張雪兒安紅偉

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,廣西 柳州 545000)

缺血性卒中(ischemic stroke)是指腦缺血缺氧導(dǎo)致腦組織損傷,進(jìn)而產(chǎn)生神經(jīng)功能缺損的一類疾病,其主要原因?yàn)槟X供血?jiǎng)用}狹窄或閉塞。缺血性卒中是全球致死和殘疾的第二大原因[1]。小膠質(zhì)細(xì)胞(microglial)作為大腦的巨噬細(xì)胞,可以監(jiān)測微環(huán)境并啟動(dòng)免疫應(yīng)答。在對各種腦損傷的反應(yīng)中,小膠質(zhì)細(xì)胞被激活并極化為M1型小膠質(zhì)細(xì)胞(促炎)或M2型小膠質(zhì)細(xì)胞(抗炎)[2]。這些小膠質(zhì)細(xì)胞所產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)分子如各種炎性因子和趨化因子分別與缺血性腦卒中后的繼發(fā)性腦損傷或腦修復(fù)密切相關(guān);近年來,許多研究發(fā)現(xiàn)在腦灌注不足的動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量顯著增加,且小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化產(chǎn)生的炎癥免疫反應(yīng)與缺血性腦卒中息息相關(guān)[2-4]。轉(zhuǎn)錄激活因子1(signal transducers and activators of transcription1,STAT1)、核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)是小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化相關(guān)通路中的關(guān)鍵因子[1]。近期研究發(fā)現(xiàn)在機(jī)體缺血缺氧狀態(tài)下,HIF-1α表達(dá)升高,小膠質(zhì)細(xì)胞活化明顯[5]。因此,研究推測HIF-1α參與小膠質(zhì)細(xì)胞活化極化過程。本研究用不同濃度的重組HIF-1α蛋白處理體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞,觀察HIF-1α對小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的影響以及對小膠質(zhì)細(xì)胞p-STAT1、NF-κB p65和TRAF6蛋白的表達(dá)影響,以期明確HIF-1α是否參與小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化過程以及其參與機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞—BV-2細(xì)胞系(武漢普諾賽生命科技有限公司)。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM/F12培養(yǎng)基(gibco,貨號(hào):C11330500BT);南美胎牛血清(gibao,貨號(hào):10270106);雙抗(gibco,貨號(hào):15140122);重組HIF-1α蛋白(prospec,貨號(hào):PRO-477);蛋白marker(thermo,貨號(hào):26616);iba1抗體(novus biologicals,貨號(hào):NB100-1028);猴抗羊IgG-FITC(proteintech,貨號(hào):SA00003-3);DAPI(abcam,貨號(hào):ab104139);GAPDH(CST,貨號(hào):D16H11);NF-κB p65(bioss,貨號(hào):BSM-33059M);p-STAT1(santa,貨號(hào):sc-8394);TRAF6(santa,貨號(hào):sc-8409);羊抗兔IgG(bioss,貨號(hào):bs-0295G);羊 抗 鼠IgG(bioss,貨 號(hào):bs-40296G);10%山羊血清(beyotime,貨號(hào):C0265);BSA(biofroxx,貨號(hào):4240GR100);meilunbio飛克特超敏ECL發(fā)光液(meilunbio,貨號(hào):MA0186);抗體稀釋液(beyotime,貨號(hào):WB100D)。

共聚焦顯微鏡(nikon);化學(xué)發(fā)光儀(BLT);酶標(biāo)儀(thermo);電泳槽(晟利科技,貨號(hào):seli-1-0248);電泳儀(bio-rad);電轉(zhuǎn)芯(easybio,貨號(hào):BE6092);CO2培養(yǎng)箱(biobase)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

采用DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清和雙抗培養(yǎng)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞,置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)并傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞,接種于24孔板(細(xì)胞爬片提前置于24孔板內(nèi))和6孔板,加培養(yǎng)基培養(yǎng)1 d后隨機(jī)分為6組:Control組、10、50、100、200和500 μg/L缺氧誘導(dǎo)因子1α重組蛋白刺激組,每組設(shè)3個(gè)副孔。Control組不作處理;重組HIF-1α蛋白處理組分別用重組HIF-1α蛋白10、50、100、200和500 μg/L處理BV-2細(xì)胞24 h。

