張書萍莫顯剛張詩悅陳舉海王 蘭楊 卉劉大男

(1.貴州醫(yī)科大學(xué),貴陽 550004;2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院綜合病房,貴陽 550004;3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科,貴陽 550004)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是冠心病、腦卒中及外周動脈閉塞等血管疾病的病理基礎(chǔ)。AS斑塊內(nèi)炎癥細(xì)胞代謝活躍,糖酵解增強(qiáng),致斑塊內(nèi)pH值降低,后者常導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定及心血管事件發(fā)生。鈉氫交換體1(sodium-hydrogen exchanger 1,NHE1)是調(diào)節(jié)細(xì)胞及組織pH值最重要的分子之一[1],且NHE1決定AS病灶的酸化狀態(tài)并促進(jìn)AS形成[2]。鈉葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(sodium-glucose cotransporter 2,SGLT2)抑制劑如達(dá)格列凈、恩格列凈等主要通過抑制腎小管上皮SGLT2而減少葡萄糖重吸收發(fā)揮降糖作用[3],此外,SGLT2抑制劑可改善心血管臨床結(jié)局及減低死亡率[4],而格列美脲等降糖藥物卻無此功能。SGLT2抑制劑具有增加糖尿病 AS斑塊穩(wěn)定性[5],降低系統(tǒng)或斑塊炎癥,減少腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活及氧化應(yīng)激,改善內(nèi)皮功能等作用[6],這一系列功能提示SGLT2抑制劑具有抗AS效應(yīng)。另一方面,SGLT2抑制劑恩格列凈能降低心肌細(xì)胞NHE1 80%活性[7];SGLT2抑制劑能減輕NHE1野生型小鼠心肌細(xì)胞凋亡而抗心衰,而在 NHE1敲除小鼠中SGLT2抑制劑效應(yīng)消失[8]。綜上,NHE1促進(jìn)AS斑塊形成,SGLT2抑制劑具有抗 AS效應(yīng)并能抑制NHE1活性,推測SGLT2抑制劑可能通過抑制NHE1活性而抗AS,但類似報道鮮見。本研究采用ApoE-/-小鼠為研究對象,高脂飲食喂養(yǎng),制作動脈粥樣硬化炎癥模型[9],擬觀察SGLT2抑制劑達(dá)格列凈對高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠AS斑塊形成及RAW264.7巨噬細(xì)胞的影響,進(jìn)而探討是否與NHE1的相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性6周齡ApoE-/-小鼠24只,基因背景為C57BL/6小鼠,小鼠體重均為(20±2)g,購自北京維通利華公司[SCXK(京)2019-0010],飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)室[SYXK(黔)2018-0001],動物實(shí)驗(yàn)通過貴州醫(yī)科大學(xué)動物福利倫理委員會批準(zhǔn)(2101044)。實(shí)驗(yàn)研究過程中遵循替代、減少、優(yōu)化的3R原則。

1.1.2 細(xì)胞

小鼠單核細(xì)胞細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所細(xì)胞中心。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗小鼠NHE1抗體(英國Abcam公司,ab230449);兔抗小鼠SGLT2抗體(英國Abcam公司,ab37296);GAPDH 抗體(美國GeneTex公司,GTX100118);HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(英國abcam公司,ab6721);ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(德國默克Millipore公司,1925901);胎牛血清(美國GIBCO公司,B5M54371);EDTA緩沖液(武漢塞維爾,G1206);胰酶(以色列BI公司,1552692);青鏈霉素混合液(以色列BI公司,1823547);DMEM培養(yǎng)基(美國GIBCO公司,8120425);達(dá)格列凈(美國Selleck公司,S154806);格列美脲(美國Selleck公司,S134401);阿米洛利(美國MCE公司,2016-88-8);尼日利亞菌素(nigericin)(美國Selleck公司,S665302);SNARF-1/AM(美 國Selleck公 司,S897401);高脂飼料(北京 博愛港公司,1145NA);ELISA試劑盒均由北京四正柏公司提供:TNF-α(20210930)、IL-1β(20211024)、IL-6(2021116)、IL-10(20211123)。TD-4279A血糖測試儀及血糖試紙(杭州 秦博科技);RM2016病理切片機(jī)(上海 徠卡儀器有限公司);Nikon Eclipse CI正置光學(xué)顯微鏡(日本 尼康);激光共聚焦顯微鏡(日本 Olympus 公司);實(shí)時熒光定量PCR儀(美國 Bio-Rad公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物喂養(yǎng)、分組及觀察

