馬治華,牛丕蓮,許惺博,張自萍,周學(xué)章,白明生,*
(1.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,寧夏 銀川 750021;2.哥廷根大學(xué)醫(yī)學(xué)中心,德國(guó) 哥廷根 37075)
心血管疾病是非傳染性疾病中首要威脅人類健康的疾病,對(duì)個(gè)人和社會(huì)造成的負(fù)擔(dān)日益加重,有效防治心血管疾病是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。心肌纖維化是各種心血管疾病發(fā)展至后期的共同病理特征,其主要特征是心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts,CFs)的分化和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrixc,ECM)聚積。研究表明,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)在纖維化和心肌重構(gòu)中起著至關(guān)重要的作用。TGF-β1介導(dǎo)ECM的產(chǎn)生過(guò)程,可誘導(dǎo)CFs分化并促進(jìn)膠原蛋白合成。因此有效抑制心肌纖維化可延緩心血管疾病后續(xù)的發(fā)生發(fā)展,有利于心血管患者的預(yù)后改善,為治療心血管疾病提供新方法。
近年來(lái)大量研究表明,中藥具有多途徑、多靶點(diǎn)的特點(diǎn),對(duì)心肌纖維化的預(yù)防治療有獨(dú)特優(yōu)勢(shì),許多中藥復(fù)方、單味藥及其提取物對(duì)其均有顯著的防治作用。丹參酮IIA可通過(guò)TGF-β1/Smad信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)心肌纖維化;黃連素能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞增殖以及膠原蛋白合成;四逆湯是一種中藥復(fù)方,可干預(yù)腎素-血管緊張素系統(tǒng),從而抑制心肌纖維化。
寧夏枸杞是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食兼用名貴中藥材。枸杞果實(shí)中的活性成分有很多,包括枸杞多糖、黃酮、類胡蘿卜素、酚酸、甜菜堿、維生素等。研究發(fā)現(xiàn),枸杞多糖是枸杞提取物中最主要的功能成分,枸杞多糖具有降血糖、降血壓、抗氧化、抗衰老、提高免疫力等生物學(xué)功能。然而,枸杞多糖對(duì)心肌纖維化影響的研究鮮有報(bào)道,本研究利用TGF-β1體外刺激小鼠CFs,建立心肌纖維化細(xì)胞模型,探究寧夏枸杞多糖對(duì)心肌纖維化的干預(yù)作用,為枸杞多糖在心血管類疾病的臨床治療中提供新的理論依據(jù)。
清潔級(jí)C57BL/6新生小鼠,1~3 日齡,購(gòu)于寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(寧)2020-0001)。
枸杞多糖(純度≥96%) 寧夏沃福百瑞公司。
DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清 美國(guó)Gibco公司;TGF-β1 美國(guó)Peprotech公司;α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗體(鼠來(lái)源)、一抗Vimentin(兔來(lái)源) 賽信通(上海)生物試劑有限公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;TritonX-100 生工生物工程(上海)股份有限公司;E.Z.N.A.Total RNA Kit I 美國(guó)Omega公司;HiScriptII Q RT SuperMix for qPCR、ChamQTM SYBRqPCR Master Mix試劑盒美國(guó)Vazyme公司;膠原蛋白I(collagen I,Col I)、膠原蛋白III(collagen III,Col III)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒北京麗科生物有限公司。
MDF-382E(N)超低溫冰箱 上海申力科技有限公司;Trans-Blot SD Cell酶標(biāo)儀、TC20細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)儀美國(guó)Bio-Rad公司;E5311化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀 美國(guó)GE公司;W211電熱恒溫水浴鍋 北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;Power pac HV電泳儀 北京凱元信瑞儀器有限公司。
1.3.1 C57BL/6小鼠CFs原代分離培養(yǎng)
參考劉夢(mèng)昕等的方法分離培養(yǎng)原代CFs。用乙醚將C57BL/6新生小鼠麻醉后,在無(wú)菌條件下,用無(wú)菌剪刀和鑷子取心尖部位,快速置于含雙抗的磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline,PBS)(0.01 mol/L、pH 7.2~7.6)洗3 遍。剔除結(jié)締組織,將心臟剪碎,加入適量胰酶,在37 ℃培養(yǎng)箱中,分次消化,每次5 min,共消化8~10 次。取上清液,并加入等量含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)的DMEM/F12培養(yǎng)基,混勻。過(guò)濾混合液,1 000 r/min離心5 min,收集沉淀于培養(yǎng)瓶中,在37 ℃、5% CO條件下培養(yǎng)90 min左右后,將未貼壁的細(xì)胞懸液吸出,此時(shí)已貼壁的細(xì)胞即為CFs,加入DMEM/F12培養(yǎng)基,放入培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后更換含10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液,觀察CFs的生長(zhǎng)情況。
