尹國友， 于英楠， 孫 婕， 劉亦菲， 陳 涵， 王 召

(河南城建學院生命科學與工程學院1，平頂山 467036) (平頂山市平豐種業(yè)有限責任公司2，平頂山 467001)

韭(AlliumtuberosumRottl.ex Spreng.)為多年生宿根草本植物，適應性強，抗寒耐熱，全國均有種植，常用做中藥材，其根和籽亦可入藥[1,2]。韭菜籽是韭菜干燥成熟的種子，其營養(yǎng)價值與藥用價值都極高，富含生物堿、甾體皂苷、多不飽和脂肪酸、氨基酸、礦物質(zhì)元素、蛋白質(zhì)、膳食纖維和以及B 族維生素等生物活性物質(zhì)[3-7]。近年來關于韭菜籽油的研究主要集中在提取和成分鑒定與分析等方面[8,9]。韭菜籽油富含亞油酸，被視為一種保健和營養(yǎng)的食用油新來源[9-11]。

食用油脂通常不易分散于食品體系，這就限制了其生理活性和加工性能[12]。韭菜籽油富含不飽和脂肪酸，儲存穩(wěn)定性較差。微膠囊技術可以利用天然的或者合成的高分子包囊材料，將固體、液體或氣體物質(zhì)包埋在微小、半透性或密封的膠囊內(nèi)，使內(nèi)容物在特定條件下以可控的速率進行釋放[13]，可以將油脂轉(zhuǎn)化為粉體，即粉末油脂。油脂粉末化后有利于其運輸、儲藏和食用，可擴大油脂的使用范圍，而且油脂微膠囊化后可防止油脂的氧化酸敗[14,15]。在保護核芯物質(zhì)不被氧化的情況下也不會影響核芯物質(zhì)本身的理化性質(zhì)，能有效控制釋放活性物質(zhì)[16-18]，因此廣泛被應用于食品[19]、醫(yī)學[20]、化妝品[21]、紡織品[22]等領域。

本研究以韭菜籽油為原料，制備具有良好穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)表征的微膠囊韭菜籽油，為韭菜籽油的微膠囊工業(yè)化生產(chǎn)和綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

韭菜籽油(超臨界CO2流體萃取制備)，明膠，阿拉伯膠，CMC，HI-CAP 100麥芽糊酪蛋白酸鈉，TG酶，氫氧化鈉，無水乙醇，碘化鉀，三氯甲烷，石油醚，0.02 mol/L硫代硫酸鈉標準液，可溶性淀粉。

1.2 儀器與設備

PHS-3E型pH計，T25型分散機，HH-S4型恒溫水浴鍋，010-1SA型電熱恒溫鼓風干燥箱，ME204E電子天平，SCIENTZ-12 Ⅰ/Ⅱ型冷凍干燥機，KQ5200DB 型數(shù)控超聲波清洗器，PEI inspect F50掃描電鏡。

1.3 方法

1.3.1 實驗流程圖

韭菜籽油微膠囊制備流程圖見圖1。

圖1 韭菜籽油微膠囊制備流程圖

1.3.2 壁材選擇實驗

根據(jù)文獻[23-25]的實驗方法稍作修改。

乳狀液的制備：稱取一定量壁材置于燒杯中，水浴攪拌使其進行充分溶解。而后加入韭菜籽油，并在12 000 r/min條件下分散3 min，制備成均勻的乳狀液。

復凝聚反應：將乳狀液在40 ℃水浴下攪拌，加入10%乙酸溶液，將pH調(diào)節(jié)至壁材等電點附近，繼續(xù)反應15 min后，用冰水速冷卻至15 ℃以下。

固化：用 10%的氫氧化鈉溶液將反應體系的pH值調(diào)節(jié)至6.0，加入一定量的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(TG)，保持15 ℃左右的溫度，固化3 h。

