唐 興，梁廣男，劉雅莉，段志貴

(1. 衡陽師范學(xué)院生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院，衡陽 421008；2. 衡陽師范學(xué)院南岳山區(qū)生物資源保護與利用湖南省重點實驗室，衡陽 421008；3. 東華理工大學(xué)江西省質(zhì)譜科學(xué)與儀器重點實驗室，南昌 330013；4. 湖南師范大學(xué)動物多肽藥物創(chuàng)制國家地方聯(lián)合工程實驗室，長沙 410081)

兩棲類動物是防御性較弱的生物，為了保護自己免受掠食者侵害，它們已經(jīng)進化出一種特殊的防御機制，即由皮膚毒液腺表面分泌毒液來進行防御。在古代醫(yī)藥中，兩棲動物被認為具有藥用價值，其皮膚提取物早在幾個世紀前就作為傳統(tǒng)藥材，例如，作為中藥可調(diào)節(jié)身體內(nèi)部功能和生殖能力，在古埃及藥物中用于治療疼痛和腹瀉[1-3]?，F(xiàn)代醫(yī)藥研究發(fā)現(xiàn)，兩棲動物皮膚分泌物的多肽組分結(jié)構(gòu)多樣、功能各異，因此研究兩棲類皮膚分泌活性肽的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能對于開發(fā)新型藥物具有重要意義。

蛙和蟾蜍（兩棲類無尾目）的皮膚分泌物中已有大量藥物候選分子被鑒定[1,4]，而蠑螈（兩棲類有尾目）的皮膚分泌肽報道數(shù)量非常有限[5-7]。究其原因，這些蠑螈皮膚多肽都是先通過提取皮膚分泌液，然后再用液相色譜分離獲得純度較高的多肽分子，最后通過Edman 降解（或結(jié)合RACE 技術(shù)）測定其全長序列。本實驗室也嘗試過將蠑螈皮膚分泌液進行分離純化，但僅極少數(shù)多肽獲得微量的高純度樣品，大多數(shù)多肽難以達到Edman 降解測序需要的純度和最低限量。

轉(zhuǎn)錄組測序已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種生物體的高通量測序中[8-11]，其中也包括一些能夠分泌毒液的動物，如銀環(huán)蛇（Bungarus multicinctus）、海南捕鳥蛛（Cyriopagopus hainanus）、東亞鉗蝎（Mesobuthus martensii）、大理石芋螺（Conus marmoreus）和毒蛙（Oophaga sylvatica）[12-16]。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)主要有3 種，其中包括Solexa 測序技術(shù)、454 測序技術(shù)和SOLiD 測序技術(shù)，但目前以Illumina 公司的Solexa 測序技術(shù)為主。該方法具有高通量、測序效率高、耗時短等優(yōu)勢。

中國瘰螈（Paramesotriton chinensis）在分類上隸屬兩棲綱（Amphibia）、有尾目（Caudata）、蠑螈科（salamandridae）、瘰螈屬（Paramesotriton）。關(guān)于中國瘰螈分布以及行為習(xí)性的研究已有論文發(fā)表[17-18]，但是尚無其皮膚組織蛋白質(zhì)和活性多肽成分的研究報道。本研究以中國瘰螈皮膚組織為材料，采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，獲得原始數(shù)據(jù)后組裝成unigene，并進行功能富集分類，以識別編碼的蛋白質(zhì)和活性多肽成分。

1 材料與方法

1.1 中國瘰螈皮膚組織總RNA 提取和檢測

中國瘰螈（雌性）成體1 只購買于某養(yǎng)殖場（圖1），屬于人工繁殖的后代。用雙蒸水清洗蠑螈皮膚3 次，滅菌濾紙擦干。用RNA 酶滅活處理的鑷子撕下蠑螈皮膚，再迅速加入到已用液氮預(yù)冷的研缽中研磨，然后利用Trizol 試劑盒提取總RNA。取適量RNA 樣品，采用Agilent 2100 Bioanalyzer 進行毛細管電泳以鑒定RNA 樣品濃度和純度。