SPF級雄性6周齡ApoE-/-小鼠24只,給予喂養(yǎng)普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。1周后,隨機(jī)分為普通飲食組(ordinary diet group)、高脂飲食組(high-fat diet group)、達(dá)格列凈組(high-fat diet+dapagliflozin group)、格 列 美 脲 組(high-fat diet+glimepiride group),每組6只。普通飲食組予以普通飼料飼養(yǎng),其余各組均高脂飼料(配方:1%膽固醇,0.2%膽酸鈉,10%豬油,10%蛋黃粉,78.8%基礎(chǔ)飼料)喂養(yǎng),同時達(dá)格列凈組予以10 mg/(kg·d)生理鹽水溶解灌胃,格列美脲組予以0.5 mg/(kg·d)生理鹽水溶解灌胃,普通飲食組及高脂飲食組分別等量生理鹽水灌胃。高脂飼料陰涼干燥避光保存,每天每只5 g投食。飼養(yǎng)室環(huán)境通風(fēng)良好,溫度(24±2)℃,相對濕度(50±10)%,12 h/12 h交替照明和避光。自由飲水,不同喂養(yǎng)及藥物干預(yù)后,禁食8 h尾靜脈取血檢測空腹血糖,連續(xù)喂養(yǎng)8周后,戊巴比妥鈉(30 mg/kg)靜脈麻醉后處死,取小鼠主動脈、腎皮質(zhì)按照后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行。

1.3.2 HE染色檢測主動脈斑塊

各組小鼠采用多聚甲醛從左心室灌流后,取出主動脈,4℃ PBS中清洗3次,4%多聚甲醛固定,制備石蠟切片,HE染色,利用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照,進(jìn)行圖片數(shù)據(jù)分析,計算校正斑塊面積(斑塊面積/血管截面積)%。

1.3.3 免疫組化檢測斑塊 NHE1

各組病理切片在1 mmol/L EDTA緩沖液(pH=9.0)高壓修復(fù)3 min(氣壓閥冒大氣開始計時),抗原修復(fù)石蠟切片完成后,3% BSA室溫封閉30 min,加入3% BSA配制的NHE1一抗(1∶500),4℃孵育過夜,PBS清洗后,加入二抗,室溫孵育50 min,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,脫水封片,觀察并拍照,用圖像分析軟件Image J Pro Plus 6.0進(jìn)行分析。

1.3.4 定量PCR檢測各組SGLT2 mRNA表達(dá)

以高表達(dá)SGLT2的正常小鼠腎皮質(zhì)為陽性對照(n=6),根據(jù)說明提取各組主動脈總RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒操作,分別取每組2 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,按照10 μL反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)條件:95℃ 30 s,95℃ 15 min,60℃ 30 s,后兩步40個循環(huán)。引物設(shè)計:小鼠SGLT2基因mRNA(NM-133254.5)及GAPDH基 因(NM-008084.3)為模板自行設(shè)計引物,SGLT2基因:正向5’-CATTGGTGTTGGCTTGTGGT-3’,反向5’-CGAGACAATGGTAAGCCCCA-3’;GAPDH基因:正向5’-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3’,反 向5’-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3’,上海生工公司合成。所有樣本的Ct 值均由熒光定量PCR 儀讀取,得到樣本中各基因的Ct 值。采用2-△△Ct法計算基因相對表達(dá)量。

1.3.5 免疫印跡法檢測SGLT2表達(dá)

為了顯示各組SGLT2表達(dá)情況,以高表達(dá)SGLT2的正常小鼠腎皮質(zhì)組織作為陽性對照(n=6),稱取適量腎皮質(zhì)、高脂飲食組、高脂飲食+達(dá)格列凈組及高脂飲食+格列美脲組主動脈組織,選擇從左心室發(fā)出后向下延伸約2 cm的主動脈,選擇的腎皮質(zhì)大約與此相同重量。液氮搗碎,提取蛋白質(zhì),以蛋白濃度5～10 μg/μL為標(biāo)準(zhǔn),以每組總蛋白質(zhì)量30 μg計算出各組上樣體積,經(jīng)SDS-PAGE電泳,濕法轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h,一抗(SGLT2 1∶1000)孵育4℃過夜,二抗室溫封閉2 h,ECL顯色,圖像分析軟件Image J進(jìn)行灰度值分析。