1.3.2 iba1熒光共聚焦

吸凈二十四孔板里的培養(yǎng)基,PBS洗1遍;用4%多聚甲醛將二十四孔板里的細(xì)胞爬片固定15 min,PBS洗3遍;用0.5% Triton通透細(xì)胞爬片10 min,洗3遍;扣出細(xì)胞爬片放入濕盒,用10%山羊血清室溫保濕封閉1 h;往每張爬片上滴加Iba1抗體(1∶500,羊抗)4℃保濕孵育過夜。次日洗3遍后,滴加猴抗羊IgG-FITC(1∶100),室溫保濕避光孵育1 h,洗3遍,DAPI避光復(fù)染后,共聚焦熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3.3 蛋白免疫印跡

按照上述分組處理細(xì)胞后,收集各組細(xì)胞,采用BCA法對各組蛋白進(jìn)行定量,計(jì)算上樣量。取樣進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白,濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜,據(jù)需要的目的蛋白分子量切取條帶,BSA封閉2 h,放入稀釋好的GAPDH(1∶1000,兔抗)、NF-κB p65(1∶1000,兔單克隆抗體)、p-STAT1(1∶200,鼠單克隆抗體)和TRAF6(1∶200,鼠單克隆抗體),4℃孵育過夜,后放置于羊抗兔IgG(1∶5000)、羊抗鼠IgG(1∶5000),4℃孵育2 h,加入發(fā)光液,放入儀器成像。采用Image J軟件測量條帶灰度值并進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 9.2進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組比較采用t檢驗(yàn),多組比較采用單因素方差分析(One-ANOVA),P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上。

2 結(jié)果

2.1 重組HIF-1α蛋白對小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的影響

Control組可觀察到BV-2細(xì)胞突起較多,呈細(xì)長狀,且胞體較為扁平(圖1A箭頭);與Control相比,10、50 μg/L重組HIF-1α蛋白處理組BV-2變化相對不明顯,僅為突起稍變短(圖1B、1C箭頭);然而,與Control組相比,100、200、500 μg/L HIF-1α重組蛋白組BV-2細(xì)胞可觀察到突起變少變粗短,胞體變圓變鈍(圖1D、1E箭頭),尤其500 μg/L組BV-2細(xì)胞類似于巨噬細(xì)胞,胞體相對更為圓鈍(圖1F箭頭)。

2.2 蛋白免疫印跡檢測結(jié)果

重組HIF-1α蛋白刺激前后的細(xì)胞NF-κB p65和TRAF6蛋白表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),p-STAT1蛋白表達(dá)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。Control組NF-κB p65和TRAF6蛋白表達(dá)量很少,經(jīng)HIF-1α重組蛋白刺激后,不同濃度組NF-κB p65和TRAF6蛋白表達(dá)量升高(圖2)。給予重組HIF-1α蛋白刺激后,與Control組相比,50 μg/L濃度以上各組NF-κB p65表達(dá)均明顯上升,100 μg/L濃度以上各組TRAF6表達(dá)均明顯升高,且NF-κB p65和TRAF6蛋白表達(dá)在刺激濃度不同的組間也有明顯差異(圖3,P＜0.05);然而不同濃度組p-STAT1蛋白與Control相比含量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3,P＞0.05)。

圖2 蛋白免疫印跡檢測BV-2細(xì)胞NF-κB p65、p-STAT1 and TRAF6表達(dá)Figure 2 Expressions of NF-κB p65, p-STAT1 and TRAF6 in BV-2 cells were investigated by Western blot

