王 平，劉曉云，鄭振成，梁桂巧，賴勝強(qiáng)

（廣州正孚檢測技術(shù)有限公司 廣東正孚法醫(yī)毒物司法鑒定所，廣東 廣州 510663）

近幾年來，隨著國家禁毒部門對污水流行病學(xué)（Wastewater-Based Epidemiology,WBE）應(yīng)用于毒情監(jiān)測的認(rèn)可和推廣，全國掀起了相關(guān)檢測與科研工作的熱潮。WBE最早由環(huán)境科學(xué)家提出，起源于違禁藥品的消費(fèi)調(diào)查。2001年，美國國家環(huán)境保護(hù)局環(huán)境科學(xué)家DAUGHTON首次提出基于市政污水分析的估計(jì)藥物消費(fèi)方法。WBE在調(diào)查成癮性物質(zhì)、毒品等方面具有巨大的優(yōu)勢，且相比傳統(tǒng)流行病學(xué)，該方法具有可提供客觀的、連續(xù)的以及實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)的優(yōu)勢。我國污水毒品流行病學(xué)的研究起步較晚，最早的流行病學(xué)研究起源于國際合作，KHAN等首次報(bào)道了我國北京、廣州、深圳和上海四大主要城市的毒品消費(fèi)情況。隨著WBE的成熟應(yīng)用和推廣，新精神活性物質(zhì)也逐漸得到國內(nèi)外禁毒領(lǐng)域?qū)＜业年P(guān)注，并開始將新精神活性物質(zhì)的監(jiān)控納入各地常規(guī)監(jiān)控范圍。

2021年5月11 日，公安部、國家衛(wèi)生健康委員會(huì)和國家藥品監(jiān)督管理局聯(lián)合發(fā)布《關(guān)于將合成大麻素類物質(zhì)和氟胺酮等18種物質(zhì)列入〈非藥用類麻醉藥品和精神藥品管制品種增補(bǔ)目錄〉的公告》，正式?jīng)Q定整類列管合成大麻素類新精神活性物質(zhì)，并新增列管氟胺酮等18種新精神活性物質(zhì)。自2021年7月1日起，氟胺酮（2-fluoro Deschloroketamine，2-FDCK）正式作為國家管制化學(xué)物品進(jìn)行列管。

氟胺酮的麻醉效果與氯胺酮類似，但在有效劑量和蘇醒時(shí)間上優(yōu)于氯胺酮。根據(jù)現(xiàn)有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，氟胺酮的半數(shù)致死量LD50與氯胺酮相當(dāng)，但其半數(shù)抑制濃度IC50明顯高于氯胺酮，即氟胺酮在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)層面上的毒性小于氯胺酮，但仍不能忽略氟胺酮的不良反應(yīng)：幻覺、意識(shí)喪失、抽搐、運(yùn)動(dòng)抑制、高血壓、心動(dòng)過速，部分會(huì)出現(xiàn)呼吸抑制、惡心嘔吐、肝腎功能紊亂等。

本輪列管的氟胺酮為2位氟取代的氟胺酮（2-FDCK），列管通知發(fā)布后，很多互聯(lián)網(wǎng)化工交易平臺(tái)隨即出現(xiàn)了3位氟取代的氟胺酮（3-fluoro Deschloroketamine，3F-DCK）和4位氟取代的氟胺酮（4-fluoro Deschloroketamine，4F-DCK），2-FDCK、3F-DCK與4F-DCK的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。由于氟元素取代的位置均在氟胺酮的苯環(huán)上，因此3F-DCK、4F-DCK在色譜保留和質(zhì)譜特征上與已列管的2-FDCK相似，容易在污水毒品檢測的各類實(shí)踐中產(chǎn)生誤判。本文建立了污水中氟胺酮及2種位置異構(gòu)體的分析方法，以期為毒品、毒物檢測工作者更好地理解和區(qū)分氟胺酮及2種位置異構(gòu)體提供理論依據(jù)。

