董桃杏,張國森,楊 劭 (1.華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北 武漢 40079；2.湖北第二師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,湖北 武漢 40205；.河南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河南 開封 475004)

雙酚 A(BPA)是一種重要的有機(jī)化工原料,被用于多種精細(xì)化工產(chǎn)品[1-2].BPA具有雌激素活性,對生物和人體細(xì)胞具有生物學(xué)毒性,是一種典型的環(huán)境激素類污染物[3].在BPA的生產(chǎn)、加工和使用過程中,大量的 BPA 被釋放到環(huán)境中,隨地表徑流輸入,導(dǎo)致水體成為BPA的主要蓄積庫.據(jù)報道BPA 在世界上很多水環(huán)境中都有發(fā)現(xiàn),被檢測出來的濃度范圍0.33～900ng/L[4-8].水環(huán)境中BPA產(chǎn)生的人類健康和生態(tài)風(fēng)險已經(jīng)引起廣泛關(guān)注[9-13],并成為歐盟水框架指令中首要控制的污染物之一[14].

生物降解是水環(huán)境 BPA 消除的主要途徑.許多微生物能夠利用環(huán)境中天然的芳香族化合物作為底物,從而高效降解BPA.Oshiman等[15]從受污染的土壤中篩選到的 Sphingomonas bisphenolicum strain AO1 能夠以 BPA為唯一碳源和能源迅速礦化 BPA.真菌類比如木質(zhì)素真菌(Lignolitic fungi)也具有高效降解 BPA的能力,并且其降解產(chǎn)物完全沒有雌激素活性[16-17].對生物降解 BPA的機(jī)制進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),POD發(fā)揮著重要的作用.據(jù)報道真菌中降解BPA的關(guān)鍵酶主要包括木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)、錳過氧化物酶(MnP)以及多功能過氧化物酶(VP)[18].植物POD也在BPA降解過程中扮演著重要角色.如辣根POD可以降解61%的BPA[19].在腐殖酸催化情況下,辣根POD在2min內(nèi)就將BPA完全降解[20].Reis等[21]也認(rèn)為POD是水生植物降解BPA的主要酶.

本文前期進(jìn)行過大量的植物篩選,通過比選常見水生植物如金魚藻、輪葉黑藻、伊樂藻、狐尾藻等對 BPA的降解能力,發(fā)現(xiàn)金魚藻降解效率最高而富集率最低,分別為98.9%和 0.1%,而其他幾種水生植物降解率則為59.2%～90.3%,富集率為0.97%～3.5%[22].另外金魚藻對BPA的單位降解效率最高可以達(dá)到 0.204mg/(g·d),遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他陸生植物和水生植物[23-25].通過相關(guān)實驗發(fā)現(xiàn)H2O2是降解過程的必須條件,推測POD是金魚藻降解BPA的關(guān)鍵酶[26].由于水生植物是濕地生態(tài)系統(tǒng)的主要生物類群,其對污染物的降解在濕地污染生態(tài)學(xué)中具有重要科學(xué)意義.雖然有關(guān)陸生植物對 BPA的降解效率和降解酶已有報道,但沉水植物降解 BPA的特性和機(jī)制尚無深入研究.因此,本文在前期研究的基礎(chǔ)上,選擇降解BPA效率最高的金魚藻,探討金魚藻純化POD的酶學(xué)特點以及對 BPA的降解性能,旨在揭示沉水植物高效降解水環(huán)境中BPA污染物的機(jī)制,及POD在此降解過程中發(fā)揮的重要作用,為水環(huán)境中 BPA的植物修復(fù)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

金魚藻(Ceratophyllum demersum L.)采自湖北武漢東湖.

受試斑馬魚為成年雄性魚,購于中科院武漢水生生物研究所,在 50cm×30cm×40cm的水族箱中馴養(yǎng)1個月,每天光照12h,水溫為(28±1)℃,每天早晚各喂食1次,馴養(yǎng)結(jié)束后選擇大小一致的斑馬魚進(jìn)行實驗.

