何 柳， 曾 琳， 顧雅坤， 符 麗(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所，海南省南藥資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， ?？?570311)

全世界龍血樹(shù)屬植物約227種[1]，我國(guó)6種，分布于云南、廣西、海南、臺(tái)灣等省份[2]。海南龍血樹(shù)(DracaenacambodianaPierre ex Gagnep.)為天門冬科(Asparagaceae)龍血樹(shù)屬(Dracaena)喬木狀常綠植物[3]，是我國(guó)中藥資源龍血竭的基原物種之一[4]。野生資源在中國(guó)僅分布于海南島西南山區(qū)和南部沿海地區(qū)，常生長(zhǎng)于石灰?guī)r和花崗巖的石縫中[5]，其分泌的紅色樹(shù)脂含豐富的黃酮類、皂苷、茋類、甾醇等化合物[6-9]，常用于止血、鎮(zhèn)痛、消炎、活血、化瘀、生肌、斂瘡等[10-12]。海南龍血樹(shù)生長(zhǎng)緩慢，喜陽(yáng)耐旱[13]，且樹(shù)形優(yōu)美，具有較高的觀賞價(jià)值，是盆栽以及園林綠化的重要樹(shù)種，也是制作盆景的好素材[14-15]。由于具有重要的藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[13,16]，而導(dǎo)致海南龍血樹(shù)被過(guò)度采挖，其生境遭受嚴(yán)重破壞，野生種群急劇減少[5,17]，種群自然更新能力下降而不能更新復(fù)壯[5]，因此野生海南龍血樹(shù)在中國(guó)已瀕臨滅絕[18]，目前被列為國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)野生保護(hù)植物[19]。

超低溫保存一般是指在-196 ℃的超低溫條件下使保存材料的細(xì)胞物質(zhì)代謝及生長(zhǎng)活動(dòng)幾乎停止，以達(dá)到長(zhǎng)期保存材料的一門生物學(xué)技術(shù)[20]，是離體保存與低溫生物學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物[21]。在超低溫條件下，調(diào)節(jié)和控制細(xì)胞代謝的各類酶活性受到嚴(yán)重的抑制，生命活動(dòng)接近停止[22]。但其細(xì)胞仍具活性且不會(huì)發(fā)生遺傳物質(zhì)改變，從而達(dá)到長(zhǎng)期穩(wěn)定地保存植物種質(zhì)資源及珍貴實(shí)驗(yàn)材料的目的[23-24]。超低溫保存研究最早可追溯至19世紀(jì)后期[25]。1976年，Bajaj[26]發(fā)現(xiàn)經(jīng)液氮處理的胡蘿卜和煙草細(xì)胞懸浮液可培育出再生植株，此發(fā)現(xiàn)引起人們對(duì)超低溫保存領(lǐng)域的廣泛關(guān)注，隨后此技術(shù)被廣泛應(yīng)用于植物種子、花粉、離體培養(yǎng)的莖尖、愈傷組織等材料的保存[27-33]，其中以種子形式進(jìn)行超低溫保存操作簡(jiǎn)單[34]。種子材料進(jìn)行超低溫保存的關(guān)鍵在于找出最佳含水量范圍[35]，而最佳含水量范圍因植物種類和種子脂質(zhì)含量不同而往往有所差異[36-37]。如降香黃檀種子超低溫保存最適含水量為12.35%[28]，馬尾松種子為6.10%[38]，白木香種子為7.35%[39]，荊芥種子為3%[40]。

海南龍血樹(shù)種子在低溫(4 ℃)貯藏短時(shí)間內(nèi)能有效解除休眠而保持較高的發(fā)芽率，但貯藏110 d后種子的萌發(fā)率開(kāi)始下降[41]。目前對(duì)海南龍血樹(shù)種質(zhì)資源長(zhǎng)期穩(wěn)定保存的方法仍未見(jiàn)報(bào)道。為了能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定保存海南龍血樹(shù)種質(zhì)資源，對(duì)其種子超低溫保存的最適含水量和最佳冷凍方式進(jìn)行探索。本試驗(yàn)將不同含水量的海南龍血樹(shù)種子進(jìn)行超低溫保存后測(cè)定其發(fā)芽率和生理生化活性，并通過(guò)石蠟切片觀察超低溫保存對(duì)其細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響，探索海南龍血樹(shù)種子超低溫保存的最適含水量和最佳保存方法，為海南龍血樹(shù)種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