圖1 氟胺酮及2種位置異構(gòu)體的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LCMS-8045型超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）；SPE Ware CEREX48TM固相萃取氮吹儀（瑞士帝肯公司）；Sorvall ST16R型高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技公司）；Milli-Q型超純水機(jī)（德國默克公司）；CNW Poly-Sery MCX型固相萃取柱（60mg/3mL，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；1.2 μm玻璃纖維濾膜（上海興亞凈化材料廠）；CNW柱管（60 mL）及柱管連接件轉(zhuǎn)換接頭（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

2-FDCK（純度為98%）、3F-DCK（純度為98%）、4FDCK（純度為98%）均購自美國Cayman Chemical公司；內(nèi)標(biāo)物氟胺酮-D（Ketamine-D，美國Cerilliant公司）；甲醇、乙腈、乙酸乙酯均為色譜純（德國默克公司），其余試劑均為市售分析純；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q型超純水機(jī)制備的超純水。

實(shí)驗(yàn)中的空白污水樣品均采集自廣州市黃埔區(qū)市政污水的瞬時(shí)樣，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測均不含氟胺酮及2種位置異構(gòu)體。其他測試樣品均通過水質(zhì)采樣器采集12個(gè)瞬時(shí)樣品（每2 h采集1次）等體積混合于預(yù)置有鹽酸的采樣瓶中，采集過程中保持在-20℃下進(jìn)行，單樣采樣體積為600 mL。

氟胺酮及2種位置異構(gòu)體的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：1 mg/mL，分別準(zhǔn)確稱取氟胺酮及2種位置異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)5 mg，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，用甲醇定容，使用時(shí)用甲醇稀釋至所需質(zhì)量濃度。

氟胺酮及2種位置異構(gòu)體的工作溶液系列：用甲醇將氟胺酮及2種位置異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液逐級稀釋配制為10、100 μg/L的工作溶液系列。由于氟胺酮位置異構(gòu)體的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均為鹽酸鹽，因此以上溶液的質(zhì)量濃度均為其鹽酸鹽的質(zhì)量濃度。

氯胺酮-D（KET-D）內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液：100μg/mL，氟胺酮的市售同位素內(nèi)標(biāo)較難獲取，實(shí)驗(yàn)將氯胺酮的同位素內(nèi)標(biāo)氯胺酮-D（KET-D）作為氟胺酮及2種位置異構(gòu)體的通用內(nèi)標(biāo)，使用時(shí)用甲醇稀釋至所需質(zhì)量濃度。

KET-D內(nèi)標(biāo)工作溶液：100 μg/L。

1.2 方法

1.2.1 儀器工作條件

色譜條件 日本島津GL Sciences Intersil HILIC（3.0 mm×150 mm，3 μm）色譜柱；柱溫為30℃；流動(dòng)相A為10 mmol/L乙酸銨，流動(dòng)相B為乙腈；流量為0.28mL/min；進(jìn)樣量為1μL；采用體積比為98∶2的乙腈-10 mmol/L乙酸銨等度洗脫。

質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源（Electron Spray Ionization,ESI）；檢測方式為電噴霧離子源正離子模式（ESI）；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測模式（Multiple Reaction Monitoring,MRM）；接口電壓為4.5 kV；霧化氣（氮?dú)猓┝髁繛?.0 L/min，干燥氣（氮?dú)猓┝髁繛?0.0 L/min，加熱氣（氮?dú)猓┝髁繛?0.0 L/min；接口溫度為300℃，脫溶劑管溫度為250℃，加熱模塊溫度為400℃；碰撞氣為氬氣（230 kPa）。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 氟胺酮及2種位置異構(gòu)體和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)譜參數(shù)

