(xué)變化 (消化道長(zhǎng)度、消化道和內(nèi)含物質(zhì)量)，并根據(jù)公式 (1) 計(jì)算消化道相對(duì)濕質(zhì)量。平均濕質(zhì)量、消化道相對(duì)濕質(zhì)量和消化道與體長(zhǎng)比均是當(dāng)季度所取海參的平均值 (N≥30)。

式中：R為消化道相對(duì)濕質(zhì)量；M1為去內(nèi)容物的消化道質(zhì)量；M2為消化道濕質(zhì)量。

1.2.2 組織學(xué)分析

對(duì)消化道組織取樣進(jìn)行切片，HE染色觀察：依次將切片放入二甲苯 (C8H10)Ⅰ 20 min、C8H10Ⅱ20 min、無(wú)水乙醇Ⅰ 10 min、無(wú)水乙醇Ⅱ 10 min，再用95%、90%、80%、70%乙醇清洗5 min，最后蒸餾水洗；將切片入Harris蘇木素 (C16H14O6)染3～8 min，自來(lái)水沖洗，1%的鹽酸乙醇分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗，0.6%氨水返藍(lán)，流水沖洗；切片入伊紅 (C20H6Br4Na2O5) 染液中染色1～3 min后，將切片依次放入95% 乙醇Ⅰ、95% 乙醇 Ⅱ、無(wú)水乙醇Ⅰ和無(wú)水乙醇Ⅱ 5 min，而后放入C8H10Ⅰ和C8H10Ⅱ中各5 min脫水透明，將切片拿出來(lái)稍晾干，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.2.3 酶活性測(cè)定

取紅腹海參腸道組織，用0.2 mol·L-1生理鹽水將樣品按質(zhì)量體積為1∶3的比例進(jìn)行研磨，研磨液于 4 ℃、5 000 r·min-1離心 10 min，取上清液1 mL 于潔凈EP管中，置于—80 ℃冰箱待測(cè)。利用相應(yīng)試劑盒測(cè)定淀粉酶、胃蛋白酶、纖維素酶、溶菌酶、CAT、堿性磷酸酶(ALP)、總超氧化物歧化酶 (T-SOD) 和過(guò)氧化物酶 (POX) 活性，各組均設(shè)3個(gè)平行。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用SPSS 21.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)單因素方差分析 (One-way ANOVA) 判斷處理組之間是否具有顯著差異，均值間的差異顯著性 (P＜0.05) 采用Duncan's法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 紅腹海參濕質(zhì)量與消化道等質(zhì)量的季節(jié)變化

紅腹海參在春、夏、秋季 (3、6和9月) 的濕質(zhì)量均有所上升，冬季 (12月) 可能因水溫影響了攝食而呈現(xiàn)輕微下降的趨勢(shì) (圖1-a)。從濕質(zhì)量看，其生長(zhǎng)極其緩慢；紅腹海參消化道相對(duì)濕質(zhì)量在夏、秋季分別為0.62和0.29，而在冬季上升至0.73 (圖1-b)。說(shuō)明夏、秋季紅腹海參攝食比較旺盛，未出現(xiàn)像刺參一樣的夏季休眠現(xiàn)象；不同季節(jié)紅腹海參消化道與體長(zhǎng)比呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)(圖1-c)，說(shuō)明不同季節(jié)溫度下熱帶海參腸道會(huì)發(fā)生變化，但未出現(xiàn)嚴(yán)重萎縮等退化現(xiàn)象。

圖1 不同季節(jié)熱帶紅腹海參消化道指標(biāo)變化Fig. 1 Change of digestive tract indexes of H. edulis in different seasons

