劉梓昕牛東芹王 東

(江漢大學(xué) 醫(yī)學(xué)院,武漢 430056)

世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)在報(bào)告中指出,2020年乳腺癌成為全球發(fā)病率最高的癌癥[1]。我國情況也不容樂觀,2020年乳腺癌新發(fā)病例約42萬,死亡約12萬。在眾多乳腺癌亞型中,三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)的治療最為困難[2-4],因其不表達(dá)或低表達(dá)人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2, HER-2)、雌激素受體(estrogen receptor, ER)和孕激素受體(progesterone receptor, PR)而難以從分子靶向等現(xiàn)代療法中受益[5-6],化療成為當(dāng)前較為有效的治療方法[7]。蒽環(huán)類與鉑類藥物是治療TNBC的主要選擇,其中鉑類藥物在臨床實(shí)踐中被推選為治療TNBC的優(yōu)選方案[8-9]。但是這并非是最優(yōu)方案,與其他亞型乳腺癌相比,其治療手段有待拓展、療效有待提高。

順鉑是鉑類藥物的典型代表,為第一個(gè)被FDA批準(zhǔn)用于治療惡性腫瘤的鉑類藥物[10],然而,耐藥性和嚴(yán)重的毒副作用使順鉑的應(yīng)用大打折扣[11-12]。近年來,通過結(jié)構(gòu)修飾或者開發(fā)納米藥物[13]等方法來克服鉑類藥物的不足成為臨床前研究的熱點(diǎn)。但無論使用哪種方法都要經(jīng)過動物模型的驗(yàn)證,因此,正確選取動物模型和準(zhǔn)確造模是藥物獲得臨床應(yīng)用的關(guān)鍵[14-17]。但是,在具體實(shí)踐中即使對于同一種動物模型,不同課題組的造模手段也會存在較大差異,這為客觀評價(jià)實(shí)驗(yàn)效果帶來諸多偏差。為了推進(jìn)動物模型選擇和構(gòu)建的同質(zhì)化,本文僅以順鉑參與的使用4T1細(xì)胞株構(gòu)建的TNBC異體移植瘤模型為例,論述與分析實(shí)驗(yàn)研究中存在的問題并提出解決方案。

1 4T1細(xì)胞株的應(yīng)用中存在的問題及討論

4T1細(xì)胞株是由Fred Miller等學(xué)者分離得到的可移植型乳腺癌細(xì)胞[18],因其惡性程度高易成瘤,自發(fā)向肺、肝、腦等部位轉(zhuǎn)移成為廣泛使用的移植瘤細(xì)胞。此外,4T1細(xì)胞移植瘤模型的生長狀態(tài)及轉(zhuǎn)移部位非常類似于人類晚期乳腺癌,成為評估晚期乳腺癌藥物的良好模型。筆者統(tǒng)計(jì)了近年來4T1細(xì)胞在有順鉑參與的藥效實(shí)驗(yàn)中的使用情況(表1),并從細(xì)胞的種類、使用濃度、分散介質(zhì)等方面進(jìn)行總結(jié)。

表1 4T1細(xì)胞在異體移植瘤模型中的應(yīng)用統(tǒng)計(jì)Table 1 Application statistics of 4T1 cells in xenograft tumor model

由表可見,研究者在細(xì)胞的選用方面非常統(tǒng)一,絕大多數(shù)采用未經(jīng)熒光素酶轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系進(jìn)行相關(guān)研究,植瘤前細(xì)胞分散介質(zhì)的選擇上也比較一致,然而細(xì)胞數(shù)目與注射濃度在各研究中呈多樣化。首先,在細(xì)胞類型選擇方面兩個(gè)亞類的4T1細(xì)胞被使用。就傳統(tǒng)的4T1細(xì)胞而言,移植瘤的大小通過測量腫瘤的長徑和短徑尺寸計(jì)算而來,不同實(shí)驗(yàn)者對同一腫瘤的測量結(jié)果無法從客觀上統(tǒng)一。而熒光素酶轉(zhuǎn)染的細(xì)胞從一定程度上克服了上述缺點(diǎn),可實(shí)現(xiàn)熒光定量測定,結(jié)果直觀明了,具備更強(qiáng)的說服力,但其過渡依賴于貴重儀器,加之細(xì)胞構(gòu)建方面費(fèi)用較高未被廣泛采用。筆者認(rèn)為在采取適當(dāng)措施的情況下,比如始終由同一測量者進(jìn)行實(shí)驗(yàn),傳統(tǒng)4T1細(xì)胞即可滿足實(shí)驗(yàn)精度要求。