1.2.2 樣品處理過程

用鹽酸溶液調(diào)節(jié)污水樣品的pH值約為2，在高速冷凍離心機(jī)中以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液經(jīng)玻璃纖維濾膜過濾去除固體顆粒物，取50 mL過濾后的水樣，分別加入質(zhì)量濃度為100 μg/L的工 作內(nèi)標(biāo)溶液30 μL，充分搖勻后待固相萃取富集凈化。使用CNW Poly-Sery MCX固相萃取柱進(jìn)行富集凈化，固相萃取柱經(jīng)過4 mL甲醇、4 mL pH為6.0的磷酸緩沖鹽（PBS）緩沖液活化。加入水樣，為保證固相萃取柱的填料與水樣中目標(biāo)物的充分吸附，上樣過程不加壓。上樣完成后，依次加入2 mL去離子水、2 mL 0.1mol/L鹽酸溶液，41.4 kPa氮?dú)庹龎捍蹈? min；加入2 mL甲醇和2 mL乙酸乙酯，206.9 kPa氮?dú)庹龎捍蹈? min，完成雜質(zhì)的清洗工作；再加入4 mL體積比為78∶20∶2的二氯甲烷-甲醇-氨水混合溶液，以洗脫目標(biāo)物成分。洗脫液經(jīng)氮吹儀正壓40℃吹干，加入100 μL體積比為1∶1的含0.05%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲酸的5 mmol/L乙酸銨-甲醇混合溶液復(fù)溶殘留物，經(jīng)過0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾，取上清液待上機(jī)分析。

1.3 方法學(xué)驗(yàn)證

1.3.1 工作曲線、檢出限與定量限

城市污水中常見的毒品類型甲基苯丙胺的濫用質(zhì)量濃度可達(dá)100 ng/L以上，針對新型氟胺酮類毒品，因其濫用的群體覆蓋區(qū)域和人員遠(yuǎn)不及傳統(tǒng)毒品甲基苯丙胺，大型城市的污水處理廠、泵站等污水典型采樣位點(diǎn)的質(zhì)量濃度通常低于50 ng/L。

準(zhǔn)確量取50 mL空白污水樣品，加入質(zhì)量濃度分別為10、100 μg/L的氟胺酮及2種位置異構(gòu)體混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，并用甲醇逐級稀釋為質(zhì)量濃度分別是1、3、5、8、10、30、50、80 ng/L的工作溶液系列，各添加樣品中加入質(zhì)量濃度為100 μg/L的內(nèi)標(biāo)氯胺酮-D溶液30 μL，按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測定。以氟胺酮及2種位置異構(gòu)體的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以氟胺酮及2種位置異構(gòu)體峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值為縱坐標(biāo)，以不強(qiáng)制過零點(diǎn)、不對曲線進(jìn)行加權(quán)的方式繪制工作曲線。

1.3.2 準(zhǔn)確度與精密度

使用空白污水基質(zhì)配制低、中、高（3、50、80 ng/L）3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品各6份，按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測定，每個(gè)質(zhì)量濃度的樣品連續(xù)測定5 d，求得各目標(biāo)物準(zhǔn)確度與精密度的平均值。

1.3.3 回收率與基質(zhì)效應(yīng)

取適量氟胺酮及2種位置異構(gòu)體的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白污水基質(zhì)中，配制成質(zhì)量濃度分別為3、50、80 ng/L的添加樣品，按照樣品處理過程對空白污水和添加樣品進(jìn)行處理，計(jì)算氟胺酮及2種位置異構(gòu)體的回收率。

在日常污水檢測過程中，經(jīng)常利用不同類型的水源來制備添加樣本，而不同來源、性狀的水對監(jiān)控目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)存在一定的差異。實(shí)驗(yàn)對已知空白污水、廣州市自來水、屈臣氏純化水這3種常見基質(zhì)水的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行考察。按照實(shí)驗(yàn)方法對3種空白基質(zhì)水進(jìn)行固相萃取，萃取洗脫液吹干后加入100 μL質(zhì)量濃度分別為1.5、25、40 μg/L的氟胺酮及2種位置異構(gòu)體混合工作溶液（相當(dāng)于3、50、80 ng/L的添加質(zhì)量濃度），計(jì)算各物質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 氟胺酮位置異構(gòu)體的定性判定

