伍露露，王曉旭，羅京義，李藝洋，王志高，徐 杰，薛長湖

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

炎癥反應(yīng)是人類免疫系統(tǒng)的重要生理反應(yīng)過程，可保護(hù)身體免受刺激并恢復(fù)受損的組織結(jié)構(gòu)和功能。然而，過度和不受控制的炎癥反應(yīng)會誘發(fā)各種慢性病和機(jī)體紊亂，包括糖尿病、癌癥、心血管疾病、關(guān)節(jié)炎、自身免疫性疾病和炎癥性腸病等。近年來，炎癥是生物醫(yī)學(xué)研究人員關(guān)注的主要研究領(lǐng)域之一。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性菌細(xì)胞壁中特有的成分，適量的LPS能夠激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，濃度過高則會引起強(qiáng)烈的炎性反應(yīng)，促使炎性因子大量分泌，使其成為多種炎癥模型構(gòu)建的首選誘導(dǎo)劑。蝦青素（3,3’-二羥基-,’胡蘿卜素-4,4’-二酮基）是類胡蘿卜素中唯一一種能夠穿透血-腦屏障和血-視網(wǎng)膜屏障的活性物質(zhì)。研究表明，蝦青素具有抗炎、抗癌、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力和降低氧化損傷等生理功能。自然界中的蝦青素以游離態(tài)、單酯或雙酯的混合形式存在。二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）是-3多不飽和脂肪酸，對胎兒大腦及視力的發(fā)育和成人神經(jīng)系統(tǒng)的正常運(yùn)作十分重要。游離DHA可以通過結(jié)合并激活質(zhì)膜受體和胞質(zhì)受體來調(diào)節(jié)炎癥。本課題組前期采用體外和體內(nèi)消化模型研究了14 種不同分子結(jié)構(gòu)蝦青素酯的穩(wěn)定性和生物利用度，結(jié)果表明具有長鏈和飽和脂肪酸的蝦青素酯比其他類型的蝦青素酯更穩(wěn)定，蝦青素單酯的生物利用度高于游離蝦青素（free astaxanthin，F(xiàn)-Asta），蝦青素DHA單酯（astaxanthin DHA monomer，AST-DHA）在14 種蝦青素酯中具有最高的生物利用度，這種新型活性物質(zhì)可能在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮蝦青素和DHA的協(xié)同作用。

小膠質(zhì)細(xì)胞（BV2細(xì)胞）被證明是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫細(xì)胞，響應(yīng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，特別是神經(jīng)炎癥相關(guān)疾病的病理刺激。近年來，斑馬魚疾病模型廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個領(lǐng)域，如免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、神經(jīng)科學(xué)等。斑馬魚因其生命周期短、繁殖率高、易于飼養(yǎng)，且胚胎的光學(xué)透明性可以對體內(nèi)炎癥進(jìn)行無創(chuàng)動態(tài)成像，被公認(rèn)是有效的體內(nèi)抗炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀１緦?shí)驗(yàn)主要利用以上兩種模型探究AST-DHA抗炎活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BV2細(xì)胞 中國科學(xué)院上海生化與細(xì)胞研究所；合成蝦青素（純度10%） 浙江巴仕曼生物科技有限公司；DHA（純度80%） 中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與人類健康實(shí)驗(yàn)室制備；野生型斑馬魚（AB品系）國家斑馬魚資源中心；LPS、2’,7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichloro-dihydrofluorescein diacetate，DCFHDA）、3-乙氧?；桨芳谆撬猁}（ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate，MS222） 上海阿拉丁生化科技公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；總RNA提取試劑盒 美國Bio Tek公司；EvaGreen qPCR Master Mix試劑盒 加拿大ABM公司；胎牛血清-培養(yǎng)基 美國Gibco公司；Griess試劑 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

斑馬魚養(yǎng)殖設(shè)備 上海海圣生物實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HF90/HF240 CO培養(yǎng)箱 上海力新儀器有限公司；LRH-70恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海一恒儀器有限公司；PZMIII體視顯微鏡、PV830斑馬魚顯微注射系統(tǒng) 美國WPI公司；Ti2-E熒光顯微鏡 日本Nikon公司；iCycler iQ5系統(tǒng)實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增儀、680型酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司；超微量分光光度計(jì) 美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 F-Asta和AST-DHA的制備