1.3.6 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及處理

RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng)于含高糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclone),將培養(yǎng)瓶內(nèi)生長至約80%的細(xì)胞胰酶消化離心,細(xì)胞沉淀濃重懸成每毫升1.5×105個的細(xì)胞懸液,每孔2 mL細(xì)胞懸液加入6孔板中,待細(xì)胞生長至匯合率＞80%,給予達(dá)格列凈(終濃度:10 μmol/L)、阿米洛利(終濃度:20 μmol/L)以及脂多糖(LPS,終濃度:100 ng/mL)分別或同時干預(yù)24 h,分為空白對照組(Blank control group)、脂多糖組(LPS group)、脂 多 糖+達(dá) 格 列 凈 組(LPS+dapagliflozin group)、脂多糖+阿米洛利組(LPS+amiloride group)、脂多糖+達(dá)格列凈+阿米洛利組(LPS+dapagliflozin+amiloride group),共5組。

1.3.7 檢測各組細(xì)胞 NHE1 的表達(dá)情況

不同藥物干預(yù)六孔板內(nèi)細(xì)胞24 h后,提取蛋白,NHE1一抗稀釋比例(1∶1000),其余方法同動物部分Western blot操作。

1.3.8 檢測 pH 值回復(fù)率(NHE1活性)

采用熒光比率法檢測細(xì)胞內(nèi)pH[10],將生長有融合度約80%的RAW264.7細(xì)胞的蓋玻片加入SNARF-1/AM溶液,37℃孵育30 min,洗滌后,激光共聚焦顯微鏡下,以激發(fā)波長為530 nm,檢測發(fā)射波長為580 nm和630 nm熒光強(qiáng)度,計算其比率。采取NH4Cl酸負(fù)荷法檢測細(xì)胞內(nèi)pH值回復(fù)率(NHE1活性),采用30 mmol/L NH4Cl溶液浸浴3 min,無鈉溶液漂洗5 min 維持細(xì)胞內(nèi)短暫酸中毒,繼而加或不加達(dá)格列凈或阿米洛利的含鈉溶液漂洗使Na+/H+交換加速,即促進(jìn)NHE1活性增加。不同pH 高鉀溶液、SNARF-1/AM負(fù)載及nigericin孵育30 min,以pH值和熒光強(qiáng)度比細(xì)制作胞內(nèi)pH標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.9 檢測各組TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10表達(dá)

酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10表達(dá),收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清,依據(jù)ELISA試劑盒操作說明,測定各組TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的分泌,自動酶標(biāo)儀在 450 nm處讀取數(shù)值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。組間比較采用單因素方差分析,兩組間差異比較方差齊時采用LSD法,方差不齊時采用T2檢驗(yàn),P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 達(dá)格列凈減少非糖尿病AS形成

為排除血糖降低對AS形成的影響,以高脂飲食+格列美脲為對照,檢測高脂飲食+達(dá)格列凈干預(yù)對高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠AS形成的影響。結(jié)果提示(圖1A、1B)與普通飲食組相比,高脂飲食組斑塊顯著增加(P＜0.05);高脂飲食+達(dá)格列凈組AS斑塊面積低于高脂飲食組及高脂飲食+格列美脲組,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),而高脂飲食+格列美脲組較高脂飲食組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。此外,喂養(yǎng)過程中,藥物處理后監(jiān)測血糖(如表1所示),高脂飲食組血糖較普通飲食組升高,但差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),高脂飲食+達(dá)格列凈組、高脂飲食+格列美脲組與高脂飲食組相比均可輕微減低血糖趨勢,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。提示相對于高脂飲食+格列美脲組,高脂飲食+達(dá)格列凈抑制斑塊形成,還是血糖觀察結(jié)果均提示達(dá)格列凈減少非糖尿病AS形成。

表1 6各組小鼠血糖變化情況(±s,mmol/L,n=6)Table 1 Changes in blood glucose of mice in each group

表1 6各組小鼠血糖變化情況(±s,mmol/L,n=6)Table 1 Changes in blood glucose of mice in each group