成熟的海南龍血樹(shù)種子采自海南省萬(wàn)寧大洲島，由國(guó)家南藥基因資源庫(kù)提供，原始含水量為38.72%，原始發(fā)芽率為52.22%，保存于4 ℃冰箱備用。選取乳白色、沒(méi)有霉點(diǎn)的種子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 方 法

1.2.1獲取不同含水量的海南龍血樹(shù)種子

將海南龍血樹(shù)種子放在無(wú)水硅膠中干燥6 h、14 h、36 h、50 h、80 h，獲得含水量分別為31.46%、27.05%、13.05%、6.00%、4.40%的種子，以備后續(xù)試驗(yàn)。含水量的測(cè)定參照《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行，選用高恒溫烘干法，130 ℃烘干1 h。

1.2.2測(cè)定海南龍血樹(shù)種子超低溫保存發(fā)芽情況

將不同含水量的種子分別用玻璃化冷凍法、分步冷凍法、直接冷凍法進(jìn)行超低溫保存24 h。其中玻璃化法超低溫保存是用裝載液LS溶液(每升MS溶液中含2 mol甘油和0.4 mol蔗糖)于25 ℃浸泡處理種子20 min，再用玻璃化保護(hù)溶液PVS2(每升MS溶液中含30%甘油、0.4 mol蔗糖、15%聚乙二醇和15%二甲亞砜)冰浴處理種子30 min，換上預(yù)冷新鮮的PVS2后迅速投入液氮中進(jìn)行超低溫保存；分步冷凍法超低溫保存是用玻璃化保護(hù)溶液PVS2在4 ℃下處理種子30 min，再轉(zhuǎn)移至-20 ℃冰箱中冷凍處理1 h，取出后迅速投入液氮中進(jìn)行超低溫保存24 h；直接冷凍法超低溫保存是將種子直接投入液氮中進(jìn)行超低溫保存24 h。

將種子從液氮中取出，40 ℃水浴解凍2 min，其中玻璃化冷凍法和分步冷凍法超低溫保存的海南龍血樹(shù)種子用US洗滌溶液(每升MS溶液中含1.2 mol蔗糖)洗滌10 min，無(wú)菌水浸泡3次，每次2 min；直接冷凍法超低溫保存的海南龍血樹(shù)種子解凍后，用無(wú)菌水清洗3次，每次2 min。擦干種子表面水分，接種在無(wú)菌濾紙上，用無(wú)菌水濕潤(rùn)濾紙，放進(jìn)人工氣候培養(yǎng)箱中23～26 ℃、光照8 h培養(yǎng)，發(fā)芽后開(kāi)始統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。

1.2.3測(cè)定海南龍血樹(shù)種子生理生化活性

對(duì)未經(jīng)超低溫處理(含水量為38.72%、31.46%、27.05%、13.05%、6.00%)和經(jīng)直接冷凍法超低溫處理(含水量為6.00%)的海南龍血樹(shù)種子進(jìn)行生理生化活性測(cè)定，用考馬斯亮藍(lán)測(cè)定蛋白質(zhì)含量[42]，淀粉酶試劑盒(試劑盒為南京建成生物工程研究所淀粉酶試劑盒C 016，碘-淀粉比色法)測(cè)定α-淀粉酶活性，硫代巴比妥酸測(cè)定MDA含量[43]，氮藍(lán)四唑測(cè)定SOD活性[43]，愈創(chuàng)木酚測(cè)定POD活性[43]，H2O2測(cè)定CAT活性[44]。