參考楊魯?shù)确椒ǎ訢HA與蝦青素作為反應(yīng)底物合成AST-DHA，具體反應(yīng)條件為蝦青素250 mg、DHA 282 mg、無水丙酮5 mL、4-二甲氨基吡啶100 mg、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽100 mg，充氮后避光并進(jìn)行磁力攪拌，在25 ℃反應(yīng)3 h。合成的產(chǎn)物通過硅膠柱純化后，用C色譜柱進(jìn)行梯度洗脫，流動相為甲醇和甲基叔丁基醚，采用高效液相色譜-質(zhì)譜法對純化后樣品進(jìn)行分析，鑒定得到純化后F-Asta純度為（96.2±0.5）%，AST-DHA純度為（94.0±0.6）%。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)觀察

BV2細(xì)胞培養(yǎng)于含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%青霉素及鏈霉素的10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）胎牛血清-培養(yǎng)基中。細(xì)胞在37 ℃、5% CO下無菌培養(yǎng)。細(xì)胞以1∶4隔天傳代，以1×10個/mL孔接種于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種0.5 mL，待細(xì)胞貼壁后，加入含質(zhì)量濃度0、100、200、400 μg/mL LPS的2%胎牛血清-培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h和48 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.3.3 四甲基偶氮唑藍(lán)法檢測細(xì)胞存活率

BV2細(xì)胞以5×10個/mL接種于96 孔板中，每孔接種100 μL。待細(xì)胞貼壁后，加入含質(zhì)量濃度0、100、200、400 μg/mL LPS的2%胎牛血清-培養(yǎng)基。持續(xù)孵育24 h或48 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加200 μL 3-(4,5-二甲基噻唑)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2--tetrazolium bromide，MTT）溶液（用質(zhì)量濃度0.5 mg/mL、pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液配制），繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，吸取并丟棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加100 μL酸化異丙醇（HCl濃度為1 mol/L，（鹽酸）∶（異丙醇）＝1∶8），振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在570 nm波長處測定吸光度。細(xì)胞存活率計(jì)算如公式（1）所示。

1.3.4 Griess法檢測細(xì)胞內(nèi)NO產(chǎn)生量

采用Griess方法，取1.3.3節(jié)加入不同質(zhì)量濃度LPS孵育24 h或48 h的細(xì)胞培養(yǎng)基上清液與Griess試劑等體積混合，反應(yīng)5 min后，于550 nm波長處測定吸光度。以NaNO濃度為橫軸、吸光度為縱軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)NaNO標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算培養(yǎng)基上清液中NO產(chǎn)生量。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為＝0.072+0.048（＝0.997），線性關(guān)系良好，以NaNO濃度表征NO產(chǎn)生量。

1.3.5 LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞模型及實(shí)驗(yàn)分組

炎癥細(xì)胞模型蝦青素干預(yù)實(shí)驗(yàn)分成4 組：空白對照組、模型組、F-Asta組和AST-DHA組。用質(zhì)量濃度400 μg/mL LPS處理BV2細(xì)胞48 h構(gòu)建炎癥細(xì)胞模型；模型組、F-Asta組和AST-DHA組均用LPS處理，同時F-Asta組和AST-DHA組分別添加終質(zhì)量濃度200 ng/mL的F-Asta和AST-DHA。

1.3.6 斑馬魚胚胎的獲得及實(shí)驗(yàn)分組

斑馬魚成魚養(yǎng)殖于循環(huán)水系統(tǒng)中，溫度控制在（28±1）℃，pH值控制在7.0±0.5，每天明/暗時間為14 h/10 h。

選擇成年斑馬魚，雌魚與雄魚數(shù)量按照1∶1的比例置于配魚盒內(nèi)，中間放置隔板，次日清晨抽去隔板，30 min后將魚卵收集于培養(yǎng)皿中，加入胚胎培養(yǎng)液，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.7 LPS誘導(dǎo)的斑馬魚炎癥及實(shí)驗(yàn)分組