干燥：將制備好的微膠囊懸濁液靜置分層，除去上清液，在-4 ℃冰箱中進行冷凍，冷凍后樣品經(jīng)過冷凍干燥得到微膠囊粉末，或在進樣溫度180 ℃，進樣速度15 mL/min噴霧干燥器內(nèi)進行噴霧干燥。

單因素實驗：選取pH、壁材濃度、壁材比以及芯壁比作為因素在各因素梯度下制備微膠囊并檢測其包埋率。

1.3.3 微膠囊表面油、總油及包埋率的測定

參考楊艷紅等[26]的方法并稍作修改。

韭菜籽油微膠囊表面油測定：稱取3 g樣品置于燒瓶中，分多次將50 mL石油醚加入燒杯中，每次倒入后均振蕩 3 min。過濾并合并濾液，轉(zhuǎn)移至干燥且已稱重的燒瓶中，記空燒瓶質(zhì)量為m1，在60 ℃恒溫水浴加熱濾液，蒸出石油醚，直至表面油和燒杯的總質(zhì)量不再變，稱質(zhì)量記為m2，表面油質(zhì)量記為mx。

mx=m2-m1

(1)

韭菜籽油微膠囊總油測定：準確稱取3 g樣品至燒瓶中，記空瓶質(zhì)量m3，加入150 mL石油醚進行萃取，60 ℃恒溫水浴加熱直至總油和燒瓶的總質(zhì)量不再變化，稱質(zhì)量記為m4，微膠囊總油質(zhì)量記為my。

my=m4-m3

(2)

韭菜籽油微膠囊包埋率記為E。

(3)

根據(jù)各組壁材對韭菜籽油包埋率的測定結(jié)果，選定最優(yōu)壁材組合，進行后續(xù)實驗。

1.3.4 微膠囊光學顯微鏡觀察

將制備的微膠囊制備成涂片，在光學顯微鏡下進行觀察并記錄照片。

1.3.5 微膠囊掃描電鏡觀察

取少量干燥后微囊粉末，粘于導電膠，吹去多余粉末并噴金，噴金厚度100 μm，在視野清晰且有代表性的條件下觀察微膠囊形態(tài)。加速電壓設定10 kV。

1.3.6 響應面優(yōu)化實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，使用 Design Expert 11軟件進行結(jié)果分析。選擇反應pH、壁材比、芯壁比以及壁材質(zhì)量濃度作為響應面的4個因素變量，以韭菜籽油微膠囊包埋率為響應值，設計Box-Behnken 實驗方案，并對實驗結(jié)果進行回歸分析以及優(yōu)化，各因素水平選取見表1。

表1 響應面分析因素及水平

2 結(jié)果與分析

2.1 壁材選擇實驗

2.1.1 明膠-阿拉伯膠微膠囊單因素實驗結(jié)果

圖2 明膠-阿拉伯膠微膠囊壁材選擇結(jié)果

由圖2可知，明膠-阿拉伯膠微膠囊包埋率最高為77.77%。pH、壁材質(zhì)量濃度、壁材比以及芯壁比均對微膠囊包埋率有著較為明顯的影響。明膠的表面帶電性取決于所處的pH環(huán)境，當明膠所處環(huán)境pH低于等電點時，其呈正電性，而阿拉伯膠是一種負電荷聚合物，當明膠與阿拉伯膠所帶正負電荷越接近，添加量越接近，凈電荷越少，凝聚反應越充分，復合凝聚效果越好，包埋率越高[27]。如果壁材添加量過多，會出現(xiàn)壁材之間相互碰撞粘連的情況，降低包埋率。如果芯材添加量過多，可能會使包埋韭菜籽油量過大，從而導致微膠囊不穩(wěn)定的現(xiàn)象[28]。

明膠-阿拉伯膠韭菜籽油微膠囊在光學顯微鏡下均為單核微膠囊，未見多核微膠囊產(chǎn)生，微膠囊粒徑不均勻，微膠囊數(shù)量較少，粘連現(xiàn)象較多，見圖3。