2.2 不同季節(jié)紅腹海參的消化道組織學(xué)特征

紅腹海參消化道前腸橫切組織HE染色切片顯示了不同季節(jié)下海參腸壁的形態(tài)學(xué)變化過(guò)程 (圖2)。腸壁結(jié)構(gòu)中的柱狀上皮 (Columnar epithelium,CE)、橫行皺襞 (Circular fold, CF)、紋狀緣 (Striated border, SB)、漿膜層 (Serosa, SE)、黏膜上皮層(Mucosa, MU)、肌層 (Muscular layer, ML)、體腔上皮層 (Coelomic lining, CL) 和凋亡空腔 (Apoptosis antrum, AA) 等結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)。不同季節(jié)實(shí)驗(yàn)組紅腹海參消化道組織結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，春季實(shí)驗(yàn)組消化道腸壁結(jié)構(gòu)的橫行皺襞中出現(xiàn)部分凋亡空腔(圖2-a)；而夏季空腔減少 (圖2-b)；秋季時(shí)，凋亡空腔增加、橫行皺襞厚度和柱狀上皮密集程度也較夏季減弱 (圖2-c)；而到冬季時(shí)，橫行皺襞中出現(xiàn)較多凋亡空腔 (圖2-d)，腸壁細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重凋亡，柱狀上皮和漿膜層變薄。

圖2 紅腹海參消化道在不同季節(jié)下前腸橫切組織HE染色切片光學(xué)顯微照片注：a、b、c、d 分別為實(shí)驗(yàn)組 3、6、9、12 月取樣，-1 和-2 分別為組織縱切面和橫切面。Fig. 2 Micrographs of HE-stained sections of transected tissues of foregut of digestive tract of H. edulis in different seasonsNote: The a, b, c and d represent the samples in March, June, September and December, respectively.The -1 and -2 represent the ongitudinal and transverse sections of the tissue, respectively.

2.3 不同季節(jié)紅腹海參消化道組織消化酶活性變化

紅腹海參消化道溶菌酶活性在6月最高，全年呈現(xiàn)“先升后降”的變化趨勢(shì) (圖3-a)。消化道胃蛋白酶和纖維素酶均在3月表現(xiàn)出最高活性，分別為15.55和12.64 U·mg-1，分別在9和12月降至最低 (圖3-b、圖3-d)，這可能與3月海參攝食逐漸恢復(fù)有關(guān)。而淀粉酶卻在9月表現(xiàn)出最高活性，這可能由海參的攝食狀態(tài)發(fā)生改變所致。

圖3 不同季節(jié)紅腹海參腸道組織消化酶活性變化Fig. 3 Change of digestive enzyme activity in intestinal tissues of H. edulis in different seasons

2.4 不同季節(jié)紅腹海參消化道組織免疫酶活性變化

紅腹海參消化道CAT活性由春季至冬季呈下降的變化趨勢(shì) (圖4-a)；而ALP活性卻呈現(xiàn)波動(dòng)性上升趨勢(shì) (圖4-b)。另外，T-SOD (圖4-c) 和POX(圖4-d) 活性呈現(xiàn)一致的變化趨勢(shì)，均在6月活性最高，但T-SOD活性在春季 (3月) 最低，而POX活性卻在冬季 (12月) 最低。

圖4 不同季節(jié)熱帶紅腹海參腸道組織免疫酶活性變化Fig. 4 Change of immune enzyme activity in intestinal tissues of H. edulis in different seasons

3 討論

海參為適應(yīng)不同季節(jié)水溫和食物的變化會(huì)做出相應(yīng)的生理生化反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，紅腹海參在春、夏、秋三季濕質(zhì)量均有所上升，而冬季可能因水溫降低影響了攝食而略有下降。紅腹海參消化道相對(duì)濕質(zhì)量在夏、秋季有所下降，冬季再次上升，這可能是春、冬季溫度較低影響了攝食，導(dǎo)致消化道內(nèi)容物較少。消化道相對(duì)濕質(zhì)量的變化進(jìn)一步印證了冬季低溫會(huì)影響海參的攝食和狀態(tài)。陳世波[9]研究指出，刺參在夏季休眠狀態(tài)下體質(zhì)量顯著下降。而本研究中夏季紅腹海參攝食比較旺盛，并未像刺參一樣出現(xiàn)夏眠現(xiàn)象?？梢?jiàn)紅腹海參不存在夏眠，可能存在冬眠現(xiàn)象，但目前并無(wú)研究佐證。為了進(jìn)一步探明熱帶海參的休眠期，本研究對(duì)紅腹海參消化道前腸形態(tài)學(xué)變化過(guò)程進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)夏季凋亡空腔最少，而冬季海參消化道腸壁結(jié)構(gòu)的橫行皺襞中出現(xiàn)較多凋亡空腔，腸壁細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的凋亡，柱狀上皮和漿膜層變薄。這種變化特征與刺參夏眠時(shí)候極其相似，因此初步判斷熱海紅腹海參可能存在冬眠現(xiàn)象。