圖1 中國瘰螈Figure 1 Paramesotriton chinensis

1.2 cDNA 文庫的構(gòu)建及測序

提取的總RNA 用DNase I 消化DNA，通過帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA。加入片段化試劑，在恒溫混勻儀中適溫將mRNA 打斷成短片段，以打斷后的mRNA 為模板、用隨機六堿基引物進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一條鏈。合成雙鏈 cDNA 后，再經(jīng)過PCR 試劑盒純化回收、粘性末端修復(fù)、3’末端加上堿基“A”并連接測序接頭，然后進行瓊脂糖凝膠電泳。片段大小選擇后進行 PCR 擴增。構(gòu)建好的cDNA 文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer 和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System 質(zhì)檢，合格后使用Illumina HiSeq 4000 進行測序。

1.3 測序數(shù)據(jù)處理

從測序原始reads 中去掉低質(zhì)量、接頭污染、未知堿基N含量過高的reads，過濾后數(shù)據(jù)即為clean reads。使用組裝軟件 Trinity 將具有一定長度重疊序列連成更長的Contig，然后通過快速聚類軟件Tgicl 將來自同一轉(zhuǎn)錄本的不同Contig 進一步進行組裝處理，最后得到Unigene 序列。

1.4 基因注釋和生物信息學(xué)分析

使用 Blast[19]對unigene 進行NT、NR、COG、KEGG 以及 SwissProt 注釋；采用 Blast2GO[20]以及NR注釋結(jié)果進行GO注釋，通過 InterProScan5[21]進行InterPro 注釋。

編碼皮膚活性多肽cDNA 序列翻譯成前體肽序列后，通過信號肽在線分析軟件SignalP-5.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）鑒定信號肽序列，再利用MEGA 軟件將皮膚活性多肽與同源多肽的氨基酸序列進行對比。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA 質(zhì)檢數(shù)據(jù)

采用Agilent Bioanalyzer 進行毛細管電泳測定中國瘰螈皮膚組織總RNA 的濃度和純度，鑒定其濃度為540 ng·μL-1，RNA 總量為10.8 μg，RNA 完整值（RNA integrity number，RIN）為7.7，rRNA的28S/18S 為1.0。在本試驗中，RNA 樣品的鑒定結(jié)果能夠滿足建庫測序要求。

2.2 測序數(shù)據(jù)

構(gòu)建好的cDNA 文庫通過Illumina HiSeq 4000 進行測序，測序的原始reads 數(shù)目為49.00 M，過濾后clean reads 數(shù)目為44.76 M。將clean reads 組裝成contig，再聚類去冗余和組裝得到74 371 個unigene，其總長度、平均長度、N50 以及GC 含量分別為 56 739 303 bp、762 bp、1 387 bp 和 46.12%。

2.3 Unigene 功能注釋

將unigene 在七大功能數(shù)據(jù)庫 (NR、NT、GO、COG、KEGG、Swissprot 和Interpro) 中進行注釋，注釋結(jié)果見表1。共注釋到33 627個非冗余unigene，占unigene 總數(shù)的45.22%；其中NR 注釋的unigene最多，為30 734 個（占注釋unigene 總數(shù)的91.40%）。

表1 中國瘰螈皮膚組織轉(zhuǎn)錄組unigene 的功能注釋統(tǒng)計Table 1 Summary of functional annotation result for unigenes from transcriptome of P. chinensis skin tissue

我們統(tǒng)計了unigene 注釋結(jié)果的物種分布（圖2），其中5 137個unigene注釋結(jié)果來自兩棲類物種，約占注釋總數(shù)的15%；注釋結(jié)果最多的兩個物種是熱帶爪蟾（Xenopus tropicalis）和非洲爪蟾（X.laevis），注釋數(shù)目分別是3 619 個和1 156 個，分別約占注釋結(jié)果為兩棲類物種的70%和23%（圖3）。而且，也發(fā)現(xiàn)一些注釋結(jié)果來自蠑螈物種，注釋數(shù)目最多的為墨西哥鈍口螈（Ambystoma mexicanum）、紅腹蠑螈（Cynops pyrrhogaster）、綠紅東美螈（Notophthalmus viridescens） 和 歐 非 肋 突 螈（Pleurodeles waltl），它們的注釋數(shù)目共約占注釋結(jié)果為兩棲類物種的5%。

圖2 中國瘰螈皮膚組織轉(zhuǎn)錄組unigene 注釋結(jié)果的物種分布Figure 2 Distribution of annotated species for unigenes from transcriptome of P. chinensis skin tissue