圖3 明膠-阿拉伯膠微膠囊光學顯微鏡圖(50×)

明膠-阿拉伯膠微膠囊凍干后掃描電鏡如圖4a所示，為不規(guī)則形態(tài)，外壁較為光滑。從外觀看，其壁材粘連較為嚴重，可能是因為阿拉伯膠黏度較高，凍干過程中壁材迅速縮水從而造成壁材堆積在一起，故未呈現(xiàn)規(guī)則球狀[29]。明膠-阿拉伯膠微膠囊噴干后掃描電鏡如圖4b所示，呈較為規(guī)則的微球狀，大小較不均勻，細致觀察微膠囊表面不光滑，可能是由于微膠囊在噴霧干燥過程中迅速干燥，造成的微膠囊表面脫水不均勻所造成的。

圖4 明膠-阿拉伯膠韭菜籽油微膠囊掃描電鏡圖

2.1.2 明膠-羧甲基纖維素鈉(CMC)微膠囊單因素實驗結(jié)果

由圖5可知，明膠-CMC微膠囊包埋率最高為87.4%。材濃度、壁材比以及芯壁比均對微膠囊包埋率有著較為明顯的影響。在制備微膠囊過程中，CMC較為難以溶解，所以當壁材質(zhì)量濃度超過0.9 g/100 mL時隨著壁材質(zhì)量濃度的增加，CMC在溶液體系中溶解不完全，導致明膠無法反應完全，造成包埋率下降，故壁材質(zhì)量濃度選用0.9 g/100 mL作為微膠囊制備壁材質(zhì)量濃度。對于壁材比對微膠囊包埋率的影響來說，當兩種壁材所帶相反電荷數(shù)越接近，微膠囊的包埋率越高，故當壁材比為9∶1時微膠囊包埋率相較其他壁材比較高。同時如果添加量過多，會出現(xiàn)壁材之間相互碰撞粘連的情況，降低包埋率。芯材添加量過多，可能會使包埋韭菜籽油量過大，從而導致微膠囊不穩(wěn)定的現(xiàn)象[30]。

明膠-CMC韭菜籽油微膠囊在光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)所制備的微膠囊中絕大部分為單核微膠囊，少量為多核微膠囊。微膠囊粒徑大小不均勻，但微膠囊數(shù)量較多，有少量粘連現(xiàn)象發(fā)生，見圖6。

如圖7a所示，明膠-CMC微膠囊凍干后樣品呈不規(guī)則形狀且外壁有少量較小的微膠囊出現(xiàn)，由于復凝聚法形成的微膠囊并非完全疏水，故其還含有一定量的水分，所以在未進行分散的干燥過程中微膠囊極易相互粘連變形[31]。如圖7b所示，明膠-CMC微膠囊噴干后，所觀察到的微膠囊多數(shù)呈規(guī)則球狀，少量呈不規(guī)則形狀，且有可見的破碎的微膠囊。其中較為規(guī)則的球狀微膠囊表面光滑，有較少數(shù)凹陷。微膠囊之間粘連性較大，聚堆現(xiàn)象嚴重。

圖5 明膠-羧甲基纖維素鈉微膠囊壁材選擇結(jié)果

圖6 明膠-羧甲基纖維素鈉微膠囊光學顯微鏡圖

圖7 明膠-羧甲基纖維素鈉韭菜籽油微膠囊掃描電鏡圖

2.1.3 HI-CAP 100-明膠單因素實驗結(jié)果

由圖8可知，HI-CAP 100-明膠微膠囊包埋率最高為47.13%。壁材質(zhì)量濃度、壁材比以及芯壁比均對微膠囊包埋率的影響較不顯著，只有pH對微膠囊的影響略微顯著，復凝聚法制備微囊過程中，囊材、芯材通過靜電作用相互吸引，因此需要嚴格控制pH[32]，將溶液pH調(diào)至明膠等電點以下時，明膠分子帶正電荷，在此pH下，HI-CAP 100-Na帶負電荷，兩者具有相反的電荷，從而相互交聯(lián)形成復合物[30]。但是總的來看，HI-CAP 100-明膠微膠囊包埋率整體水平都不高。