研究表明，外部環(huán)境的改變會(huì)影響水生動(dòng)物的生長(zhǎng)狀態(tài)和機(jī)體酶活變化，進(jìn)而影響其攝食、生長(zhǎng)和健康[15-17]。因此，海參在休眠狀態(tài)下，除了形態(tài)學(xué)發(fā)生變化外，其體內(nèi)消化和免疫相關(guān)的酶活性也會(huì)發(fā)生顯著變化，如淀粉酶、纖維素酶、SOD和CAT等[10-11]。水生動(dòng)物在缺少食物時(shí)，主要通過(guò)改變機(jī)體各種酶的活性來(lái)調(diào)節(jié)代謝水平、能量分配和能源物質(zhì)消耗，以適應(yīng)食物缺乏造成的脅迫，維持機(jī)體生理活動(dòng)[18-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，紅腹海參消化道組織在6月具有較高的溶菌酶活性，全年呈現(xiàn)“先升后降”的變化趨勢(shì)，進(jìn)一步說(shuō)明紅腹海參在夏季生長(zhǎng)依然良好，其消化道組織通過(guò)分泌大量溶菌酶來(lái)消化攝食過(guò)程中所帶入的微生物等致病因子。楊寧等[22]研究顯示，當(dāng)水溫較高時(shí)，環(huán)境中的致病因子相對(duì)活力上升，促使海參機(jī)體溶菌酶活性上升以保證其生長(zhǎng)良好。這也解釋了紅腹海參在夏季具有較高溶菌酶活性的原因。然而，消化道組織中的胃蛋白酶和纖維素酶均在3月表現(xiàn)出最高活性，這可能是由于3月海參從冬季的休眠萎縮逐漸恢復(fù)攝食所致。研究指出，消化酶活性與機(jī)體的攝食量和所處的狀態(tài)有關(guān)[23-24]。任慶印[25]在研究海參夏眠過(guò)程中的生理代謝調(diào)控時(shí)發(fā)現(xiàn)，溫度變化對(duì)蛋白酶活性影響顯著，并在基因的調(diào)控下與溫度呈一定的正相關(guān)。春季水溫逐漸上升，紅腹海參的生理活動(dòng)逐漸恢復(fù)并受到外界食物刺激，但此時(shí)的食物仍無(wú)法滿足其生長(zhǎng)需求，從而刺激機(jī)體胃蛋白酶和纖維素酶活性顯著上升[10]。饑餓脅迫可促進(jìn)腸道胃蛋白酶的分泌及其活性[26]。然而，夏季食物充足，其機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)下降，導(dǎo)致胃蛋白酶和纖維素酶活性有所降低。這可能是因?yàn)闄C(jī)體盡可能將代謝保持在一定水平，以保證在重新獲取食物或面臨其他環(huán)境脅迫時(shí)能承受相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)[27]。消化道中淀粉酶活性發(fā)生了與機(jī)體生長(zhǎng)相適應(yīng)的變化，前3個(gè)月緩慢上升，冬季時(shí)受環(huán)境溫度影響而呈下降趨勢(shì)。Bao等[28]指出，在休眠狀態(tài)下，海參主要通過(guò)消耗體內(nèi)蛋白質(zhì)和脂肪來(lái)獲取代謝底物或能量。Chen等[29]對(duì)休眠狀態(tài)下的刺參進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，同樣表明蛋白質(zhì)和磷脂可能是低代謝期間的主要能量來(lái)源。而且在休眠狀態(tài)下，海參腸道組織的糖酵解發(fā)生抑制，進(jìn)而影響其生長(zhǎng)和代謝[30]。紅腹海參濕質(zhì)量的下降和消化酶活性的降低均表明其在冬季處于休眠狀態(tài)。