炎癥造模：將LPS粉末用斑馬魚胚胎培養(yǎng)液配制成質(zhì)量濃度1 mg/mL的母液備用，實(shí)驗(yàn)時將母液用培養(yǎng)液稀釋為質(zhì)量濃度10、15、20 μg/mL的工作液。在斑馬魚胚胎發(fā)育至2 d（day post fertilization，dpf）自然破膜后，挑選發(fā)育正常的斑馬魚胚胎移入6 孔板中，每孔30 條，每個質(zhì)量濃度組設(shè)3 個重復(fù)孔。模型組中預(yù)先加入5 mL不同質(zhì)量濃度LPS溶液，空白對照組加入5 mL培養(yǎng)液。將給藥后的6 孔板放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，待其發(fā)育至3 dpf檢測胚胎體內(nèi)ROS水平。

蝦青素干預(yù)實(shí)驗(yàn)分組：分成4 組，空白對照組、模型組、F-Asta組和AST-DHA組。空白對照組在24 孔板中加入2 mL胚胎培養(yǎng)液；模型組、F-Asta組和AST-DHA組加入2 mL質(zhì)量濃度15 μg/mL的LPS溶液。每組設(shè)置3 個重復(fù)孔，每孔30 條胚胎（2 dpf）。將給藥后的胚胎放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

F-Asta和AST-DHA通過顯微注射的方式注射入受精后2 h（hour post fertilization，hpf）斑馬魚胚胎中，分別吸取10 μL質(zhì)量濃度200 ng/mL的F-Asta和AST-DHA溶液于玻璃注射針中，注射液滴大小為2 nL。將2 hpf左右的斑馬魚胚胎排列擺放至瓊脂板上，在體視顯微鏡下進(jìn)行注射。每個實(shí)驗(yàn)組需注射約200 個胚胎。待胚胎發(fā)育至2 dpf，挑選健康的胚胎進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.8 體視顯微鏡觀察胚胎發(fā)育情況

在各組胚胎發(fā)育至72 hpf時，體視顯微鏡下觀察胚胎畸形情況，按式（2）計(jì)算畸形率。

1.3.9 免疫熒光分析ROS水平

將3 dpf斑馬魚胚胎轉(zhuǎn)移至24 孔板中，每孔5 條胚胎，用2 mL熒光探針染料DCFH-DA溶液（質(zhì)量濃度5 μg/mL）處理，在28.5 ℃避光孵育1 h。將胚胎用胚胎培養(yǎng)液沖洗3 次，并在觀察前用體積分?jǐn)?shù)0.016% MS222將斑馬魚胚胎麻醉。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，使用Image J圖像處理軟件分析熒光成像圖片并計(jì)算平均熒光強(qiáng)度，ROS水平以平均熒光強(qiáng)度表示。

1.3.10 MDA含量測定

待胚胎發(fā)育至4 dpf時，從每組中取10 個斑馬魚胚胎，用磷酸鹽緩沖溶液洗滌3 次，按照試劑盒說明書要求測定胚胎MDA含量，結(jié)果以蛋白計(jì)，重復(fù)3 個平行。

1.3.11 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測定促炎因子的表達(dá)

按照試劑盒說明書提取BV2細(xì)胞和斑馬魚的總RNA，用超微量分光光度計(jì)測定不同實(shí)驗(yàn)組RNA濃度；參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟反轉(zhuǎn)錄為cDNA；以cDNA為模板，加入相關(guān)引物進(jìn)行實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR），擴(kuò)增各目的基因。擴(kuò)增結(jié)束后，分別以和為內(nèi)參基因，用2相對定量法計(jì)算各基因的相對表達(dá)量。引物序列如表1所示。

表1 qPCR的基因引物Table 1 Gene-specific primers for qPCR

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用GraphPad Prism 8.0軟件作圖并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組數(shù)據(jù)之間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析采用單因素方差分析，＜0.05被認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 AST-DHA對BV2細(xì)胞炎癥的作用