BPA標(biāo)準(zhǔn)品(純度 97%)購自美國 Acros Organics公司,用色譜級甲醇(TEDIA,美國)配置成20mmol/L的母液待用, 4℃保存.乙腈(色譜純)購自美國 TEDIA公司.高效液相色譜儀為SHIMADZU LC20AT(日本).

1.2 金魚藻無菌苗的制備與培養(yǎng)

參照Zhou等[27]的方法,將采集來的野生苗材料消毒預(yù)處理后,轉(zhuǎn)入含有1/2MS (pH5.5)培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng),待萌發(fā)新芽后擴(kuò)繁培養(yǎng),取培養(yǎng) 4代后的無菌苗用于實驗.

1.3 金魚藻POD粗酶的提取及酶活力測定

金魚藻 POD粗酶的提取按照周艷虹等[28]的方法進(jìn)行改進(jìn),具體過程為:稱取0.2g 鮮重的金魚藻無菌苗放入預(yù)冷的研缽中,置于冰上,加入3mL預(yù)冷的50mmol/L pH 7.8的磷酸鹽緩沖液,充分研磨均勻后轉(zhuǎn)入10mL 離心管內(nèi),用3mL緩沖液將研缽潤洗2次,一并轉(zhuǎn)入離心管內(nèi),4℃ 12000r/min離心 10min,上清即為POD粗酶液.

POD活力測定參考Kochba等[29]的做法.具體過程為:100μL粗酶上清液加入到2900μL的反應(yīng)體系中,每隔20s測定470nm下的OD值,以O(shè)D470變化0.01為1個酶活力單位,計算POD活力.反應(yīng)體系由5μmol/L 愈創(chuàng)木酚,12μmol/L H2O2,200μmol/L pH 6.0磷酸鹽緩沖液組成.

酶相對活性測定是以溫度30℃,pH 6以及H2O2濃度為1mmol/L條件下酶活為100%,其他處理條件下測定的酶活與之相比計算所得.

1.4 金魚藻POD的純化和純度測定

取粗酶上清,經(jīng)硫酸銨分級沉淀,取60%～90%沉淀部分,用提取緩沖液溶解后 4℃透析過夜.使用AKTA 蛋白純化系統(tǒng)(PRIFER100,美國 GE)對透析后的粗酶溶液進(jìn)行純化,共 2步純化.第一步用陰離子交換柱進(jìn)行純化,收集280nm波長下的峰,并進(jìn)行過氧化物酶活測定,同時測定蛋白濃度,計算比酶活力與回收率.第二步用葡聚糖凝膠 G75將上述收集到的具有酶活力的峰進(jìn)行純化,收集 280nm波長下的峰,并進(jìn)行過氧化物酶活測定,將具有過氧化物酶活力的峰進(jìn)行冷凍干燥濃縮,測定蛋白濃度,計算比酶活力與回收率.將純化后的蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE和Native-PAGE電泳分析[30].

金魚藻POD的純度可用Rz值表示[31]

式中:OD403為血紅素輔基的吸光值;OD280為樣品中總蛋白吸光值;一般認(rèn)為Rz＞2時,酶的純度較高.

1.5 不同理化條件對金魚藻POD活力的影響

分析不同溫度、pH值、H2O2濃度等條件金魚藻POD活力的影響,反應(yīng)體系與上述相同.將100μL濃度為50U/mL的純化POD與反應(yīng)體系混合均勻,在不同溫度、pH值、H2O2濃度條件下處理后測定金魚藻 POD活力.其中溫度梯度為10,20,30,40,50,60,70,80,90℃; pH值梯度為3,4,5,6,7,8,9; H2O2濃度梯度分別為0.2,0.5,1,5,10,20mmol/L.

1.6 金魚藻POD降解BPA的特性分析

在降解體系中加入各不同處理,混合均勻后置于溫度為30°C、光照為50μmol/(m2·s)的條件下進(jìn)行反應(yīng),比較溫度對降解率影響的實驗則將混合液放在對應(yīng)溫度梯度下.降解體系由濃度為0.02mmol/L的BPA及1mmol/L的H2O2和無菌蒸餾水組成,純化金魚藻 POD體積為100μL,總體積為20mL;每個處理設(shè)置 3個平行,對照組加入等量酶提取緩沖液代替純化酶液,每隔15min測定反應(yīng)體系中BPA的濃度.其中POD濃度處理為5,10,25和50U/mL 4個梯度;另外幾個條件實驗中 POD濃度均設(shè)置為50U/mL,其中 H2O2濃度為0.5,1,5,10,20mmol/L;溫度為10,20,30,40,50,60,70,80,90°C;pH值為3,4,5,6,7,8,9.