圖3 中國瘰螈皮膚組織轉(zhuǎn)錄組unigene注釋結(jié)果為兩棲類的物種分布Figure 3 Distribution of annotated amphibian species for uni genes from transcriptome of P. chinensis skin tissue

根據(jù)COG 和GO 注釋結(jié)果，我們分別統(tǒng)計了各自的功能分類。COG 數(shù)據(jù)庫（全稱是cluster of orthologous group）是直系同源蛋白注釋的數(shù)據(jù)庫，即來自同一個祖先蛋白的同源蛋白被歸為一類，并認為它們有相同或相關(guān)的功能。本研究共鑒定出20 406 個COG 注釋項，可分為25 個COG 類別（圖4）。其中，“一般功能基因”（3 591 個，占比為17.60%（3 591/20 406）下同））的COG 注釋項最多；其次是“復(fù)制、重組和修復(fù)”（2 030 個，占比為9.95%）、“翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物發(fā)生”（1 799 個，占比為8.82%）、“轉(zhuǎn)錄”（1 656 個，占比為8.12%）、“細胞周期控制、細胞分裂、染色體分裂”（1 298 個，占比為6.36%)；而COG 注釋項最少的類別是“核結(jié)構(gòu)”（8 個，占比為0.04%）以及“胞外結(jié)構(gòu)”（25個，占比為0.12%）。

圖4 中國瘰螈皮膚組織轉(zhuǎn)錄組unigene 的COG 功能分類Figure 4 Functional distribution of COG annotation for unigenes from transcriptome of P. chinensis skin tissue

基因本體論（gene ontology，GO）為所有物種的基因（或產(chǎn)物）提供了一個國際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類系統(tǒng)（圖5），它們被分為3 類：生物過程（biological process）、細胞成分（cellular component）和分子功能（molecular function）[22]。本研究一共獲得75 914 個GO 注釋項，其中37 525 個GO 注釋項涉及生物過程（49.43%），27 256 個GO 注釋項涉及細胞成分（35.90%）和11 133 個GO 注釋項涉及分子功能（14.67%）。

圖5 中國瘰螈皮膚組織轉(zhuǎn)錄組unigene 的GO 功能分類Figure 5 Functional distribution of GO annotation for unigenes from transcriptome of P. chinensis skin tissue

2.4 中國瘰螈皮膚活性多肽的識別

通過對中國瘰螈皮膚進行RNA 測序研究，我們識別了膽囊收縮素、防御素、傷口愈合肽、神經(jīng)肽Y 家族、蛋白激酶抑制劑、胸腺素等皮膚活性多肽，均發(fā)現(xiàn)它們在其他兩棲動物中存在高度序列相似性的同源多肽。而且，這些皮膚活性多肽大多數(shù)與蠑螈皮膚的免疫或防御功能有關(guān)。

2.4.1 膽囊收縮素 膽囊收縮素具有腸激素和神經(jīng)遞質(zhì)的作用。另外，膽囊收縮素還具有抗炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)作用，如增強中性粒細胞和巨噬細胞的吞噬和殺菌能力[23]。從紅瘰疣螈（Tylototriton verrucosus）的皮膚分泌液中，發(fā)現(xiàn)一個膽囊收縮素CCK-TV[5]，其成熟肽氨基酸序列為DYMGWMDFNH2。本試驗中識別的中國瘰螈皮膚膽囊收縮素（PC-CCK）與CCK-TV 的前體肽序列僅兩個氨基酸殘基不同，而它們的成熟肽序列完全一樣。

2.4.2 防御素 抗菌肽是動物先天免疫系統(tǒng)的一個組成部分。防御素作為抗菌肽的主要家族，因此它在蠑螈先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[24]。中國瘰螈皮膚防御素（PC-defensin）與福鼎蠑螈（C.fudingensis）皮膚防御素CFBD 的成熟肽長度均為41 個氨基酸殘基，它們的序列僅有一個氨基酸殘基不同，序列相似性高達98%。它們均含有6 個半胱氨酸殘基，能形成3 個二硫鍵（配對方式 C1-C5、C2 -C4、C3-C6），屬于β-防御素（圖6）。前人的研究結(jié)果證明，CFBD 具有較強的抗菌活性，它對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、白色念珠菌和大腸桿菌均有抑制作用[6]。