2.1.1 LPS對細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞存活率及NO產(chǎn)生量的影響

用質(zhì)量濃度0、100、200、400 μg/mL的LPS處理BV2細(xì)胞24 h和48 h，觀察BV2細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞活力及NO產(chǎn)生量的變化，由此確定構(gòu)建BV2細(xì)胞炎癥模型的LPS質(zhì)量濃度。由圖1A可知，加入不同質(zhì)量濃度LPS培養(yǎng)48 h，空白對照組和質(zhì)量濃度100 μg/mL LPS組細(xì)胞形態(tài)正常，多為小的圓形或具有長的突觸。而LPS質(zhì)量濃度達(dá)到200 μg/mL時，細(xì)胞胞體明顯變大，突觸變短。LPS質(zhì)量濃度400 μg/mL時細(xì)胞狀態(tài)改變更加明顯。由圖1B可知，100 μg/mL以上LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞48 h可以極顯著降低細(xì)胞存活率（＜0.01），與空白對照組相比，細(xì)胞存活率下降了約50%。而各質(zhì)量濃度LPS誘導(dǎo)24 h后細(xì)胞存活率均與空白對照組無顯著差異（＞0.05）。NO是炎癥進(jìn)程中的重要信使，與免疫調(diào)節(jié)作用密切相關(guān)。由圖1C可知，在質(zhì)量濃度100、200、400 μg/mL LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞48 h，其NO產(chǎn)生量與空白對照組相比極顯著升高（＜0.01）。質(zhì)量濃度100 μg/mL和200 μg/mL LPS處理24 h時，細(xì)胞NO產(chǎn)生量與空白對照組相比變化不顯著（＞0.05）。綜合上述結(jié)果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)用質(zhì)量濃度400 μg/mL LPS處理BV2細(xì)胞48 h構(gòu)建炎癥細(xì)胞模型。

圖1 LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞炎癥模型的建立Fig. 1 Establishment of BV2 cell model of LPS-induced inflammation

2.1.2 AST-DHA對BV2細(xì)胞炎癥因子表達(dá)水平的影響

細(xì)胞中促炎因子表達(dá)水平的上升會加速細(xì)胞炎癥的進(jìn)展。常見的促炎因子有TNF-α和IL-1β。由圖2可知，模型組中和表達(dá)水平均高度顯著高于空白對照組（＜0.000 1、＜0.001），分別約為對照組的1.5 倍和1.4 倍，而AST-DHA組和mRNA相對表達(dá)量接近于空白對照組，說明AST-DHA顯著降低了LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)水平（＜0.001、＜0.01），F(xiàn)-Asta對細(xì)胞中的表達(dá)作用效果不顯著（＞0.05）。結(jié)果表明，AST-DHA能夠下調(diào)炎癥細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)水平，對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥具有改善作用。

圖2 AST-DHA降低BV2細(xì)胞中炎癥因子mRNA表達(dá)水平Fig. 2 Astaxanthin DHA monoester decreased the mRNA expression of inflammatory factors in BV2 cells

2.2 AST-DHA對LPS誘導(dǎo)的斑馬魚炎癥的保護(hù)作用

2.2.1 LPS誘導(dǎo)斑馬魚炎癥模型的建立

ROS通常是壽命短活性高的小分子，包括氧衍生的自由基，如超氧陰離子自由基和羥自由基等。體內(nèi)高水平的ROS可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致各種細(xì)胞或組織損傷。將斑馬魚胚胎暴露在質(zhì)量濃度0、10、15、20 μg/mL的LPS中，染色后，熒光顯微鏡下檢測ROS水平。圖3結(jié)果顯示，用LPS處理斑馬魚胚胎后，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到15 μg/mL時綠色熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，與空白對照組相比染色效果最明顯，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采取該質(zhì)量濃度LPS處理斑馬魚胚胎建立炎癥模型。

圖3 不同質(zhì)量濃度LPS誘導(dǎo)的炎癥斑馬魚胚胎體內(nèi)ROS熒光圖（4×）Fig. 3 Fluorescence images of ROS in zebrafish embryos with inflammation induced by different concentrations of LPS (4 ×)