在質(zhì)譜離子對豐度比上，氟胺酮及2種位置異構(gòu)體的特征離子對一致，3種物質(zhì)的定量離子對均為222.1/109.2，另外兩對離子對222.1/163.2、222.1/191.2的相對離子對豐度比存在一定的差異，對位氟取代4F-DCK的離子對222.1/191.1相對豐度比最高，其次為間位氟取代3F-DCK，最后為鄰位氟取代2-FDCK，而222.2/163.1離子對的相對豐度比相對差異較小。

2.2 方法優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

氟胺酮及2種位置異構(gòu)體因其結(jié)構(gòu)的相似性，色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜特征離子對的差異較小。實(shí)驗(yàn)比較了親水作用HILIC色譜柱、五氟苯基和聯(lián)苯基鍵合填料的色譜柱對氟胺酮及2種位置異構(gòu)體分離效果的影響。結(jié)果表明：五氟苯基和聯(lián)苯基鍵合填料的色譜柱在色譜保留上不能有效分離氟胺酮及2種位置異構(gòu)體，無法達(dá)到基線分離，并且即使調(diào)整有機(jī)相比例、水相組成也不能明顯改善氟胺酮及2種位置異構(gòu)體的分離度；通過采用親水作用的HILIC色譜柱并調(diào)整流動(dòng)相比例，可將氟胺酮及2種位置異構(gòu)體進(jìn)行有效分離。因此，實(shí)驗(yàn)選擇的色譜柱為親水作用的HILIC色譜柱。

多反應(yīng)監(jiān)測模式下質(zhì)量濃度為10 ng/L的氟胺酮及2種位置異構(gòu)體的色譜圖如圖2所示。

圖2 氟胺酮及2種位置異構(gòu)體的色譜圖（質(zhì)量濃度為10 ng/L）

2.2.2 流動(dòng)相及其流量的選擇

實(shí)驗(yàn)選擇的親水作用HILIC色譜柱通常將乙腈作為流動(dòng)相中的有機(jī)相。結(jié)果表明：為有效分離氟胺酮及2種位置異構(gòu)體，實(shí)驗(yàn)將有機(jī)相乙腈的比例從80%遞增至100%時(shí)，發(fā)現(xiàn)可顯著改善氟胺酮及2種位置異構(gòu)體的分離度；當(dāng)有機(jī)相乙腈的比例低于90%時(shí)，2-FDCK和3F-DCK的多反應(yīng)監(jiān)測模式色譜圖存在部分重合；當(dāng)有機(jī)相乙腈的比例高于98%時(shí)，3F-DCK的多反應(yīng)監(jiān)測模式色譜圖的峰形發(fā)生明顯分裂。因此，實(shí)驗(yàn)選擇流動(dòng)相中的有機(jī)相為98%（體積分?jǐn)?shù)，下同）的乙腈。

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了流動(dòng)相的流量分別為0.1、0.2、0.25、0.3 mL/min時(shí)對氟胺酮及2種位置異構(gòu)體色譜峰形與分離度的影響。結(jié)果表明：當(dāng)流量高于0.3 mL/min時(shí)，2-FDCK和3F-DCK的色 譜 分 離度較低，無法達(dá)到基線分離；當(dāng)流量低于0.2 mL/min時(shí)，4F-DCK的色譜峰形過寬。綜合考慮，實(shí)驗(yàn)選擇流動(dòng)相的流量為0.28 mL/min。

2.2.3 洗脫劑種類的選擇

實(shí)驗(yàn)比較了氨化的甲醇[含2%（體積分?jǐn)?shù)，下同）氨水的甲醇]和體積比為78∶20∶2的二氯甲烷-甲醇-氨水混合溶液的洗脫效果以及在氮吹吹干時(shí)間上的差異。結(jié)果表明：以含2%氨水的甲醇作為洗脫溶劑時(shí)，提取回收率比以體積比為78∶20∶2的二氯甲烷-甲醇-氨水混合溶液的提取回收率高約20%，但在洗脫時(shí)間、氮吹吹干的時(shí)間明顯更長。綜合實(shí)際應(yīng)用情況，實(shí)驗(yàn)在保證洗脫效果和前處理時(shí)間平衡的前提下，選擇以體積比為78∶20∶2的二氯甲烷-甲醇-氨水混合溶液作為洗脫溶液。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