圖6 PC-defensin 和CFBD 前體序列比對Figure 6 The alignment of precursor sequences from PC-defensin and CFBD

2.4.3 傷口愈合肽 蠑螈擁有很強大的傷口愈合能力，是唯一能夠再生殘缺和損傷身體部位（包括四肢）的脊椎動物[25]。哺乳動物傷口表面的上皮再生過程通常需要2～3 d，而蠑螈在同樣的過程中只需要10 h，因此蠑螈皮膚傷口能夠很快地愈合。

Cathelicidin類抗菌肽在脊椎動物中是一類保守抗菌肽家族，其前體肽經(jīng)過內(nèi)源性酶處理后，釋放具有抑制微生物活力的生物活性肽，它一般位于前體肽的 C 末端。本研究識別的中國瘰螈皮膚PC-cathelicidin 以及紅瘰疣螈皮膚的促傷口愈合活性肽tylotoin（其序列為QTRKCVRQNNKRVCK），均與抗菌肽cathelicidin 家族具有高度同源性[7]。這兩種多肽的前體肽序列均含有3 個部分（信號肽、中間肽和成熟肽）（圖7），其序列相似性為80.0%。其中，它們的信號肽長度均含有20 個氨基酸殘基，僅第8 位的氨基酸殘基不同，其序列相似性最高（95.0%）；而中間肽的氨基酸殘基長度相差2 個氨基酸殘基，序列相似性比信號肽序列略低（80.5%）；而成熟肽的氨基酸殘基長度也不同（tylotoin 為15個氨基酸殘基，而中國瘰螈皮膚cathelicidin 為16個氨基酸殘基），均含有一對二硫鍵，但是其相似性最低（56.3%）。前人的研究結(jié)果表明，在小鼠全層皮膚創(chuàng)傷模型中，tylotoin 與表皮生長因子EGF 具有相似地促進傷口愈合的能力（EC50為 11.14 μg·mL-1）。Tylotoin 直接促進角質(zhì)形成細胞、血管內(nèi)皮細胞和成纖維細胞的運動和增殖，從而加速創(chuàng)面的再上皮化和肉芽組織的形成。Tylotoin 還促進了轉(zhuǎn)化生長因子1（TGF-β1）和白細胞介素6（IL-6）的釋放，這在傷口愈合反應(yīng)中是必不可少的[7]。

圖7 PC-cathelicidin 和tylotoin 前體序列比對Figure 7 The alignment of precursor sequences from PCcathelicidin and tylotoin

角質(zhì)形成細胞是維持皮膚完整性的重要細胞，是第一批對損傷作出反應(yīng)的細胞。皮膚周圍神經(jīng)中的神經(jīng)肽如降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene related peptide, CGRP）有助于角質(zhì)形成細胞的增殖，因此也屬于傷口愈合肽。降鈣素基因相關(guān)肽可以通過參與皮膚炎癥和傷口愈合過程而具有保護作用。來自雙色葉蛙（Phyllomedusa bicolor）皮膚分泌物中的多肽pbCGRP，具有SCDTSTCATQRLADFLSR SGGIGSPDFVPTDVSANSF 序列（C 末端氨基酸殘基酰胺化）[26]。中國瘰螈皮膚PC-CGRP 與pbCGRP的成熟肽具有較高的同源性（序列相似性為67.6%）。它們的成熟肽長度均為37 個氨基酸殘基，且它們在C2 和C7 之間形成一對二硫鍵（圖8）。

圖8 PC-CGRP 和pbCGRP 成熟肽序列比對Figure 8 The alignment of mature sequences from PC-CGRP and pbCGRP

2.4.4 神經(jīng)肽 Y 家族 胰多肽（pancreatic polypeptide，PP）和酪神經(jīng)肽（neuropeptide tyrosine，NPY）均屬于神經(jīng)肽Y 家族，它們均具有36 個氨基酸殘基且其C 末端的Y 或F 殘基發(fā)生酰胺化，其三級空間結(jié)構(gòu)特征也相同。神經(jīng)肽Y涉及進食行為、垂體和胃腸道的調(diào)節(jié)[1]。