2.2.2 AST-DHA對炎癥斑馬魚胚胎發(fā)育畸形的調(diào)節(jié)作用

斑馬魚具有胎身透明的特點(diǎn)，因此其發(fā)育過程在顯微鏡下清晰可見。在體視顯微鏡下觀察到正常發(fā)育至48 hpf的斑馬魚胚胎（圖4A）和經(jīng)LPS誘導(dǎo)各組典型的發(fā)育陰滯胚胎（圖4A）。發(fā)育陰滯的情況有卵黃囊水腫、尾部發(fā)育不全、眼部發(fā)育不全和脊索畸形等。如圖4B所示，模型組畸形率是空白對照組的2 倍多，F(xiàn)-Asta組和AST-DHA組斑馬魚胚胎畸形率與模型組相比高度顯著下降（＜0.001、＜0.000 1），尤其是AST-DHA組，其畸形率接近于空白對照組。以上結(jié)果表明，AST-DHA對炎癥斑馬魚胚胎的發(fā)育具有保護(hù)作用。

圖4 AST-DHA對炎癥斑馬魚胚胎畸形率的影響Fig. 4 Effect of astaxanthin DHA monoester on the rate of embryo malformation in zebrafish with inflammation

2.2.3 AST-DHA對斑馬魚體內(nèi)ROS水平的影響

如圖5A所示，注射AST-DHA的斑馬魚熒光強(qiáng)度明顯低于模型組。進(jìn)一步采用Image J軟件分析熒光成像圖像并計(jì)算平均熒光強(qiáng)度。如圖5B所示，與模型組相比，F(xiàn)-Asta和AST-DHA均能有效抑制炎癥斑馬魚體內(nèi)ROS的產(chǎn)生（＜0.001、＜0.000 1）。AST-DHA組斑馬魚的ROS水平較F-Asta組極顯著降低（＜0.01），其ROS水平接近于空白對照組。以上結(jié)果表明AST-DHA較F-Asta具有更好的降低炎癥斑馬魚體內(nèi)ROS產(chǎn)生量的效果。

圖5 AST-DHA對炎癥斑馬魚胚胎體內(nèi)ROS水平的影響Fig. 5 Effect of astaxanthin DHA monoester on ROS levels in zebrafish embryos with inflammation

2.2.4 AST-DHA對斑馬魚胚胎體內(nèi)MDA含量的影響

體內(nèi)MDA水平常用來反映過氧化程度，反映機(jī)體清除氧自由基的能力。由圖6可知，模型組與空白對照組相比，斑馬魚胚胎體內(nèi)MDA含量高度顯著上升（＜0.000 1），約為對照組的2.5 倍。與模型組相比，AST-DHA和F-Asta均能高度顯著減少炎癥斑馬魚胚胎體內(nèi)MDA含量（＜0.000 1），且AST-DHA組MDA含量的下降較F-Asta組更明顯（＜0.01）。結(jié)果表明，LPS的暴露會導(dǎo)致斑馬魚胚胎體內(nèi)過氧化物MDA含量增加，AST-DHA可以緩解這種應(yīng)激狀態(tài)。

圖6 AST-DHA對炎癥斑馬魚胚胎體內(nèi)MDA含量的影響Fig. 6 Effect of astaxanthin DHA monoester on MDA content in zebrafish embryos with inflammation

2.2.5 AST-DHA對斑馬魚體內(nèi)炎癥因子的調(diào)節(jié)作用

由圖7可知，LPS處理后斑馬魚胚胎體內(nèi)促炎因子和水平較空白對照組極顯著升高（＜0.01）。F-Asta對mRNA表達(dá)水平無顯著作用（＞0.05），但能顯著降低mRNA表達(dá)（＜0.05）；AST-DHA能顯著降低和的表達(dá)水平（＜0.01、＜0.05）。結(jié)果表明，蝦青素對LPS誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎炎癥反應(yīng)有改善作用，并且AST-DHA較F-Asta下調(diào)炎癥因子的效果更好。