動力學(xué)參數(shù)測定:取 50U/mL的純化金魚藻POD酶投入到含有4×10-5～0.02mmol/L的BPA反應(yīng)體系中,每隔15min測定反應(yīng)體系中BPA的濃度,測定米氏常數(shù) Km和最大反應(yīng)速度 Vmax并做雙倒數(shù)圖.

1.7 BPA濃度的測定

BPA的濃度采用高效液相色譜法進(jìn)行測定.培養(yǎng)液中的 BPA濃度測定方法為:先將培養(yǎng)液經(jīng)過0.22μm 濾膜過濾后用于進(jìn)樣檢測.高效液相色譜柱為C18反相柱(250mm×4.6mm×5μm).測定條件為流動相乙腈:超純水(含0.3%三氟乙酸)=65:35(體積比),檢測波長為紫外278nm,流速1mL/min.

1.8 斑馬魚的毒性

通過測定斑馬魚在不同實驗條件下馴養(yǎng)后血液中卵黃原蛋白(VTG)含量,來反應(yīng)金魚藻 POD 降解BPA后的產(chǎn)物對其毒性影響.共設(shè)置3個斑馬魚暴露處理組,A組:終濃度為0.02mmol/L的BPA溶液;B組:經(jīng)金魚藻 POD完全降解A組溶液后的產(chǎn)物;C組:等體積甲醇代替 BPA.實驗用水為曝氣48h后的自來水,總體系為3L,BPA母液用量為3mL.每個處理組6只斑馬魚,每2只斑馬魚的血清混合作為一個平行樣,共3個平行.毒性試驗持續(xù)5d.

斑馬魚血液中卵黃原蛋白(VTG)含量測定:斑馬魚血液采集參考 Babaei等[32]的方法離心取血獲得血清.血清中的VTG含量使用斑馬魚卵黃蛋白原ELISA檢測試劑盒(南京金益柏)進(jìn)行測定,具體方法參考使用說明.

1.9 數(shù)據(jù)分析

分別采用SPSS 16.0和Origin pro 8.0;不同條件處理對POD活性影響及對BPA去除率的差異性比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA,Duncan tests);數(shù)據(jù)正態(tài)分布和均一性檢驗分別采用Kolmogorov—Smirnov test和 Levene’s test.差異顯著表示為P＜0.05.

2 結(jié)果與分析

2.1 金魚藻POD的純化

由圖1可知,在280nm紫外條件下,通過陰離子交換層析共發(fā)現(xiàn)2個蛋白峰P1和P2(圖1(a)),收集檢測后發(fā)現(xiàn)P1具有較高的POD酶活力,純化倍數(shù)為5.47倍.將該峰進(jìn)一步通過葡聚糖凝膠 G-75分離,發(fā)現(xiàn)有2個蛋白峰,其中P4具有POD酶活力,即為純化的金魚藻 POD(圖1(b)),純化倍數(shù)為8.13倍,測定 Rz值為2.88,回收率達(dá)到 61.57%(表1).經(jīng)電泳分析發(fā)現(xiàn)只有一條帶,證明本純化方法較為有效.

圖1 金魚藻POD陰離子交換層析和葡聚糖凝膠 G-75過濾結(jié)果Fig.1 Ion exchange chromatography and sephadexG-75column gel filtration of POD from C.demersum

2.2 不同條件下金魚藻POD酶活特性

由圖2可見,在10℃時POD相對酶活力為55%,隨著溫度升高,POD 相對酶活力逐漸增加,40～70℃時,POD的相對酶活力均大于100%(P＜0.05),在70℃時相對酶活力最大,達(dá)到117%,說明溫度升高顯著提高了POD的酶活性,而在80℃時POD的相對酶活力仍有78.52%,表明金魚藻POD具有較寬溫度耐受范圍,在較高的溫度下仍能保持較高活性(圖2(a)).大豆POD被公認(rèn)為熱穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于辣根POD以及其他類似POD,在70℃時仍可保持較高的活力,85℃下加熱40min仍保留50%酶活力[33-35],與大豆POD相比,金魚藻POD能承受較高溫度且保持較高活性,是一種熱穩(wěn)定性非常高的POD.