1.3.2 CFs鑒定
采用免疫組化染色檢測(cè)纖維細(xì)胞標(biāo)志蛋白Vimentin進(jìn)行CFs鑒定。在無(wú)菌的12 孔板中爬片,待細(xì)胞貼片30 min左右,補(bǔ)加完全培養(yǎng)液,放于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。取出,PBS漂洗,質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液固定20 min后用PBS再次漂洗,體積分?jǐn)?shù)0.5% Triton X-100處理15 min,PBS漂洗,體積分?jǐn)?shù)3% HO處理15 min,PBS漂洗。室溫封閉60 min,取出甩干,一抗4 ℃過(guò)夜孵育,PBS洗3 次,二抗孵育60 min,PBS清洗,辣根過(guò)氧化物酶DAB顯色1~10 min,蒸餾水洗,蘇木素復(fù)染,自來(lái)水洗返藍(lán)。體積分?jǐn)?shù)75%、85%、95%乙醇溶液和無(wú)水乙醇梯度脫水,二甲苯透明2 次,中性樹(shù)膠封片。免疫組化染色為棕黃色,結(jié)果為陽(yáng)性,即為CFs。
1.3.3 細(xì)胞分組處理
取培養(yǎng)的CFs,每孔5×10個(gè)接種到6 孔板,待細(xì)胞貼壁后,實(shí)驗(yàn)分為3 組:對(duì)照組(完全培養(yǎng)基)、模型組(質(zhì)量濃度10 ng/mL TGF-β1)、枸杞多糖組(質(zhì)量濃度10 ng/mL TGF-β1+質(zhì)量濃度100 ng/mL寧夏枸杞多糖)。繼續(xù)培養(yǎng)48 h,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1.3.4 CFs形態(tài)及增殖情況觀察
CFs細(xì)胞分組處理培養(yǎng)4 d后,置于倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)和數(shù)目,并進(jìn)行拍照記錄。
1.3.5 免疫熒光法檢測(cè)α-SMA表達(dá)
待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%左右,以每孔1×10個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板中,分組培養(yǎng)48 h后,質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液固定10 min,取出玻片、固定,然后用100 μL 0.5% TritonX-100通透15 min,體積分?jǐn)?shù)5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)室溫封閉60 min,棄舊液,采用α-SMA一抗((一抗)∶(抗體稀釋液)=1∶500)37 ℃孵育2 h,熒光二抗((二抗)∶(抗體稀釋液)=1∶500)避光孵育1 h,PBS清洗,加入4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色液,倒置熒光顯微鏡下觀察拍照,觀察綠色熒光強(qiáng)度。
1.3.6 膠原蛋白I和膠原蛋白III表達(dá)水平檢測(cè)
CFs分組培養(yǎng)48 h后,收集上清液,3 000 r/min離心20 min,收集上清液。按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求采用ELISA法檢測(cè)Col I、Col III表達(dá)量。
1.3.7 Western blot測(cè)定TGF-β1/Smads信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)及磷酸化水平
采用細(xì)胞裂解液進(jìn)行總蛋白提取并用BCA法對(duì)蛋白濃度定量,調(diào)整所有蛋白質(zhì)量濃度為3 μg/μL,沸水煮10 min至變性。進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,然后將其轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h,之后分別放于一抗actin、Smad2/3、p-Smad2、p-Smad3、Smad4(抗體稀釋比例為(一抗)∶(抗體稀釋液)=1∶1 500),于4 ℃冰箱過(guò)夜孵育過(guò)夜,用1×TBST洗6 次(5 min/次),加入相應(yīng)二抗(抗兔或抗小鼠,(二抗)∶(抗體稀釋液)=1∶10 000)在室溫孵育1 h,1×TBST洗6 次(5 min/次)。用發(fā)光液A、B等體積混合,用ECL化學(xué)發(fā)光液于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀中顯影,最后用Image J軟件對(duì)蛋白條帶相對(duì)灰度值進(jìn)行分析。
1.3.8 纖維化調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子、和的mRNA表達(dá)水平測(cè)定