其次,在細(xì)胞數(shù)目方面尚未有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。從統(tǒng)計(jì)結(jié)果來看,細(xì)胞數(shù)目的使用范圍在3×104～1×107個(gè)/只小鼠之間,跨度可達(dá)300倍以上,這必然會影響藥效評價(jià),不利于臨床轉(zhuǎn)化。因此,確立相對統(tǒng)一的細(xì)胞使用數(shù)目十分必要與急迫。但這并不是容易解決的事情,細(xì)胞數(shù)目的選擇還涉及到移植瘤的類型(原位或皮下)、植瘤方式(直接注射或者手術(shù)植入)、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?抑制轉(zhuǎn)移或者抑制原發(fā)灶)等多方面的問題。作為一個(gè)折中方案,(0.3～1.0)×106個(gè)/只小鼠的細(xì)胞數(shù)目值得考慮。

第三,在確認(rèn)細(xì)胞數(shù)目的前提下,細(xì)胞濃度對植瘤效果也有顯著影響。其影響往往是隱性的,比如細(xì)胞被懸浮在分散介質(zhì)中有自發(fā)聚集沉淀的傾向,細(xì)胞濃度越大沉淀可能越快;細(xì)胞過密也會影響自身活性,最終導(dǎo)致移植瘤不均一。細(xì)胞濃度由細(xì)胞使用數(shù)目與注射體積確定,在一般的移植瘤模型中注射體積多為100 μL,因此細(xì)胞濃度在107級別及以下較為合理。為了保證模型均勻、藥效評價(jià)客觀,在實(shí)驗(yàn)過程中仍需注意某些問題:(1)最好將細(xì)胞按每只小鼠的注射量單獨(dú)分裝;(2)臨注射前輕柔吹打使細(xì)胞充分分散;(3)在盡量短的時(shí)間內(nèi)用完細(xì)胞,防止活性降低影響成瘤。

最后,細(xì)胞分散介質(zhì)對成瘤有一定影響但不如其他因素重要,研究中使用PBS者較多,無血清的培養(yǎng)基與生理鹽水[28]也能滿足植瘤需要。鑒于多篇參考文獻(xiàn)沒有明確給出所用介質(zhì),筆者不能做更詳細(xì)的評價(jià)。

筆者課題組曾以1×105個(gè)/只小鼠的4T1細(xì)胞進(jìn)行脂肪墊原位植瘤研究某種銅(Ⅱ)配合物的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)共使用30只BALB/c小鼠,通過手術(shù)切開小鼠第4、5對乳頭附近的皮膚暴露脂肪墊注射100 μL 4T1細(xì)胞。在注射后的第2天觀察并測量腫瘤體積,30只小鼠均成功植入腫瘤,平均體積為(90±9)mm3,第4天觀察平均體積為(260±71)mm3,在第16天處死小鼠后檢測肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié),發(fā)現(xiàn)所有小鼠都有明顯肺轉(zhuǎn)移,說明植瘤成功且成功率100%。在另外的實(shí)驗(yàn)中,筆者以尾靜脈注射觀察肺轉(zhuǎn)移,在4T1細(xì)胞低至3×104個(gè)/只小鼠的數(shù)量時(shí)也能很好的發(fā)生肺轉(zhuǎn)移,且成功率也為100%。4T1細(xì)胞易成瘤的特性為乳腺癌的藥效學(xué)評價(jià)提供了極大的方便,然而,作為科研人員即使在使用4T1這種容易造模的細(xì)胞時(shí)也應(yīng)該仔細(xì)選擇成瘤的最佳條件以,從而避免實(shí)驗(yàn)偏差或資源浪費(fèi)。

2 4T1異體移植瘤模型中實(shí)驗(yàn)動物操作的問題及討論

在乳腺癌異體移植瘤模型中,BALB/c小鼠為近交系品種,具備遺傳背景一致,對4T1細(xì)胞沒有免疫排異,植瘤成功率高的特點(diǎn)[30-31],成為使用最為普遍實(shí)驗(yàn)動物[32-33]。筆者對表1所列文獻(xiàn)的小鼠使用情況進(jìn)行總結(jié)(表2)。