HI-CAP 100-明膠韭菜籽油微膠囊在光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)所制備的微膠囊中近似明膠-CMC微膠囊，大部分為單核微膠囊，少量為多核微膠囊。微膠囊粒徑大小不均勻，有少量粘連現(xiàn)象發(fā)生，見圖9。

HI-CAP 100-明膠微膠囊凍干后掃描電鏡如圖10a所示，外壁較為光滑，為不規(guī)則形態(tài)。從外觀看，其壁材粘連較為嚴重，可能是因為膠體致使微膠囊黏度較高，凍干過程中壁材迅速縮水從而造成壁材堆積在一起，故未呈現(xiàn)規(guī)則球狀[29]。HI-CAP 100-明膠微膠囊噴干后掃描電鏡如圖10b所示，有較多的球體，呈現(xiàn)規(guī)則的形狀，但大小較不均勻，細致觀察微膠囊表面較不光滑，可能是由于微膠囊在噴霧干燥過程中迅速干燥，表面脫水不均勻所造成的。

圖8 HI-CAP 100-明膠微膠囊壁材選擇結(jié)果

圖9 HI-CAP 100-明膠微膠囊光學顯微鏡圖

圖10 HI-CAP 100-明膠韭菜籽油微膠囊掃描電鏡圖

2.1.4 HI-CAP 100-麥芽糊精單因素實驗結(jié)果

由圖11可知，HI-CAP 100-麥芽糊精微膠囊包埋率最高為90.77%。芯材濃度、壁材比以及芯壁比均對微膠囊包埋率有著較為明顯的影響。在制備微膠囊過程中，HI-CAP 100與麥芽糊精溶解較好，在壁材達到最高時，包埋率下降較為緩慢，故壁材質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)均會使微膠囊保持較高的包埋率。壁材比超過1∶1后，下降趨勢不符合預期，可能因為實驗操作等緣故造成數(shù)據(jù)不穩(wěn)定。HI-CAP 100可使乳液具有較低的黏度同時可以使液滴表面適當飽和，從而產(chǎn)生尺寸較小的液滴，絮凝速率通常較慢，具有更高的穩(wěn)定性[33]。 HI-CAP 100-麥芽糊精韭菜籽油微膠囊在光學顯微鏡下均為單核微膠囊，未見多核微膠囊產(chǎn)生，微膠囊粒徑較為均勻，微膠囊數(shù)量較多，且粘連現(xiàn)象較少，見圖12。

圖11 HI-CAP 100-麥芽糊精微膠囊壁材選擇結(jié)果

圖12 HI-CAP 100-麥芽糊精微膠囊光學顯微鏡圖

如圖13a所示，HI-CAP 100-麥芽糊精微膠囊凍干后呈較為規(guī)則的網(wǎng)絡孔隙結(jié)構(gòu)，其原因可能是因為HI-CAP 100是以淀粉為原料在一定條件下，在淀粉多糖長鏈上同時引入親水羧酸基團和疏水烯基長鏈，所以其制備的乳液有較強的穩(wěn)定性[34]。所以當經(jīng)過凍干時，可以形成較為規(guī)則的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。如圖13b所示，HI-CAP 100-麥芽糊精微膠囊噴干后呈規(guī)則球形，單個微膠囊經(jīng)噴干后并未見凹陷。部分微膠囊表面出現(xiàn)褶皺，可能是因為微膠囊壁材較厚，噴干過程中產(chǎn)生不均勻收縮所造成的[35]。