收集各組細(xì)胞,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,分別將cDNA、、和及基因引物加至實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)Mix反應(yīng)體系中,進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成,引物序列參考Song Shuai和戚曉琳等方法,序列如下::F:5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’,R:5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’;引物序列:F:5’-GGGCTCTGAAGATGCACAT,R:5’-TGGCTTCTCACCAGTGTGGG-3’;引物序列:F:5’-CGCCTCCAAGAAGCCCAA-3’,R:5’-CTGGGTAAAGGAGAGTGGAGTGG-3’;引物序列:F:5’-TGATAGAAGTCTGAACACTCGTTTG-3’,R:5’-GGCTGATTGGCAAGACCTCT-3’;引物序列:F:5’-CCTCAGGGTATTGCTGGACAAC-3’,R:5’-CAGAAGGACCTTGTTTGCCAGG-3’。
采用GraphPad Prism5軟件用單因素方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并作圖,以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
波形蛋白Vimentin為纖維細(xì)胞標(biāo)志蛋白,為鑒定分離所得細(xì)胞是否為小鼠CFs,采用免疫組化檢測(cè)Vimentin。如圖1所示,分離所得細(xì)胞的免疫組化染色為棕黃色,結(jié)果為陽(yáng)性,符合CFs特征,表明分離所得細(xì)胞為小鼠CFs,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
圖1 小鼠原代CFs免疫組化鑒定結(jié)果Fig. 1 Results of immunohistochemical identification of mouse primary CFs
如圖2所示,TGF-β1誘導(dǎo)后,CFs由梭形、不規(guī)則多邊形變得細(xì)長(zhǎng)、狹長(zhǎng),枸杞多糖干預(yù)后,細(xì)胞形態(tài)有所恢復(fù),表明枸杞多糖可使TGF-β1誘導(dǎo)的CFs形態(tài)變化有所改變。
圖2 形態(tài)學(xué)觀察枸杞多糖對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)CFs的影響Fig. 2 Microscopic observation of the effect of Lycium barbarum polysaccharide on TGF-β1-induced CFs
如圖3所示,與對(duì)照組比較,TGF-β1誘導(dǎo)后,細(xì)胞中α-SMA綠色熒光表達(dá)明顯增強(qiáng),而枸杞多糖組相較于模型組,α-SMA綠色熒光表達(dá)明顯減弱。Western blot檢測(cè)結(jié)果與免疫熒光檢測(cè)結(jié)果一致。如圖4所示,與對(duì)照組比較,TGF-β1誘導(dǎo)后,細(xì)胞中α-SMA表達(dá)水平高度顯著上調(diào)(<0.001),枸杞多糖干預(yù)后,α-SMA蛋白表達(dá)水平較模型組高度顯著下調(diào)(<0.001)。結(jié)果表明在蛋白水平,枸杞多糖對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA表達(dá)有抑制作用。
圖3 免疫熒光檢測(cè)枸杞多糖對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的CFs中α-SMA表達(dá)的影響(400×)Fig. 3 Immunofluorescence detection of the effect of Lycium barbarum polysaccharide on the expression of α-SMA in CFs induced by TGF-β1 (400 ×)
圖4 枸杞多糖對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的CFs α-SMA表達(dá)的影響Fig. 4 Effect of Lycium barbarum polysaccharide on the expression of α-SMA in CFs treated with TGF-β1
如圖5顯示,與對(duì)照組相比,TGF-β1誘導(dǎo)后,細(xì)胞培養(yǎng)液上清中Col I、Col III蛋白質(zhì)量濃度高度顯著增加(<0.001),枸杞多糖干預(yù)后,Col I、Col III蛋白質(zhì)量濃度均較模型組高度顯著減少(<0.001),表明枸杞多糖可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的Col I和Col III蛋白表達(dá)增加。
圖5 枸杞多糖對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的CFs Col I、Col III蛋白表達(dá)的影響Fig. 5 Effect of Lycium barbarum polysaccharide on the expression of Col I and Col III in CFs treated with TGF-β1
如圖6所示,與對(duì)照組比較,模型組中Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad4蛋白相對(duì)表達(dá)量均高度顯著上調(diào)(<0.001),枸杞多糖組相較模型組,相關(guān)蛋白表達(dá)均呈高度顯著下調(diào)(<0.001)。上述結(jié)果表明,TGF-β1成功激活TGF-β1/Smads信號(hào)通路,枸杞多糖可通過(guò)抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路的激活進(jìn)而改善心肌纖維化。