由表可知,除Zhou等[26]使用BALB/c裸鼠外,其余研究均使用BALB/c小鼠建立移植瘤模型,這是由所使用的細(xì)胞株決定的。Zhou等[26]使用熒光素酶轉(zhuǎn)染的4T1細(xì)胞,裸鼠方便成像觀測。也有研究者將4T1細(xì)胞植入BALB/c裸鼠以對比普通BALB/c小鼠的成瘤狀況,為合理選擇實(shí)驗(yàn)動物提供理論依據(jù)[34]。至于小鼠的年齡與體重則由植瘤方式和位置決定,多數(shù)研究采用4～6周齡、體重18～22 g的小鼠,然而這并非最佳選擇。如果構(gòu)建皮下瘤模型,4～6周齡的小鼠足以滿足要求;若是制作原位瘤采取脂肪墊注射的方法,此時(shí)小鼠的乳腺發(fā)育不夠充分,接種時(shí)容易漏掉細(xì)胞。顯然,7～8周齡的小鼠更適合原位脂肪墊注射。鑒于4T1細(xì)胞為乳腺癌細(xì)胞系,脂肪墊注射比皮下植瘤在模擬病 理 狀 態(tài) 上更加合理,由此而得出的藥效學(xué)評價(jià)才能更客觀和科學(xué)[15]。即使在這樣的前提下,筆者發(fā)現(xiàn)在造模過程中仍然存在較為嚴(yán)重的偏差,比如表2中多數(shù)研究者通過直接注射的方法造模。然而,這種方法不能準(zhǔn)確的將細(xì)胞植入脂肪墊內(nèi),筆者曾以臺盼藍(lán)對小鼠直接脂肪墊注射然后剖開檢測注射效果,結(jié)果表明部分臺盼藍(lán)泄漏至皮下組織。因此,筆者建議采取手術(shù)暴露脂肪墊的方式植瘤,這樣可以保證均一和精確的模型構(gòu)造。在減少小鼠創(chuàng)傷保證植瘤有效的前提下,Tavera-Mendoza等[35]提出了一種微創(chuàng)手術(shù)乳腺原位植瘤的方法,圖1列出了操作流程。在注射體積的問題上,等于或少于100 μL的注射量是正確的選擇,否則將面臨細(xì)胞泄漏的難題。

表2 4T1異體移植瘤模型中實(shí)驗(yàn)動物操作狀況Table 2 Operation status of experimental animals in 4T1 xenograft tumor model

3 在4T1異體移植瘤中順鉑的使用問題及討論

鉑類藥物以形成DNA-鉑交聯(lián)物干擾DNA復(fù)制而抑制腫瘤增殖[8],因其對攜帶乳腺癌易感基因1/2(Breast Cancer gene 1/2, BRCA 1/2)突變的細(xì)胞敏感[36],被推薦為晚期TNBC患者的救治藥物,這些患者約75%攜帶BRCA 1/2突變。順鉑是最早開發(fā)的鉑類藥物,但其副作用大,應(yīng)用受限,所以多種結(jié)構(gòu)優(yōu)化的鉑類藥物如卡鉑[37]、奧沙利鉑[38]等先后應(yīng)用于臨床。目前,仍有較多鉑類化合物正處于臨床前研究階段[10],如Cheng等[39]報(bào)道了反式鉑與DNA的作用,Muhammad等[40]研究了含有生物素的Pt(Ⅳ)配合物對乳腺癌細(xì)胞的抑制作用。納米化的鉑類藥物也處于不斷被開發(fā)的過程并取得突出進(jìn)展,曾沛玉等[41]制備了一種含順鉑前藥的介孔硅納米粒,任玉雙等[42]進(jìn)行了順鉑前藥接枝修飾硫代DNA及其自組裝靶向納米藥物研究。順鉑在這些研究中通常當(dāng)做陽性對照來使用,規(guī)范的給藥方式及劑量是衡量新藥藥效的基礎(chǔ),然而在實(shí)踐中存在較多問題,筆者對順鉑在4T1細(xì)胞移植瘤中的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行總結(jié),表3展示了研究中存在的某些問題。

表3 順鉑在4T1異體移植瘤中的應(yīng)用現(xiàn)狀Table 3 Application status of cisplatin in 4T1 xenograft tumor