pH值對POD相對酶活性的影響也具有與溫度相似趨勢.在pH值為3時,POD相對酶活力較低,為36.1%,pH值在 5～7之間具有較高的相對酶活力,而其最適合的 pH值為5,POD相對酶活性最高,為107.5%,當(dāng)pH值增至8時,該酶相對活力仍然維持在52.7%,表明金魚藻 POD具有較高的酸堿穩(wěn)定性(圖2(b)).金魚藻POD在pH值為5～7時具有較高相對活性,這一特性與大多數(shù)POD相似,如純化后的銀杏葉POD最適pH值為5[36],菠蘿蜜POD最適pH值則為6.5[37].

H2O2濃度方面,隨著H2O2濃度的升高,POD的相對酶活力呈升高后降低的趨勢,在 H2O2濃度為0.2mmol/L時,POD的相對酶活力僅為36.5%,當(dāng)H2O2濃度增加至 5mmol/L時,POD的相對酶活力最高(P＜0.05),達(dá)119.22%,隨后POD相對酶活力逐漸下降(圖2(c)).H2O2是POD酶的底物之一,本研究中發(fā)現(xiàn)其最適濃度為5mmol/L.H2O2過量并不會提高酶活性,可能是因為生成更多的中間產(chǎn)物,從而對酶活性產(chǎn)生抑制作用,或者是過量的H2O2直接導(dǎo)致酶失活[38].

圖2 不同條件對金魚藻POD酶活力的影響Fig.2 Effect of different conditions on the activity of POD from C.demersum

2.3 金魚藻POD降解BPA的特性

通過比較不同金魚藻POD活性下BPA降解率(圖3(a)),發(fā)現(xiàn)隨著POD酶活性的增加,BPA降解率也隨之提高,當(dāng)POD濃度為5U/mL時BPA已降解44.64%,在濃度增加到10U/mL時BPA降解率達(dá)到99.67%,當(dāng)POD濃度為25U/mL及以上時BPA已完全降解.由此可見,金魚藻POD降解BPA的最低濃度為10U/mL.從圖3(b)可以看出,當(dāng) H2O2的濃度從0.5mmol/L增加到5mmol/L時,BPA降解率顯著升高,由 33.1%增加至 99.8%,幾乎完全降解,當(dāng)H2O2的濃度進(jìn)一步增加時, BPA降解率開始下降,在 H2O2濃度為20mmol/L時BPA降解率減至52.6%.表明BPA降解的最適 H2O2濃度范圍是 1～5mmol/L.金魚藻POD降解BPA的溫度適應(yīng)范圍較大.在溫度為10℃時,BPA降解率即超過90%,隨著溫度增加BPA降解率逐漸升高,在 30～50℃時 BPA 的降解率全部超過99.5%;當(dāng)溫度超過60℃時,POD對BPA的降解率開始下降,在溫度增加至 80℃時降解率為40.6%,不過在 90℃高溫時仍然有 18.4%的 BPA 得到降解(圖3(c)).如圖3(d)所示,在pH值為3時,BPA有55.2%得到降解.隨著pH值增加,BPA降解率也隨之提高.在pH5～7范圍內(nèi),BPA 降解率維持在 97.6%～99.8%,當(dāng)pH＞7時,BPA降解率有所下降,在pH值為9時BPA降解率維持在36.2%.由此表明金魚藻POD在降解BPA時pH值的作用范圍非常寬泛,而最適降解條件發(fā)生在酸性～中性范圍.