組別Groups 0周0 weeks 2周2 weeks 4周4 weeks 6周6 weeks 8周8 weeks普通飲食組Ordinary diet group 5.28±0.97 5.08±1.01 4.97±0.80 5.15±0.99 5.17±0.91 高脂飲食組High-fat diet group 5.33±0.60 5.10±0.88 5.28±0.71 5.35±0.63 5.30±0.86高脂飲食+達(dá)格列凈組High-fat diet+dapagliflozin group 5.13±0.46 4.92±0.56 4.60±0.98 4.62±0.94 4.82±0.63 高脂飲食+格列美脲組High-fat diet+glimepiride group 5.34±0.41 4.85±0.83 4.88±0.99 4.45±0.92 4.63±1.06 F 0.40 0.13 0.62 1.41 0.61 P 0.95 0.94 0.62 0.27 0.62

2.2 AS斑塊SGLT2蛋白及mRNA極低表達(dá)

為明確SGLT2抑制劑是否影響AS斑塊SGLT2表達(dá),采用普通飲食組腎皮質(zhì)作為陽性對照,檢測SGLT2在主動脈斑塊的蛋白及mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示,與腎皮質(zhì)陽性對照組比較,高脂飲食組、高脂飲食+達(dá)格列凈組、高脂飲食+格列美脲組主動脈斑塊中SGLT2蛋白及mRNA表達(dá)均非常低(P＜0.05)(圖2A～2C),且高脂飲食組、高脂飲食+達(dá)格列凈組、高脂飲食+格列美脲組3組間SGLT2蛋白及mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。提示主動脈AS內(nèi)極低表達(dá)SGLT2,且SGLT2抑制劑達(dá)格列凈亦未影響SGLT2表達(dá),SGLT2抑制劑可能并非通過SGLT2靶點(diǎn)抗AS作用。

注:A:主動脈HE染色;B:主動脈的斑塊面積分析。1:普通飲食組;2:高脂飲食組;3:高脂飲食+達(dá)格列凈組;4:高脂飲食+格列美脲組。與普通飲食組相比, aP＜0.05;與高脂飲食組和高脂飲食+格列美脲組相比, bP＜0.05。圖1 達(dá)格列凈對ApoE-/-小鼠主動脈中動脈粥樣硬化斑塊的影響(n=6)Note.A, HE staining of aorta.B, Plaque area analysis of the aorta.1, Ordinary diet group.2, High-fat diet group.3, High-fat diet+dapagliflozin group.4, High-fat diet+glimepiridegroup group.Compared with ordinary diet group, aP＜0.05.Compared with high-fat diet group and high-fat diet+glimepiridegroup group, bP＜0.05.Figure 1 Effect of dapagliflozin on atherosclerotic plaques in the aorta of ApoE-/- mice

2.3 達(dá)格列凈抑制AS斑塊NHE1蛋白表達(dá)

因NHE1可促進(jìn)AS斑塊形成,檢測 SGLT2 抑制劑達(dá)格列凈是否改變AS斑塊NHE1表達(dá),結(jié)果顯示,與普通飲食組相比,高脂飲食組斑塊中NHE1表達(dá)有上升趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。而在高脂飲食喂養(yǎng)基礎(chǔ)上,SGLT2抑制劑達(dá)格列凈處理后斑塊內(nèi)NHE1相對于高脂飲食組表達(dá)下調(diào)(P＜0.05),降糖藥格列美脲組斑塊內(nèi)NHE1雖較高脂飲食組有所下降,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3A、3B)。提示NHE1蛋白表達(dá)減低可能在SGLT2抑制劑達(dá)格列凈抗AS中發(fā)揮作用。

2.4 達(dá)格列凈抑制RAW264.7細(xì)胞 NHE1蛋白表達(dá)及活性

2.4.1 RAW264.7細(xì)胞 NHE1蛋白表達(dá)

為驗(yàn)證動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以脂多糖誘導(dǎo)NHE1蛋白表達(dá),給予SGLT2抑制劑達(dá)格列凈或 NHE1抑制劑阿米洛利干預(yù),檢測RAW264.7細(xì)胞NHE1表達(dá)。結(jié)果如圖4A、4B顯示,與空白對照組相比,脂多糖組的NHE1蛋白水平上調(diào)(P＜0.05),而達(dá)格列凈以及阿米洛利均可逆轉(zhuǎn)脂多糖誘導(dǎo)的NHE1蛋白水平升高(P＜0.05),然而,阿米洛利+達(dá)格列凈聯(lián)合干預(yù)下,與阿米洛利或達(dá)格列凈單獨(dú)干預(yù)相比,NHE1蛋白水平無明顯變化(P＞0.05)。提示達(dá)格列凈或許通過NHE1受體作用,進(jìn)而影響NHE1蛋白水平。