本次研究在中國瘰螈皮膚轉(zhuǎn)錄組中識別了兩種神經(jīng)肽Y，即PC-PP 和PC-NPY。其中，中國瘰螈皮膚胰多肽PC-PP 與蛙胰多肽PP（在美洲牛蛙Lithobates catesbeianus和木蛙L. sylvaticus中均有發(fā)現(xiàn)）的成熟肽序列具有72.2%的序列相似性，而它們的C 末端氨基酸殘基均有酰胺化修飾（圖9）；而中國瘰螈皮膚酪神經(jīng)肽PC-NPY 的成熟肽序列（ YPSKPNSPGEDAPAEDMAKYYSALRHYINLIT RQRY）與墨西哥鈍口螈的酪神經(jīng)肽NPY 序列完全一致。

圖9 PC-PP 和PP 成熟肽序列比對Figure 9 The alignment of mature sequences from PC-PP and PP

2.4.5 蛋白激酶抑制劑 從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中還識別到一種cAMP 依賴的蛋白激酶抑制劑（PC-PKIA），它與兩種爪蟾—熱帶爪蟾（X. tropicalis）和非洲爪蟾（X. laevis）的PKIA 具有較高的序列相似性（均為71.8%）（圖10）；這兩種爪蟾PKIA 在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫 UniProtKB 中編號分別為 F6YL71 和A0A1L8G8I6。目前，從兩棲動物皮膚中鑒定出許多蛋白酶抑制劑，它們在兩棲動物皮膚中可能是負調(diào)控皮膚蛋白酶活性以避免皮膚肽的過早降解或釋放，或者是類似于抗菌肽的表面抗感染劑而抑制入侵細菌產(chǎn)生的胞外蛋白酶[1]。

圖10 PKIA 成熟肽序列比對Figure 10 The alignment of mature sequences of PKIAs

2.4.6 胸腺肽 胸腺肽具促血管生成、愈合創(chuàng)傷、抑制炎癥以及等多種生物活性功能，因此它在動物免疫系統(tǒng)中起到重要作用[27]。從中國瘰螈皮膚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中識別到一個胸腺肽PC-thymosin，與云南棘蛙（Nanorana yunnanensis）的胸腺肽（UniProtKB編號為A5HEW9）和中國大鯢（Andrias davidianu）的胸腺肽β-4的序列相似性分別為 86.67%和88.89%（圖11）。胸腺肽基因在兩棲動物中的不同器官表達也有巨大差異。前人的研究結(jié)果表明，中國大鯢胸腺肽β-4基因在在肺中表達水平最高，而在皮膚中表達水平較低[28]。

圖11 胸腺肽成熟肽序列比對Figure 11 The alignment of mature sequences of thymosins

3 討論與結(jié)論

蠑螈皮膚毒液是一種含有復(fù)雜成分的混合物，主要包括生物堿、類固醇、生物胺等小分子化合物和多肽、蛋白質(zhì)等。這些小分子化合物的活性和結(jié)構(gòu)已被鑒定，其中生物堿在蠑螈皮膚防御中起重要作用，它既有抑菌作用，也對脊椎動物有毒性作用，因此具有防御天敵和抗感染雙重功能[29]。此外，蠑螈皮膚毒液也含有活性多肽，但由于采用傳統(tǒng)的分離和測序方法難以獲得多肽全序列，因此已報道的蠑螈皮膚活性多肽數(shù)量非常有限[5-7]。

本研究首次對中國瘰螈皮膚組織進行了轉(zhuǎn)錄組測序，并從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中識別了幾類皮膚活性多肽。它們大多與免疫或防御活性相關(guān)，比較分析發(fā)現(xiàn)它們與其他兩棲動物種類的同源多肽有較高的序列相似性。

相對于基因組測序[30]，采用的轉(zhuǎn)錄組測序具有更高性價比和分析效率，可以高效地獲得蛋白質(zhì)和多肽轉(zhuǎn)錄本信息。本研究識別了多種中國瘰螈皮膚活性多肽，將為下一步合成或表達這些多肽并進行相關(guān)功能研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。此外，蠑螈皮膚的活性多肽與小分子化合物之間的可能相互作用，是未來研究兩棲類皮膚功能的一個重要方向。