圖3 不同條件對金魚藻POD降解BPA的影響Fig.3 Effect of different conditions on degradation rate of BPA by POD from C.demersum

杜紅霞[39]探討了辣根過氧化物酶(HRP)對 BPA的降解性能,發(fā)現(xiàn) 0.5U/mL HRP在 120min內(nèi)對0.2mmol/L BPA的降解效果最好,降解率為63%,該酶促反應(yīng)的最適溫度為25℃,最適pH值為6, H2O2最適濃度為0.4mmol/L.馬鈴薯過氧化物酶在濃度為200U/mL,H2O2濃度為1.0mmol/L,溫度和pH值分別為25℃和6的條件下反應(yīng)10min后,可將0.8mmol/L的BPA降解99%以上[40].從潤楠成熟葉片中分離得到的 POD在濃度大于 50U/mL,H2O2濃度為0.1mmol/L,溫度為10～60℃,pH4～7的條件下,經(jīng)過3h對 0.2mg/L的 BPA清除率可達(dá)到 95%以上[41].在25℃,pH值為4～8條件下,1.28U/L的蘿卜 POD和0.8mmol/L的H2O2與0.5mmol/L BPA反應(yīng)3h后,BPA濃度減少超過85%[42].由前人研究結(jié)果可知,不同植物來源POD對BPA的降解特性有著較大差別,在不同條件下對BPA的清除效率也有所不同.大多數(shù)POD都是在常溫下才具有較好的降解效果,本研究發(fā)現(xiàn)金魚藻 POD在溫度較高的情況下也能發(fā)揮很好的降解作用,這可能歸因于金魚藻POD良好的熱穩(wěn)定性,此特性也是該酶優(yōu)于其他來源POD的一個重要方面.金魚藻POD寬泛的溫度以及pH值作用范圍使其在降解 BPA時可以保持較高的活性,加上該酶與 BPA有著較高的親和能力,因此在濃度較低,時間較短的條件下可以快速降解 BPA.這些結(jié)果表明相對于其他陸生植物和水生植物而言,具有優(yōu)良特性的金魚藻 POD可能是該植物體可以高效降解BPA的重要原因.

2.4 金魚藻POD降解BPA的動力學(xué)研究

如圖4所示,擬合直線相關(guān)系數(shù)達(dá)到 0.9992,可見金魚藻POD降解BPA的反應(yīng)動力學(xué)符合米氏方程.根據(jù)方程斜率和截距可計算出該反應(yīng)的米氏常數(shù) Km和最大反應(yīng)速度 Vmax,分別為0.09mmol/L和9.71mmol/(L·h).Km是估計反應(yīng)底物與酶結(jié)合情況的平衡常數(shù).Km值越低,酶與底物的親和力越高.金魚藻POD的Km值較低,說明金魚藻POD與BPA有著較高的親和能力,這也與其高效降解 BPA的結(jié)果一致.杜紅霞[39]對辣根POD降解BPA進(jìn)行了反應(yīng)動力學(xué)的研究,測得的米氏常數(shù)為0.093mmol/L,與本實驗結(jié)果相近,說明金魚藻POD降解BPA的動力學(xué)特征與辣根POD比較相似.

圖4 金魚藻POD降解BPA的雙倒數(shù)曲線Fig.4 Lineweaver-Burk plot for the degradation of BPA by POD from C.demersum

2.5 BPA降解產(chǎn)物的毒性分析

由圖5可知,不同處理對斑馬魚血液中VTG含量有著不同的影響.A組加入BPA后第1d斑馬魚就全部死亡,因此未檢測其體內(nèi)的VTG含量;B組處理中斑馬魚接觸的是金魚藻純化POD與BPA完全反應(yīng)之后的混合物,溶液中含有的主要是 BPA的降解產(chǎn)物,沒有BPA殘留,經(jīng)測定,斑馬魚體內(nèi)VTG含量為0.18mg/L;C組斑馬魚生長在自來水中,其體內(nèi)VTG含量為0.22mg/L.由此可見,與空白對照C組相比, B組中斑馬魚VTG含量并未顯著增加(P＜0.05),說明金魚藻 POD將 BPA完全降解后,消除了 BPA對斑馬魚產(chǎn)生的致死作用,其體內(nèi)雌激素含量與正常水平非常接近,表明BPA被POD降解后其降解產(chǎn)物對斑馬魚也不具有雌激素效應(yīng).