注:a:腹部乳腺和乳頭;b:在第四個(gè)乳頭下方作小于3 mm(外部和尾部)的切口;c:暴露脂肪墊;d:細(xì)胞注射體積小于120 μL;e:脂肪墊復(fù)位;f:用組織粘合劑密封切口。圖片來自于參考文獻(xiàn)[35]。圖1 小鼠乳腺原位注射乳腺癌細(xì)胞的微創(chuàng)手術(shù)Note.a, Abdominal mammary gland and nipple.B, Small incision 3 mm (external and caudal) below the fourth nipple.c, Exposed fat pad.d, Exposed fat pad can be injected with a volume 120 μL.e, Fat pad is allowed to go back to its position.f, Incision is sealed using tissue adhesive.The pictures are from reference[35].Figure 1 Less invasive procedure for orthotopic injection of breast cancer cells into the mouse mammary gland

順鉑是當(dāng)前臨床使用的抗腫瘤藥物,在乳腺癌治療中常規(guī)劑量為75 mg/m2[43],在聯(lián)合治療中的用量常為25 mg/m2[44],另有文獻(xiàn)報(bào)道大劑量順鉑療法,其用量為150 mg/m2[45]。按照等效劑量換算[46],小鼠對應(yīng)的等效劑量分別為25、8.3、50 mg/kg。然而,在實(shí)際動物實(shí)驗(yàn)中小鼠的使用劑量通常為1、2、3 mg/kg,這可能是由小鼠對順鉑的耐受劑量決定的。所以,在選擇劑量的同時(shí)有必要評價(jià)藥物對實(shí)驗(yàn)動物的毒副作用,在相對安全的劑量下從事藥效學(xué)研究。在藥物劑量表達(dá)方式上也存在影響藥效評估的問題,大多數(shù)研究以化合物本身為度量標(biāo)準(zhǔn),個(gè)別文獻(xiàn)則以鉑元素的質(zhì)量為度量標(biāo)準(zhǔn),Zhou等[26]和Sengupta等[27]以1或3 mg /kg鉑元素的劑量給藥,忽略了配體對藥物活性的影響,顯然不符合臨床用藥標(biāo)準(zhǔn),但是從實(shí)驗(yàn)?zāi)康纳蟻砜催@又是合理的,因?yàn)槎呔捎眉{米藥物提高順鉑的活性,順鉑被偶聯(lián)在高分子聚合物上。在動物實(shí)驗(yàn)中另外一項(xiàng)不規(guī)范在于給藥頻次,從表3的數(shù)據(jù)可知,即使相同的給藥劑量,不同研究者的給藥頻次相差較大,這些偏差都應(yīng)該以符合臨床用藥的標(biāo)準(zhǔn)予以校正。第三,各研究者在初次給藥標(biāo)志與療程的問題上也遠(yuǎn)沒有達(dá)到統(tǒng)一,筆者認(rèn)為初次給藥時(shí)間設(shè)定在移植瘤模型造模成功之后較為合理,即腫瘤大小在50～100 mm3之間即可實(shí)施給藥,總給藥時(shí)間則由藥物長期毒性實(shí)驗(yàn)確定。在給藥方式上,多數(shù)研究者使用腹腔注射,少數(shù)報(bào)道采用尾靜脈注射,這是實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定的,例如納米藥物需尾靜脈注射,作為對照的順鉑也應(yīng)采取尾靜脈注射的方式,在這一點(diǎn)上研究者們意見一致。在4T1細(xì)胞移植瘤藥效學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)中,順鉑的使用存在諸如劑量、頻次、初次給藥時(shí)間與療程不統(tǒng)一的問題,作為研究者應(yīng)充分考慮動物實(shí)驗(yàn)與臨床應(yīng)用有效轉(zhuǎn)化的問題。