3 討論

缺血性腦卒中一直是老年人病死及致殘的一大原因,對社會(huì)及個(gè)人均產(chǎn)生較大的負(fù)擔(dān)。M1型小膠已被證實(shí)可分泌促炎細(xì)胞因子,使機(jī)體保持促炎狀態(tài),進(jìn)而促進(jìn)缺血性腦卒中后腦損傷的發(fā)生[6]。研究表明在缺血性卒中發(fā)生后,M1型小膠質(zhì)細(xì)胞被活化,從而發(fā)揮有害作用。梗死模型小鼠中發(fā)現(xiàn),小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著增加,小膠質(zhì)細(xì)胞趨于M1型極化,其產(chǎn)生的趨化因子可將CD8+的殺傷T細(xì)胞招募到缺血腦組織,被認(rèn)為是加重腦梗死的主要因素[7],而其分泌炎性因子可增加缺血性卒中后內(nèi)皮壞死和血腦屏障滲漏,進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)炎癥和腦水腫,最終導(dǎo)致預(yù)后不良[8]。因此,本研究從M1型小膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響因素及其機(jī)制進(jìn)行探討,為探索治療缺血性卒中新方向奠定基礎(chǔ)。研究表明當(dāng)機(jī)體缺氧時(shí),體內(nèi)HIF-1α上升,大腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞活化且炎性介質(zhì)表達(dá)增高,當(dāng)抑制NF-κB的活化,HIF-1α的產(chǎn)生減少[9],此外,在癲癇小鼠體中,HIF-1α表達(dá)增加可導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加,并誘導(dǎo)其極化至M1型,從而觸發(fā)促炎介質(zhì)的釋放[10],且當(dāng)下調(diào)HIF-1α表達(dá)及其參與通路可減少小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化,從而減弱機(jī)體炎癥反應(yīng)[11]。雖然上述過往及最新研究均表明HIF-1α可能與小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化相關(guān),但是HIF-1α是否能直接作用于小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)而引起其M1極化并不明確,因此,本研究采用體外實(shí)驗(yàn)證明HIF-1α對小膠質(zhì)細(xì)胞的作用。本研究采用重組HIF-1α蛋白胞外直接刺激小膠質(zhì)細(xì)胞,用共聚焦免疫熒光顯微鏡觀察小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài),發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)偏向M1型極化,說明HIF-1α可能促使小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生M1型極化。目前國內(nèi)外關(guān)于HIF-1α對小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化的作用機(jī)制并不明確。過往研究表明當(dāng)機(jī)體缺血/缺氧時(shí),NF-κB在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)被激活,從而促使小膠質(zhì)細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子,如IL-1β(interleukin-1β,IL-1β)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)等,最終導(dǎo)致繼發(fā)性腦功能受損;轉(zhuǎn)錄因子NF-κB被證實(shí)可以激活小膠質(zhì)細(xì)胞,并將這些激活的細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M1表型,黃芩素通過減少NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位抑制NFκB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),抑制小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化,從而減少促炎因子IL-6、IL-18和TNF-α的釋放[12],此外,抑制激活的NF-κB上調(diào)可減少HIF-1α的產(chǎn)生,從而減弱缺血性卒中后產(chǎn)生的一系列的腦神經(jīng)免疫炎癥反應(yīng)[13]。本研究聚焦于NF-κB p65蛋白,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過重組HIF-1α蛋白刺激后,NF-κB p65表達(dá)量明顯上升(圖3),說明NF-κB p65參與小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化過程。既往研究發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化涉及的通路包括酪氨酸激酶(janus kinase,JAK)/STAT1/NF-κB通 路、JAK2/STAT3/NF-κB通 路 和Toll樣受體(toll-like receptor-4,TLR4)/髓樣分化蛋白抗原(myeloid differential protein-88,myd88)/NFκB通路[1],具體見圖4。在缺氧狀態(tài)時(shí),發(fā)現(xiàn)激活的BV-2細(xì)胞中p-STAT1水平顯著升高,同時(shí)M1小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物白細(xì)胞分化簇(cluster of differentiation,CD68)表達(dá)水平升高[14]。Luo 等[15]和Zhou等[16]發(fā)現(xiàn)TLR4是小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化可能的細(xì)胞因子受體,而TRAF6是TLR4/Myd88通路中的關(guān)鍵因子,TRAF6可能與小膠質(zhì)M1極化有關(guān)。為了驗(yàn)證p-STAT1和TRAF6對小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化的影響,本研究檢測了p-STAT1和TRAF6蛋白表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)TRAF6在重組HIF-1α蛋白刺激后表達(dá)顯著升高,而p-STAT1表達(dá)沒有顯著變化(圖3),說明TRAF6和NF-κB p65參與小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化過程,我們推測HIF-1α可能通過TLR4/Myd88/NF-κB通路引起小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生M1型極化,p-STAT1經(jīng)HIF-1α刺激后無顯著差異,這可能是因?yàn)樗饕?jīng)過其他通路使小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生M1型極化,也可能是因?yàn)榱姿峄奈稽c(diǎn)本次實(shí)驗(yàn)采用的位點(diǎn),可以增加其他磷酸化位點(diǎn)的p-STAT1進(jìn)行再一次驗(yàn)證。然而有意思的是NF-κB p65在HIF-1α濃度為50 μg/L以上才有明顯升高,而TRAF6需要HIF-1α濃度達(dá)到100 μg/L以上才有明顯提高,關(guān)于兩個(gè)蛋白HIF-1α刺激閾濃度的不同有待進(jìn)一步研究;但值得肯定的是兩者在HIF-1α為10 μg/L時(shí)均不出現(xiàn)明顯變化(圖3),且從共聚焦的圖片來看,HIF-1α的刺激濃度超過50 μg/L才會(huì)開始使小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化(圖1),這些結(jié)果說明需要達(dá)到一定的濃度HIF-1α才能使小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生M1型極化。本研究初步探索了HIF-1α對小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化的可能機(jī)制。然而,HIF-1α對小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化是否存在其他的共同作用機(jī)制尚不完全清楚,需要進(jìn)一步的體外和體內(nèi)研究來證實(shí)。