2.4.2 RAW264.7細(xì)胞 NHE1活性

NHE1功能方面,使用SNARF-1/AM雙熒光強(qiáng)度比率法檢測SGLT2抑制劑達(dá)格列凈對 RAW264.7細(xì)胞靜息pH值,結(jié)果顯示相對于對照組,在達(dá)格列凈、阿米洛利單獨(dú)或同時存在下,細(xì)胞靜息狀態(tài)下pH值降低,而3組靜息pH值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖5A)。進(jìn)而檢測NH4Cl脈沖酸負(fù)荷后pH回復(fù)率即NHE1活性,結(jié)果顯示與空白對照組相比,在達(dá)格列凈、阿米洛利單獨(dú)或同時存在下,細(xì)胞內(nèi)NHE1活性均降低(P＜0.05);與達(dá)格列凈組相比,細(xì)胞內(nèi)NHE1活性無明顯變化(P＞0.05)(圖5B)。達(dá)格列凈干預(yù),細(xì)胞內(nèi)pH值及細(xì)胞內(nèi)NHE1活性變化效應(yīng)與達(dá)格列凈與阿米洛利同時處理時效應(yīng)相同,提示達(dá)格列凈可能通過抑制NHE1活性改變細(xì)胞內(nèi)pH值。

注:A:免疫印跡法檢測主動脈SGLT2蛋白表達(dá)量;B:主動脈SGLT2蛋白表達(dá)量分析;C:qPCR檢測主動脈SGLT2 mRNA表達(dá)量。1:普通飲食組;2:高脂飲食組;3:高脂飲食+達(dá)格列凈組;4:高脂飲食+格列美脲組。與普通飲食組相比, aP＜0.05。圖2 主動脈組織中 SGLT2 表達(dá)情況(n=6)Note.A, Western blot detection of aortic SGLT2 protein expression.B, Analysis of aortic SGLT2 protein expression.C, qPCR detection of aortic SGLT2 mRNA expression.1, Ordinary diet group.2, High-fat diet group.3, High-fat diet+dapagliflozin group.4, High-fat diet+glimepiridegroup group.Compared with ordinary diet group, aP＜ 0.05.Figure 2 SGLT2 expression in aortic tissue

2.5 達(dá)格列凈抑制 RAW264.7細(xì)胞中炎性情況

與空白對照組比,LPS組細(xì)胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-6 含量顯著增加(P＜0.05),IL-10含量顯著減少(P＜0.05);與LPS組比,LPS+達(dá)格列凈組及LPS+阿米洛利組可下調(diào)脂多糖誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β、IL-6含量(P＜0.05),上調(diào)IL-10含量(P＜0.05);與LPS+阿米洛利組比較,LPS+阿米洛利+達(dá)格列凈組TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10含量無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)(表2)。結(jié)果提示達(dá)格列凈可能通過NHE1途徑抑制LPS誘導(dǎo)炎癥效應(yīng)。

表2 各組細(xì)胞上清TNF-α、IL-1β、IL-6與IL-10含量比較(±s,pg/mL,n=3)Table 2 Comparison of the contents of TNF-α, IL-1β, IL-6 and IL-10 in the supernatant of cells in each group

表2 各組細(xì)胞上清TNF-α、IL-1β、IL-6與IL-10含量比較(±s,pg/mL,n=3)Table 2 Comparison of the contents of TNF-α, IL-1β, IL-6 and IL-10 in the supernatant of cells in each group

注:與空白對照組比較, aP＜0.05;與LPS組比較, bP＜0.05Note.Compared with Blank control group, aP＜0.05.Compared with LPS group, bP＜0.05.