BPA作為一種內(nèi)分泌干擾物,主要是通過引起不利的生化和生理變化來改變細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)和組織器官的功能,從而干擾生殖效率[43].生殖系統(tǒng)中顆粒細(xì)胞通過產(chǎn)生雌激素在卵巢生理中起著重要的作用,而 BPA 作用的靶標(biāo)已被證明是卵巢顆粒細(xì)胞,它可以通過破壞卵巢類固醇生成以及增加血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的量來干擾顆粒細(xì)胞功能,從而對生殖效率產(chǎn)生重要影響[44].VTG已被廣泛用作BPA對魚類內(nèi)分泌干擾標(biāo)志物[45].本研究將斑馬魚暴露在金魚藻POD與BPA完全反應(yīng)后的水中,測定了斑馬魚血液中VTG含量,結(jié)果表明,此含量與對照相比并沒有顯著變化,說明BPA經(jīng)金魚藻POD處理后,其對斑馬魚的雌激素效應(yīng)得到清除,由此可以推斷其降解產(chǎn)物不再具有內(nèi)分泌干擾作用.Sakuyama等發(fā)現(xiàn)與 BPA共同培養(yǎng)的雄性青鳉魚(Oryzias latipes)血液中的VTG含量顯著增加,而經(jīng)辣根POD處理BPA后,青鳉魚未出現(xiàn)雌激素活性增加的現(xiàn)象,表明HRP能夠降解BPA,因此對青鳉魚不產(chǎn)生雌激素效應(yīng)[46],本文結(jié)果與之相一致,后續(xù)研究將對金魚藻POD對BPA的代謝產(chǎn)物做進(jìn)一步的分析和鑒定.

沉水植物是湖濱帶河濱帶淺水水體常見水生植被,適應(yīng)性強(qiáng),分布廣,生物量大,是淺水水體污染物植物修復(fù)的主要工具類型[47].而BPA是一種全球性的污染物[48],水環(huán)境則是 BPA的主要富集區(qū)[49-50].因此研究水生植物對水環(huán)境中BPA的清除有著重要的生態(tài)學(xué)意義和實際應(yīng)用價值.目前關(guān)于BPA降解的文章都是針對陸生植物,且研究思路主要是直接利用植物的純化POD處理水中BPA污染物,并非探討植物體對 BPA 的生物降解機(jī)制,從生態(tài)系統(tǒng)角度出發(fā)的研究報道很少,而清楚了解水生植物降解BPA污染物的機(jī)理和機(jī)制可以為實際水體植物修復(fù)工作的推廣和應(yīng)用提供重要的理論依據(jù).本文前期通過植物篩選發(fā)現(xiàn),相較于其他幾種水生植物,金魚藻具有更高效降解 BPA 的能力,在此過程中 POD可能起著關(guān)鍵作用[26].本研究表明,金魚藻 POD比其他來源同類酶具有更優(yōu)越的特性,比如活性很高,溫度和 pH值作用范圍更寬泛等,這些結(jié)果可以為金魚藻對BPA的降解能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他陸生植物和水生植物提供酶學(xué)依據(jù)和理論支持.另外還發(fā)現(xiàn)BPA經(jīng)金魚藻POD降解后代謝產(chǎn)物對斑馬魚也不產(chǎn)生雌激素效應(yīng).

3 結(jié)論

3.1 金魚藻POD具有較廣譜的溫度和pH范圍.在溫度為70℃,pH值為7,H2O2濃度為5mmol/L時POD酶活力最大.

3.2 金魚藻POD對水中BPA有較高的降解效率,且具有較寬的作用范圍.金魚藻POD降解BPA的最佳條件為:活力10U/mL及以上,H2O2濃度1～5mmol/L,溫度 30℃, pH 值 5～7.在此條件下,15min內(nèi)對0.02mmol/L BPA的降解率可達(dá)到99.67%～100%.金魚藻 POD對 BPA的降解動力學(xué)米氏常數(shù) Km為0.09mmol/L,最大反應(yīng)速度為9.71mmol/(L·h).

3.3 經(jīng)金魚藻POD降解后,BPA對斑馬魚的雌激素效應(yīng)得到清除,其降解產(chǎn)物也不再具有內(nèi)分泌干擾作用.