圖13 HI-CAP 100-麥芽糊精韭菜籽油微膠囊掃描電鏡圖

2.1.5 微膠囊壁材選擇實驗結(jié)果分析

根據(jù)壁材包埋率、微膠囊形態(tài)觀察、掃描電鏡結(jié)果分析以及微膠囊的干燥方式的研究結(jié)果，選擇HI-CAP 100-麥芽糊精作為微膠囊壁材，噴霧干燥法作為微膠囊干燥方式進行后續(xù)實驗。

2.2 響應面實驗設計及結(jié)果

2.2.1 響應面實驗設計

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以反應pH、壁材比、芯壁比以及壁材質(zhì)量濃度作為響應面的4個因素變量，以韭菜籽油微膠囊包埋率為響應值，設計Box-Behnken 實驗方案，并對實驗結(jié)果進行回歸分析以及優(yōu)化，Box-Behnken設計響應面實驗結(jié)果見表2。

2.2.2 回歸模型分析

利用Design-Expert 11統(tǒng)計分析軟件對29組不同因素組合條件下所得韭菜籽油的包埋率進行回歸分析擬合，得到回歸方程模型方差分析及回歸方程系數(shù)估計值(表3)。

表2 響應面實驗結(jié)果

表3 多元二次模型的方差分析表

包埋率(%)=89.80+2.19A+0.785 8B+2.24C+1.88D+1.36AC+0.942 5AD-1.03BD-3.05A2-1.77B2-3.05C2-2.83D2

(4)

由表3可知，pH、芯壁比、壁材質(zhì)量濃度對反應包埋率的影響達到了極顯著得程度，而壁材比對包埋率的影響達到了顯著的程度，pH與芯壁比，pH與壁材質(zhì)量濃度，壁材比與壁材質(zhì)量濃度之間的相互作用也達到了顯著程度。

2.2.3 微膠囊最佳工藝條件確定

通過響應面分析可知，響應面曲面坡度陡峭，等高線呈橢圓形，當芯壁比、壁材質(zhì)量濃度處于低值與高值時，隨著pH的增加，包埋率都先增加后減小，說明pH與芯壁比、pH與壁材質(zhì)量濃度交互作用顯著[36]。當壁材比處于低值與高值時，隨著壁材質(zhì)量濃度的增加，包埋率都先增加后減小，說明壁材比和壁材質(zhì)量濃度交互作用顯著。二次多項回歸模型中二次項A2、B2、C2、D2的系數(shù)均為負值，說明響應面開口向下方程有極大值。對回歸方程求導，并令其等于零，可以得到曲面的最高點，即獲得韭菜籽油微膠囊的最佳工藝條件：反應pH為4.56，壁材比為1.07∶1，芯壁比為1.28∶1，壁材質(zhì)量濃度為1.04 g/100 mL，在此條件下，韭菜籽油微膠囊預測包埋率可達91.58%。

2.2.4 驗證型實驗

根據(jù)響應面優(yōu)化的最佳工藝參數(shù)，噴霧干燥制備韭菜籽油微膠囊，做3組驗證實驗，重復性較好，平均包埋率為90. 80%，與預測理論值差0.78%，相對誤差小于1%，說明采用響應面法優(yōu)化得到的最佳工藝參數(shù)可靠。

3 結(jié)論

分別采用明膠-阿拉伯膠、明膠-CMC、HI-CAP 100-明膠以及HI-CAP 100-麥芽糊精4種組合作為壁材，利用復凝聚法制備韭菜籽油微膠囊。以韭菜籽油微膠囊的包埋率、光學顯微鏡觀察和掃描電鏡結(jié)構(gòu)表征為反應指標，在反應pH、壁材質(zhì)量濃度、壁材比及芯壁比4個不同因素下，確定了最佳組合壁材為HI-CAP 100-麥芽糊精，進而通過響應面實驗設計，最終確定了韭菜籽油微膠囊最佳優(yōu)化工藝條件為反應pH為4.56，壁材比為1.07∶1，芯壁比為1.28∶1，壁材質(zhì)量濃度為1.04 g/100 mL，在此條件下韭菜籽油微膠囊包埋率達到了90.80%。