組別Groups TNF-α IL-1β IL-6 IL-10空白對照組Blank control group 491.8±33.57 71.58±6.16 1458±43.52 578.6±56.99 LPS組LPS group 1010±61.63a 151.6±7.39a 2943±59.27a 253.1±51.71a LPS+達(dá)格列凈LPS+dapagliflozin group 597.6±43.06b 123.9±4.09b 1458±119.46b 424.3±43.22b LPS+阿米洛利組LPS+amiloride group 575.8±39.31b 119.3±9.16b 1576±39.31b 425.7±63.96b LPS+阿米洛利+達(dá)格列凈組LPS +amiloride+dapagliflozin group 545.7±23.44b 123.9±6.82b 1466±89.28b 395.6±42.06b F 73.29 52.42 218.5 14.71 P＜0.0001 ＜0.0001 ＜0.0001 0.0003

注:A:免疫組化檢測主動脈斑塊中NHE1表達(dá)量;B:主動脈斑塊中NHE1表達(dá)量分析。1:普通飲食組;2:高脂飲食組;3:達(dá)格列凈組;4:格列美脲組。與高脂飲食組相比, aP＜0.05。圖3 達(dá)格列凈對ApoE-/-小鼠主動脈斑塊組織中NHE1表達(dá)的影響(n=6)Note.A, Immunohistochemical detection of NHE1 expression in aortic plaques.B, Analysis of NHE1 expression in aortic plaques.1, Ordinary diet group.2, High-fat diet group.3, Dapagliflozin group.4, Glimepiride group.Compared with high-fat diet group, aP＜0.05.Figure 3 Effect of dapagliflozin on NHE1 expression in aortic plaque tissue of ApoE-/- mice

注:A:免疫印跡法檢測RAW264.7細(xì)胞中NHE1表達(dá)量的變化;B:RAW264.7細(xì)胞中 NHE1表達(dá)量分析。1:空白對照組;2:LPS組;3:LPS +達(dá)格列凈組;4:LPS+阿米洛利組,5:LPS+達(dá)格列凈+阿米洛利組。與空白對照組相比,aP＜0.05;與LPS組比較,bP＜0.05。圖4 達(dá)格列凈對RAW264.7細(xì)胞NHE1蛋白表達(dá)的影響(n=3)Note.A, Western blot was used to detect the changes of NHE1 expression in RAW264.7 cells.B, Analysis of NHE1 expression in RAW264.7 cells.1, Blank control group.2, LPS group.3, LPS+dapagliflozin group.4, LPS+amiloride group.5, LPS+dapagliflozin+amiloride group.Compared with Blank control group, aP＜0.05.Compared with LPS group, bP＜0.05.Figure 4 Effects of dapagliflozin on NHE1 protein expression in RAW264.7

注:A:SNARF-1/AM熒光法檢測RAW264.7細(xì)胞中pH變化分析;B:RAW264.7細(xì)胞中NHE1活性變化分析。1:空白對照組;2:達(dá)格列凈組;3:阿米洛利組;4:達(dá)格列凈+阿米洛利組。與空白對照組比較, aP＜0.05。圖5 達(dá)格列凈對 RAW264.7細(xì)胞NHE1活性的影響(n=3)Note.A, Analysis of pH changes in RAW264.7 cells detected by SNARF-1/AM fluorescence method.B, Analysis of changes in NHE1 activity in RAW264.7 cells.1, Blank control group.2, Dapagliflozin group.3, Amiloride group.4, Dapagliflozin+amiloride group.Compared with Blank control group, aP＜0.05.Figure 5 Effect of dapagliflozin on NHE1 activity in RAW264.7 cells

3 討論

AS斑塊形成以脂代謝異常、動脈壁炎癥為重要特征的病理過程。SGLT2抑制劑是目前唯一被臨床試驗(yàn)證實(shí)具有降低心血管疾病風(fēng)險的降糖藥。本研究結(jié)果顯示SGLT2抑制劑達(dá)格列凈可減少ApoE-/-小鼠AS斑塊形成,進(jìn)而表明SGLT2抑制劑達(dá)格列凈不僅可抑制斑塊NHE1表達(dá),還可抑制細(xì)胞NHE1活性以及LPS誘導(dǎo)炎癥因子釋放,這些作用亦可被NHE1抑制劑阿米洛利所拮抗,提示抑制NHE1表達(dá)及活性,或許是SGLT2抑制劑抗AS的新機(jī)制。