1.2.4海南龍血樹(shù)種子石蠟切片觀察

將直接冷凍法超低溫保存前后的海南龍血樹(shù)種子(含水量為38.72%、16.42%、6.00%)分別制成石蠟切片。

1.2.5數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)為單因子試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)3次重復(fù)，數(shù)據(jù)用SPPS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行Ducan法分析，用Microsoft Excel制圖。

2 結(jié) 果

2.1 含水量對(duì)海南龍血樹(shù)種子超低溫保存的影響

如表1所示，對(duì)不同含水量的種子分別進(jìn)行玻璃化冷凍、分步冷凍、直接冷凍超低溫處理，其發(fā)芽率在一定含水量范圍內(nèi)，隨著含水量的降低而顯著升高。當(dāng)種子含水量較高時(shí)，3種超低溫法處理均不發(fā)芽；種子含水量降至6.00%時(shí)，直接冷凍組發(fā)芽率最高，為73.89%，此時(shí)，3種冷凍法的發(fā)芽率差異不顯著，均高于對(duì)照組；含水量繼續(xù)降至4.40%，所有處理的種子發(fā)芽率顯著下降。本試驗(yàn)中，6.00%含水量下3種超低溫保存方法處理的種子發(fā)芽率差異不顯著，但以直接冷凍法為最佳，能節(jié)約保存成本、縮短入庫(kù)時(shí)間，初步得出，含水量6.00%、直接冷凍法為海南龍血樹(shù)種子超低溫保存的最適含水量和最佳冷凍方式。

表1 含水量對(duì)海南龍血樹(shù)種子超低溫保存發(fā)芽率的影響Table 1 Effects of seeds moisture content on seed germination rate of Dracaena cambodiana after ultra-cryopreservation

2.2 含水量對(duì)海南龍血樹(shù)種子生理生化活性的影響

基于初步結(jié)果海南龍血樹(shù)種子超低溫保存的最適含水量為6.00%，對(duì)含水量為38.72%、31.46%、27.05%、13.05%、6.00%的海南龍血樹(shù)種子進(jìn)行生理生化活性測(cè)定，探索含水量降至6.00%時(shí)對(duì)種子生理生化活性的影響。結(jié)果如圖1，隨著含水量的降低，種子的CAT活性和POD活性呈“N”型的變化趨勢(shì)；含水量為6.00%時(shí)，表現(xiàn)出較高的CAT活性和POD活性，均差異顯著；含水量為13.05%時(shí)，CAT活性、POD活性最低；SOD活性隨著含水量降低緩慢下降，直至含水量為6.00%時(shí)達(dá)到最低；MDA含量隨含水量的降低先緩慢增加后快速升高，含水量為38.72%時(shí)含量最低，6.00%時(shí)達(dá)到最高；α-淀粉酶活性與MDA類似，隨著含水量的降低呈直線式升高，含水量為38.72%時(shí)α-淀粉酶活性最低，6.00%時(shí)達(dá)到最高。

注：不同小寫字母表示不同含水量下海南龍血樹(shù)種子生理生化活性差異顯著(p<0.05)。圖1 含水量對(duì)海南龍血樹(shù)種子生理生化活性的影響Fig.1 Effects of seeds moisture content on physiological and biochemical of Dracaena cambodiana seeds

2.3 直接冷凍超低溫對(duì)含水量6.00%的海南龍血樹(shù)種子生理生化活性的影響

最適含水量(6.00%)的海南龍血樹(shù)種子經(jīng)最佳超低溫保存方法(直接冷凍法)處理后，對(duì)其生理生化活性進(jìn)行測(cè)定，對(duì)照為未經(jīng)超低溫處理的含水量6.00%的海南龍血樹(shù)種子。如表2所示，超低溫保存后的種子POD活性較對(duì)照組顯著下降，CAT活性、SOD活性、MDA含量、α-淀粉酶活性和蛋白質(zhì)含量與對(duì)照相比差異不顯著。

表2 直接冷凍超低溫保存對(duì)海南龍血樹(shù)種子生理生化的影響Table 2 Effects of direct freezing method on physiological and biochemical characteristics of Dracaena cambodiana seeds