2.3.1 工作曲線、檢出限與定量限

氟胺酮及2種位置異構(gòu)體的線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。以3倍信噪比和10倍信噪比計(jì)算方法的檢出限（3×/）和定量限（10×/），結(jié)果見表2。結(jié)果表明：氟胺酮及2種位置異構(gòu) 體 在1～80 ng/L內(nèi) 線 性 關(guān) 系 良 好，2-FDCK、3F-DCK、4F-DCK的最低檢出限分別為0.2、0.3、0.4 ng/L，最低定量限均為1.0 ng/L。

表2 線性參數(shù)、檢出限和定量限

2.3.2 精密度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

氟胺酮及2種位置異構(gòu)體在不同質(zhì)量濃度下的準(zhǔn)確度為94.7%~101%，日內(nèi)精密度和日間精密度為2.7%~8.1%，詳見表3。

表3 污水中氟胺酮及2種位置異構(gòu)體的精密度、準(zhǔn)確度、回收率和基質(zhì)效應(yīng)

2.3.3回收率和基質(zhì)效應(yīng)

空白污水樣品基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)平均值見表3。結(jié)果表明：空白污水樣品基質(zhì)對氟胺酮及2種位置異構(gòu)體均體現(xiàn)出基質(zhì)減弱效應(yīng)；氟胺酮及2種位置異構(gòu)體的回收率為69.5%~108%。

2.3.4 延遲效應(yīng)

將氟胺酮及2種位置異構(gòu)體混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白污水基質(zhì)中，配制成質(zhì)量濃度為500 ng/L的添加樣品。按照實(shí)驗(yàn)方法對其平行測定6次，每個(gè)添加樣品進(jìn)樣后增加3針空白流動(dòng)相進(jìn)樣，以監(jiān)測不同來源污水的高濃度添加樣品的延遲響應(yīng)。結(jié)果表明：高濃度進(jìn)樣的各目標(biāo)物殘留響應(yīng)值低于其各目測物定量限響應(yīng)值的10%，這說明高濃度延遲對水樣中各目標(biāo)物測定結(jié)果的影響可忽略不計(jì)。

2.4 實(shí)際樣品分析

按照實(shí)驗(yàn)方法對華南地區(qū)某省一縣級市8個(gè)疑似有氟胺酮濫用的污水處理廠（含泵站）的實(shí)際樣品進(jìn)行分析，每個(gè)樣品測定2次，以堿型質(zhì)量濃度計(jì)算，氟胺酮及2種位置異構(gòu)體的測定結(jié)果見表4。

表4 8個(gè)城市污水樣品中氟胺酮位置異構(gòu)體的測定結(jié)果（ng/L）

北京大學(xué)李喜青教授團(tuán)隊(duì)于2022年首次發(fā)表污水中氟胺酮（2-FDCK）的檢測和評估方法，通過污水監(jiān)控分析了國內(nèi)氟胺酮的濫用水平呈逐年遞減的趨勢。本研究監(jiān)控的8個(gè)位點(diǎn)的氟胺酮與李喜青教授報(bào)道的國內(nèi)濫用水平符合性較好。目前，國內(nèi)外針對氟胺酮的檢測尚未涉及氟胺酮的位置異構(gòu)體，從檢測結(jié)果來看，我國部分地區(qū)已少量存在3F-DCK濫用的情況。為科學(xué)評估、有效監(jiān)管氟胺酮及其位置異構(gòu)體的濫用水平，各地可根據(jù)毒情形勢適時(shí)建立對應(yīng)的分析和評估方法。

3 結(jié)論

本文建立一種可同時(shí)檢測城市污水中氟胺酮及2種位置異構(gòu)體的固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，該方法具有較高的準(zhǔn)確度和可靠性，為精準(zhǔn)掌握氟胺酮及2種位置異構(gòu)體的濫用信息提供了技術(shù)保障。