3.1 達(dá)格列凈減少非糖尿病AS形成

SGLT2抑制劑是一種通過阻斷腎近端小管中的SGLT2來達(dá)到抑制腎葡萄糖重吸收的新型降糖藥。SGLT2抑制劑具有心血管的保護(hù)作用,可以降低血糖、改善心臟功能。此外,SGLT2 抑制劑還可抑制抗炎因子表達(dá)、改善免疫細(xì)胞表型以及機(jī)體酮體代謝等[11]。研究表明SGLT2抑制劑能減少糖尿病小鼠AS斑塊形成[12-13],從而減弱AS的發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)在ApoE-/-敲除小鼠中普通飲食喂養(yǎng)仍有少量斑塊形成,而高脂飲食喂養(yǎng)會使斑塊生長明顯,且高脂飲食組的斑塊增加可被SGLT2抑制劑達(dá)格列凈抑制,非SGLT2抑制劑降糖藥格列美脲組AS斑塊卻無明顯減少,提示達(dá)格列凈可減少非糖尿病ApoE-/-小鼠AS斑塊形成,降糖藥格列美脲無抗AS效應(yīng)。本研究采用經(jīng)典ApoE-/-小鼠制作動脈粥樣硬化模型,使用高脂飲食喂養(yǎng)可使其模型成功率高,而普通飲食組造成典型AS模型所需時間更長,在本研究時間范圍內(nèi)難以成功,故本研究采用了普通飲食組做空白對照,高脂飲食喂養(yǎng)制作模型。此研究還發(fā)現(xiàn)各組小鼠血糖在達(dá)格列凈及格列美脲不同降糖藥物處理下,相對于高脂飲食組,小鼠血糖雖有下降趨勢,但無明顯統(tǒng)計學(xué)差異,可能有以下原因:(1)可能實(shí)驗(yàn)動物系非糖尿病模型;(2)檢測血糖時采用的尾部靜脈血較少;(3)測量血糖方法不精確;(4)實(shí)驗(yàn)小鼠樣本量少,故本實(shí)驗(yàn)并不排除達(dá)格列凈通過影響小鼠血糖進(jìn)而對斑塊的影響。有趣的是,兩種降糖藥均未明顯降低小鼠正常血糖,本研究再次重現(xiàn)既往降糖藥SGLT2抑制劑抑制非糖尿病小鼠AS斑塊形成的結(jié)果[14-16],這意味著有必要深入探討SGLT2抑制劑減少AS形成的新機(jī)制,為選擇SGLT2抑制劑治療AS相關(guān)疾病提高新的研究策略[11]。

3.2 AS斑塊SGLT2蛋白及mRNA極低表達(dá)

SGLT2抑制劑在體內(nèi)從兩方面發(fā)揮作用:(1)主要通過腎小管上皮細(xì)胞SGLT2靶向作用;(2)脫靶效應(yīng)[17]。因本實(shí)驗(yàn)研究高脂飲食誘導(dǎo)AS模型情況下,主動脈內(nèi)SGLT2的表達(dá)情況,故本研究僅列出了高脂飲食喂養(yǎng)情況下主動脈內(nèi)SGLT2的表達(dá)情況,未羅列出普通飲食組斑塊內(nèi)的SGLT2表達(dá)情況,同高脂飲食組呈相同水平。本研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食喂養(yǎng)下,與腎皮質(zhì)高表達(dá) NHE1 mRNA及蛋白質(zhì)相比,小鼠主動脈斑塊SGLT2蛋白和 mRNA表達(dá)非常低;無論是否達(dá)格列凈干預(yù),動脈斑塊 SGLT2表達(dá)無明顯改變,提示 SGLT2高度特異性表達(dá)于腎小管[18],SGLT2可能對斑塊發(fā)生發(fā)展作用有限,而SGLT2抑制劑的脫靶效應(yīng)可能發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)SGLT2 抑制劑恩格列凈通過脫靶效應(yīng)降低心肌細(xì)胞NHE1活性,抑制心肌細(xì)胞凋亡[7-8]。

3.3 達(dá)格列凈抑制NHE1蛋白表達(dá)

本研究在AS斑塊及巨噬細(xì)胞上探討了SGLT2抑制劑是否具有抑制NHE1的脫靶效應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)高脂飲食組相較普通飲食組斑塊內(nèi)NHE1表達(dá)增加,且高脂飲食組內(nèi)增加的 NHE1可被SGLT2抑制劑達(dá)格列凈藥物所抑制,而格列美脲無此生理效應(yīng)。達(dá)格列凈可抑制斑塊內(nèi)NHE1表達(dá)。