圖6 枸杞多糖對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的CFs TGF-β1/Smads信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)及磷酸化的影響Fig. 6 Effect of Lycium barbarum polysaccharide on the expression of TGF-β1/Smads signaling pathway-related proteins in CFs treated with TGF-β1
如圖7所示,與對(duì)照組比較,模型組中/、和的mRNA相對(duì)表達(dá)量高度顯著增高(<0.001);與模型組比較,枸杞多糖組的/、和的mRNA相對(duì)表達(dá)量高度顯著下降(<0.001)。表明枸杞多糖可改善心肌纖維化,與下調(diào)纖維化轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子/、和表達(dá)有關(guān)。
圖7 枸杞多糖對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的CFs中Twist、S100A4、Snail 1/2 mRNA表達(dá)的影響Fig. 7 Effect of Lycium barbarum polysaccharide on the mRNA expression of Twist, S100A4, Snail 1/2 in CFs treated with TGF-β1
心臟組織受損時(shí),機(jī)體啟動(dòng)修復(fù)調(diào)節(jié)機(jī)制——心室重塑。心室重塑過(guò)程中形成的瘢痕可替代死亡的心肌細(xì)胞,從而起到修復(fù)受損心臟的作用,但當(dāng)心臟持續(xù)發(fā)生心室重塑就會(huì)造成心肌纖維化。心肌纖維化發(fā)生時(shí),CFs被活化,活化的CFs過(guò)度分泌ECM,ECM主要包括膠原蛋白和α-SMA等。研究表明,心肌纖維化是一個(gè)很復(fù)雜的病理過(guò)程,與許多因素相關(guān)。TGF-β1作為重要的促心肌纖維化生物因子之一,可以活化CFs。
寧夏枸杞的干燥成熟果實(shí)為藥材枸杞子,其味甘、性平,歸肝、腎經(jīng),有滋肝補(bǔ)腎、益精明目之功效,為茄科枸杞屬的一種多分枝小灌木。《中華人民共和國(guó)藥典》記載,寧夏枸杞成熟果實(shí)具有滋補(bǔ)肝腎、益精明目的功效,可用于治療虛勞精虧、眩暈耳鳴、陽(yáng)萎遺精、內(nèi)熱消渴、目昏不明等病癥。枸杞子中具有多種活性成分,如枸杞多糖、黃酮類化合物、生物堿、氨基酸等。研究表明,枸杞子中最具有提取利用價(jià)值的是枸杞多糖。本實(shí)驗(yàn)中,TGF-β1刺激CFs后,細(xì)胞形態(tài)顯著變化,細(xì)胞數(shù)目增多且α-SMA的熒光表達(dá)顯著增強(qiáng),Col I、Col III和α-SMA蛋白的表達(dá)上調(diào);但加入寧夏枸杞多糖處理細(xì)胞后,對(duì)上述實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象起到抑制作用,表明寧夏枸杞多糖可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的CFs活化。TGF-β1也可誘導(dǎo)特異性轉(zhuǎn)錄因子如、和的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)纖維化的發(fā)生。研究表明,轉(zhuǎn)錄因子、和在纖維化發(fā)生中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,用TGF-β1刺激后,、和的mRNA表達(dá)增加;給予寧夏枸杞多糖處理細(xì)胞后,、和的mRNA表達(dá)呈下降趨勢(shì)。這表明寧夏枸杞多糖可有效抑制纖維化轉(zhuǎn)錄因子、和的mRNA表達(dá)。
TGF-β1是TGF-β1/Smads信號(hào)通路中關(guān)鍵因子。TGF-β1與其受體特異性結(jié)合,進(jìn)而激活下游的Smads蛋白家族,發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng),調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)。Smads蛋白家族與TGF-β1相互協(xié)調(diào)作用促使心肌纖維化。為進(jìn)一步探究枸杞多糖如何改善心肌纖維化的發(fā)生,對(duì)TGF-β1/Smads信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)TGF-β1可成功激活TGF-β1/Smads信號(hào)通路,使Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3和Smad4蛋白表達(dá)增多,枸杞多糖干預(yù)后,Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3和Smad4蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)下調(diào),表明枸杞多糖可能通過(guò)抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路的激活,進(jìn)而減緩心肌纖維化的發(fā)生,改善心肌纖維化程度。
綜上所述,寧夏枸杞多糖可有效抑制TGF-β1刺激的CFs活化,降低纖維化轉(zhuǎn)錄因子、、的mRNA表達(dá),從而促使心肌纖維化Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3和Smad4蛋白表達(dá)下調(diào)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明枸杞多糖可通過(guò)抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路的激活,發(fā)揮改善心肌纖維化的作用。