另外，本研究還測(cè)定了不同時(shí)期紅腹海參消化道組織免疫酶活性的變化。其中，CAT可以將機(jī)體產(chǎn)生的過(guò)氧化氫 (H2O2) 分解成無(wú)毒、無(wú)害的水(H2O) 和氧氣 (O2)[31]。紅腹海參消化道組織中的CAT活性變化規(guī)律表明，春季 (3月) 細(xì)胞內(nèi)CAT的底物H2O2濃度顯著增加，進(jìn)而刺激CAT活性被誘導(dǎo)。而夏季 (6月) CAT活性顯著降低，可能與SOD濃度有關(guān)。有研究指出，饑餓脅迫下機(jī)體CAT活性隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，這可能是機(jī)體超氧陰離子自由基在SOD的作用下被還原為H2O2的含量下降，致使相應(yīng)CAT活性降低[32]。這與本研究中夏季高SOD活性的結(jié)果相吻合。ALP是機(jī)體對(duì)新陳代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)以保護(hù)自身的另一重要調(diào)節(jié)酶，通過(guò)寡糖磷脂酰肌醇錨定在細(xì)胞膜上的結(jié)合蛋白，使生物體可以直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝，且參與體內(nèi)的鈣 (Ca)、磷 (P) 代謝[17,33]。本研究中，ALP呈現(xiàn)波動(dòng)上升趨勢(shì)，表明代謝較旺盛或較弱均會(huì)導(dǎo)致機(jī)體ALP活性上升，以調(diào)節(jié)機(jī)體代謝的平衡。另外，POX和T-SOD活性表現(xiàn)出一致的變化規(guī)律，均在6月最高。而POX以H2O2為電子受體，直接催化酚類或胺類化合物氧化的酶。隨著水溫的上升，機(jī)體的耗氧率也增加，進(jìn)而促使活性氧類物質(zhì)的生成，導(dǎo)致抗氧化酶活性的上升[22,34]。腸道內(nèi)POX活性在冬季最低，可能是機(jī)體抗氧化體系不能及時(shí)清除自由基，使其氧化與抗氧化平衡被破壞所致[35]。

中國(guó)東南沿海是經(jīng)濟(jì)海參養(yǎng)殖開(kāi)發(fā)的物種資源庫(kù)。中國(guó)熱帶海參資源開(kāi)發(fā)利用的當(dāng)務(wù)之急是大力開(kāi)展熱帶刺參等高值種類的資源恢復(fù)，發(fā)展玉足海參 (H. leucospilota) 和紅腹海參等中低值海參的人工增養(yǎng)殖，發(fā)展熱帶海參人工增養(yǎng)殖新產(chǎn)業(yè)。然而，紅腹海參的養(yǎng)殖、培育卻受到各種環(huán)境因子影響，闡明其應(yīng)對(duì)不同環(huán)境因子的響應(yīng)及調(diào)控機(jī)制具有重要意義。本研究中紅腹海參應(yīng)對(duì)不同季節(jié)的生理生化反應(yīng)有所不同，夏季其生長(zhǎng)、攝食較為旺盛，而冬季出現(xiàn)冬眠跡象，體質(zhì)量下降、消化道萎縮、細(xì)胞凋亡，相應(yīng)的消化酶和免疫酶活性在冬季均處在低值，這種性狀與刺參的夏眠特性相一致。因此，判斷熱帶紅腹海參具有冬眠現(xiàn)象，但是其對(duì)季節(jié)的適應(yīng)機(jī)制和休眠機(jī)理仍需要進(jìn)一步研究。