圖4 小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化的機(jī)制圖[1]Figure 4 Mechanistic diagram of M1 polarization in microglia

注:A:對照組;B:10 μg/L缺氧誘導(dǎo)因子1α重組蛋白刺激組;C:50 μg/L缺氧誘導(dǎo)因子1α重組蛋白刺激組;D:100 μg/L缺氧誘導(dǎo)因子1α重組蛋白刺激組;E:200 μg/L缺氧誘導(dǎo)因子1α重組蛋白刺激組;F:500 μg/L缺氧誘導(dǎo)因子1α重組蛋白刺激組。與對照組相比, *P＜0.05, **P＜0.1, ***P＜0.01;與200、500 μg/L缺氧誘導(dǎo)因子1α重組蛋白刺激組相比, #P＜0.05;與500 μg/L缺氧誘導(dǎo)因子1α重組蛋白刺激組相比, ##P＜0.01。圖3 缺氧誘導(dǎo)因子1α對NF-κB p65、p-STAT1和TRAF6蛋白表達(dá)量的影響Note.A, Control group.B, 10 μg/L HIF-1α treatment group.C, 50 μg/L HIF-1α treatment group.D, 100 μg/L HIF-1α treatment group.E, 200 μg/L HIF-1α treatment group.F, 500 μg/L HIF-1α treatment group.Compared with control group, *P＜0.05, **P＜0.1, ***P＜0.01.Compared with 200 and 500 μg/L HIF-1α treatment group, #P＜0.05.Compared with 500 μg/L HIF-1α treatment group, ##P＜0.01.Figure 3 Effects of HIF-1α on the expression of NF-κB p65, p-STAT1 and TRAF6 proteins

注:A:對照組;B:10 μg/L缺氧誘導(dǎo)因子1α重組蛋白刺激組;C:50 μg/L缺氧誘導(dǎo)因子1α重組蛋白刺激組;D:100 μg/L缺氧誘導(dǎo)因子1α重組蛋白刺激組;E:200 μg/L缺氧誘導(dǎo)因子1α重組蛋白刺激組;F:500 μg/L缺氧誘導(dǎo)因子1α重組蛋白刺激組。圖1 缺氧誘導(dǎo)因子1α誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化Note.A, Control group.B,10 μg/L HIF-1α treatment group.C, 50 μg/L HIF-1α treatment group.D, 100 μg/L HIF-1α treatment group.E, 200 μg/L HIF-1α treatment group.F, 500 μg/L HIF-1α treatment group.Figure 1 HIF-1α induced polarization of M1 in microglia

綜上,本研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化,其作用機(jī)制可能通過上調(diào)TLR4/Myd88/NF-κB通路來實(shí)現(xiàn)的。