4 結(jié)語

常見的乳腺癌荷瘤小鼠模型包括皮下瘤、原位瘤和肺轉(zhuǎn)移等模型。由于模型的多樣性和實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌?所以在構(gòu)建的模型方面并沒有一個(gè)統(tǒng)一的參數(shù),筆者僅就文獻(xiàn)報(bào)道和個(gè)人經(jīng)驗(yàn)做一個(gè)大體的總結(jié),以供讀者探討。在構(gòu)建皮下瘤模型中,(3～5)×105細(xì)胞/小鼠較為合理,植瘤5～9 d可達(dá)到給藥標(biāo)準(zhǔn),且早期不會出現(xiàn)腫瘤迅速生長的現(xiàn)象,便于延長治療周期及提高療效;原位瘤則無需注射過多細(xì)胞,以(0.5～1)×105細(xì)胞/小鼠較好;尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移模型注射細(xì)胞相對較多,以(0.5～1)×106細(xì)胞/小鼠較為理想,若細(xì)胞注射過多則會導(dǎo)致肺組織損傷嚴(yán)重,小鼠過早死亡。就注射體積而言,應(yīng)特別注意將脂肪墊造模的注射體積控制在100 μL以內(nèi),以防止泄露;其他的植瘤方式可將體積控制在200 μL以下。細(xì)胞濃度則由細(xì)胞數(shù)目與注射體積決定。在分散介質(zhì)的選擇上相對寬松,3種造模方式均可選擇PBS和無血清培養(yǎng)基,但是在注射腫瘤細(xì)胞時(shí)要注意不能一次在注射器中吸取過多細(xì)胞,可保持在5只注射量以下,并及時(shí)更換注射器,防止注射期間細(xì)胞聚沉吸附到注射器壁上,從而避免植瘤不均一。在小鼠選擇上,以4～6周齡的小鼠居多,但脂肪墊注射最好選擇7～8周齡的小鼠,此時(shí)小鼠性成熟脂肪墊發(fā)育完善方便注射。如何選擇實(shí)驗(yàn)條件最終由實(shí)驗(yàn)?zāi)康拇_定,考察物質(zhì)的腫瘤抑制作用可選用皮下或脂肪墊植瘤,而肺轉(zhuǎn)移則可以選用尾靜脈造模。

臨床前藥物評價(jià)是銜接臨床應(yīng)用與基礎(chǔ)研究的橋梁[47],而動物實(shí)驗(yàn)扮演著不可或缺的角色,準(zhǔn)確而客觀的動物實(shí)驗(yàn)包括細(xì)胞選擇、動物選擇、造模與給藥觀測等多個(gè)流程,每一步都可能對藥效學(xué)研究產(chǎn)生重大影響。筆者以順鉑參與的使用4T1細(xì)胞株構(gòu)建的TNBC異體移植瘤模型為例總結(jié)了研究中存在的問題,這些問題涉及到實(shí)驗(yàn)的每一個(gè)流程,從而使得動物實(shí)驗(yàn)中取得良好抗腫瘤效果的化合物在臨床試驗(yàn)中屢屢失效,由此可見一斑。截至2020年7月,小鼠腫瘤生物學(xué)數(shù)據(jù)庫顯示至少有19242篇研究論文與小鼠腫瘤模型有關(guān),僅由美國國立衛(wèi)生研究院資助的正在進(jìn)行的人源性異種移植瘤相關(guān)研究的總預(yù)算達(dá)到1.16億美元之多。臨床試驗(yàn)的失敗沉重打擊了藥物開發(fā)的積極性,Yuan等[48]針對腫瘤模型探討了臨床試驗(yàn)失敗的原因,在184個(gè)人源性異種移植瘤模型中有170個(gè)感染了小鼠病毒,這很可能導(dǎo)致該模型的評價(jià)藥效的可靠性。除了實(shí)驗(yàn)過程存在偏差外,有些文獻(xiàn)報(bào)道缺失相關(guān)信息,甚至是細(xì)胞數(shù)目、給藥劑量、初次給藥標(biāo)志以及療程等重要信息,這給不同研究者的交流帶來很多不確定性,進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)評價(jià)的客觀性。全世界每年開展大量癌癥移植瘤模型相關(guān)動物實(shí)驗(yàn),錯(cuò)誤設(shè)定實(shí)驗(yàn)條件將浪費(fèi)大量人力、財(cái)力,而且給臨床轉(zhuǎn)化制造不可估量的困難,這就要求科研工作者慎重選擇動物模型,以權(quán)威的參考文獻(xiàn)為指導(dǎo),嚴(yán)格執(zhí)行實(shí)驗(yàn)流程,客觀評價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。新化合物進(jìn)入臨床研究的前提是動物實(shí)驗(yàn),而動物實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵則在于統(tǒng)一而準(zhǔn)確的操作規(guī)范,只有糾正實(shí)驗(yàn)偏差動物實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)才能更好的為臨床轉(zhuǎn)化服務(wù)。