圖7 AST-DHA對炎癥斑馬魚胚胎體內(nèi)炎癥因子表達(dá)水平的影響Fig. 7 Effect of astaxanthin DHA monoester on the expression of inflammatory factors in zebrafish embryos with inflammation

3 討 論

蝦青素是一種具有抗氧化特性的類胡蘿卜素，可作為食品補(bǔ)充劑使用，它是一種親脂化合物，生物利用度低，與其他類胡蘿卜素類似。F-Asta和蝦青素酯均具有很強(qiáng)的生物學(xué)活性。Rao等發(fā)現(xiàn)，相比于F-Asta，蝦青素酯的抗癌活性更強(qiáng)，認(rèn)為蝦青素酯在生物體內(nèi)具有更優(yōu)的生物利用度。Kamath等對蝦青素單/雙酯、F-Asta的單線態(tài)氧猝滅能力進(jìn)行了比較，表明相對于其他實(shí)驗(yàn)組蝦青素酯具有更好猝滅能力。本課題組前期考察了脂質(zhì)基質(zhì)效應(yīng)對蝦青素酯生物利用度的影響，發(fā)現(xiàn)長鏈脂肪酸含量的增加有利于蝦青素酯生物利用度的提高，在此基礎(chǔ)上合成了AST-DHA并優(yōu)化了反應(yīng)條件。

斑馬魚具有與人類相似的形態(tài)和生理功能，被廣泛應(yīng)用于藥理學(xué)研究。目前研究表明，斑馬魚的免疫系統(tǒng)與人類有著很高的相似度，幾乎所有的人類免疫系統(tǒng)細(xì)胞在斑馬魚中均存在。本實(shí)驗(yàn)中利用斑馬魚胚胎身體透明的特點(diǎn)，觀察斑馬魚胚胎發(fā)育過程并通過活體染色來監(jiān)測體內(nèi)ROS水平變化。巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞通過產(chǎn)生ROS以破壞入侵的細(xì)菌和病毒顆粒，因此ROS可被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)強(qiáng)度的指標(biāo)。體內(nèi)產(chǎn)生過量的ROS可能導(dǎo)致細(xì)胞和組織損傷。抑制ROS過度產(chǎn)生可以有效陰止炎癥反應(yīng)的進(jìn)展，這種抑制可以被視為潛在的抗炎藥物開發(fā)目標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明LPS可引起斑馬魚的炎癥反應(yīng)并促進(jìn)ROS生成，而F-Asta和AST-DHA可減少斑馬魚體內(nèi)ROS產(chǎn)生量，表現(xiàn)出良好的抗炎活性，AST-DHA降低ROS水平的效果更優(yōu)于F-Asta。

炎癥反應(yīng)是體內(nèi)常見的生物反應(yīng)過程，可促進(jìn)激活巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β等促炎癥因子。TNF-α是體內(nèi)重要的早期炎癥反應(yīng)生物標(biāo)志物，可提高對中性粒細(xì)胞的吞噬作用，促進(jìn)IL-1β等促炎因子的產(chǎn)生，刺激局部炎癥反應(yīng)。過量的TNF-α可誘導(dǎo)生成線粒體ROS，導(dǎo)致分枝桿菌和受感染的巨噬細(xì)胞程序性壞死。IL-1β是一種強(qiáng)效促炎性細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)合成前列腺素，活化免疫細(xì)胞，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖。研究表明，體外和體內(nèi)毒物會增加斑馬魚體內(nèi)TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平。本研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞和斑馬魚模型中AST-DHA組的炎癥應(yīng)激反應(yīng)較模型組顯著降低，效果優(yōu)于F-Asta組。

4 結(jié) 論

本研究利用不同質(zhì)量濃度LPS處理BV2細(xì)胞和斑馬魚，通過對體內(nèi)外模型生化指標(biāo)的檢測、染色結(jié)果的觀察以及qPCR檢測，確定了AST-DHA對LPS誘導(dǎo)的炎癥的保護(hù)作用，且AST-DHA較F-Asta表現(xiàn)出更好的抗炎活性，這可能得益于蝦青素與DHA的協(xié)同作用，為AST-DHA生物活性的研究和相關(guān)功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。