本文從動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中探究了達(dá)格列凈對NHE1的抑制作用,選擇RAW巨噬細(xì)胞 LPS誘導(dǎo)體外炎癥模型,探究達(dá)格列凈對體外細(xì)胞炎癥模型下NHE1的作用,發(fā)現(xiàn)達(dá)格列凈可降低細(xì)胞內(nèi)pH以及抑制NHE1活性,且這些作用亦可被NHE1抑制劑阿米洛利所拮抗,提示SGLT2抑制劑能通過脫靶效應(yīng)抑制 NHE1活性。NHE1廣泛分布于各種細(xì)胞的細(xì)胞膜[19]。

3.4 達(dá)格列凈抑制 RAW264.7細(xì)胞中炎性情況

本研究通過檢測各組藥物作用后培養(yǎng)細(xì)胞中的炎癥因子的變化,發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)的促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的增加以及抗炎因子IL-10的減少炎癥因子釋放可被達(dá)格列凈逆轉(zhuǎn)。且達(dá)格列凈的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)與NHE1抑制劑單獨(dú)或共同處理時效應(yīng)相接近,提示達(dá)格列凈的抗炎效應(yīng)可能通過抑制NHE1產(chǎn)生。

NHE1 將胞外Na+及胞內(nèi)H+進(jìn)行交換,主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH值。本研究以及我們之前研究均表明AS斑塊中NHE1表達(dá)增高[19],斑塊炎癥細(xì)胞浸潤部位pH值降低。炎癥或缺血區(qū)域常會出現(xiàn) pH值呈酸性,酸性環(huán)境又導(dǎo)致斑塊環(huán)境內(nèi)的巨噬細(xì)胞功能異常,促進(jìn)AS斑塊形成[20]。即提示酸性環(huán)境與斑塊發(fā)生發(fā)展可相互促進(jìn)。新進(jìn)有研究Floralozone能通過抑制NHE1抗AS[21],亦提示了NHE1在AS中的關(guān)鍵作用。雖然本研究未檢測達(dá)格列凈干預(yù)后斑塊內(nèi)pH,但我們研究表明SGLT2抑制劑可通過抑制NHE1活性抑制AS斑塊形成,將達(dá)格列凈的抗AS效應(yīng)與NHE1聯(lián)系起來,縮短N(yùn)HE1基礎(chǔ)研究的臨床轉(zhuǎn)化。

AS斑塊中巨噬細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞是泡沫細(xì)胞的兩個主要來源,而本研究在斑塊組織中未能區(qū)別何種細(xì)胞NHE1表達(dá)。鑒于單核巨噬細(xì)胞是AS斑塊主要組成細(xì)胞,故以巨噬細(xì)胞作為研究對象,發(fā)現(xiàn)達(dá)格列凈抑制細(xì)胞 NHE1蛋白表達(dá)及NHE1活性,抑制LPS誘導(dǎo)炎性因子的釋放,且這種抑制效應(yīng)并未被NHE1抑制劑阿米洛利增強(qiáng)。我們的研究結(jié)果與 SGLT2抑制劑能通過抑制巨噬細(xì)胞向M1細(xì)胞分化而抑制炎癥因子釋放一致[13],同時 NHE1也參與M1細(xì)胞分化[22],提示SGLT2抑制劑可能通過抑制NHE1表達(dá)及活性發(fā)揮抗炎作用。

3.5 研究的不足及結(jié)論

本研究尚未對斑塊酸化程度進(jìn)行研究,未對SGLT2抑制劑作用于NHE1基因敲除小鼠探究其抗AS機(jī)制,本課題組將在后續(xù)的研究中進(jìn)行完善。

總之,盡管本研究未能在機(jī)制上深入研究,但結(jié)果表明SGLT2抑制劑可能通過抑制 NHE1表達(dá)及活性而發(fā)揮抗AS作用。這些發(fā)現(xiàn)或許會深化SGLT2抑制劑心血管保護(hù)作用的認(rèn)識,拓展SGLT2抑制劑臨床運(yùn)用,為探討NHE1參與AS斑塊形成的機(jī)制研究和臨床轉(zhuǎn)化提供新思路。