2.4 海南龍血樹(shù)種子石蠟切片觀察

將直接冷凍法超低溫保存前后含水量為38.72%、16.42%、6.00%的海南龍血樹(shù)種子，分別制成石蠟切片，觀察超低溫保存前后細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。如圖2所示，當(dāng)含水量為38.72%時(shí)，對(duì)照組(未經(jīng)超低溫保存處理)種子細(xì)胞完整，細(xì)胞質(zhì)未收縮，細(xì)胞壁清晰；直接冷凍組細(xì)胞壁破碎，細(xì)胞質(zhì)溶出，細(xì)胞結(jié)構(gòu)嚴(yán)重?fù)p傷。當(dāng)含水量為16.42%時(shí)，對(duì)照組細(xì)胞壁清晰，細(xì)胞質(zhì)輕微收縮；直接冷凍組大部分細(xì)胞完整，細(xì)胞壁清晰，細(xì)胞質(zhì)輕微收縮，而少部分細(xì)胞損傷，細(xì)胞壁不清晰，未見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)溶出。當(dāng)含水量為6.00%時(shí)，對(duì)照組細(xì)胞壁清晰，細(xì)胞質(zhì)收縮；直接冷凍法組細(xì)胞均完整，細(xì)胞壁清晰，細(xì)胞質(zhì)收縮，少見(jiàn)細(xì)胞損傷，與對(duì)照組形態(tài)相比變化輕微。從石蠟切片結(jié)果中可得出，較低含水量更適合海南龍血樹(shù)種子超低溫保存。

注：a、b、c分別為含水量38.72%、16.42%和6.00%對(duì)照組；A、B、C分別為含水量38.72%、16.42%和6.00%直接冷凍法超低溫保存組。圖2 超低溫保存對(duì)海南龍血樹(shù)種子細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響(×40)Fig.2 Effects of ultra-cryopreservation on cell structure of seeds of Dracaena cambodiana(×40)

3 結(jié)論與討論

含水量是種子進(jìn)行超低溫長(zhǎng)期穩(wěn)定保存的關(guān)鍵因素，過(guò)高或過(guò)低都會(huì)降低種子超低溫保存成活率[45]。本研究中，含水量6.00%比其他含水量種子超低溫保存后發(fā)芽率顯著高，表明適宜的含水量有利于種子進(jìn)行超低溫保存，這與商麗煌[34]，宋紅等[46]的研究結(jié)果一致。超低溫保存方法對(duì)種子冷凍后的成活率有一定的影響，不同的冷凍方法通過(guò)不同途徑避免細(xì)胞內(nèi)自由水形成冰晶，從而減少細(xì)胞在冷凍過(guò)程中受到傷害[34,47]。張曉寧等[48]，曾琳等[28]，顧雅坤等[47]通過(guò)比較超低溫常用的保存方法，發(fā)現(xiàn)馬尾松種子、降香黃檀種子、九里香種子的最佳冷凍方式分別為直接冷凍法、玻璃化冷凍法、分步冷凍法。本研究中，6.00%含水量的海南龍血樹(shù)種子經(jīng)玻璃化冷凍、分步冷凍、直接冷凍3種超低溫保存方法處理的發(fā)芽率差異不顯著，但直接冷凍法超低溫能有效節(jié)約試驗(yàn)成本、試驗(yàn)時(shí)間[27]。

細(xì)胞的存活狀態(tài)可通過(guò)觀察其細(xì)胞結(jié)構(gòu)是否完整來(lái)判斷[34,49]。試驗(yàn)中，從石蠟切片中觀察到，經(jīng)直接冷凍超低溫保存的種子，隨著含水量逐漸降低，種子抗凍能力相應(yīng)提高，細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷情況得到減緩。經(jīng)冷凍處理的高含水量種子，細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的破壞，導(dǎo)致喪失萌發(fā)能力；當(dāng)含水量降低至6.00%時(shí)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)上只有輕微變形，種子萌發(fā)能力未受到影響，這與發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)應(yīng)。表明種子適當(dāng)脫水能在超低溫保存后獲得較高的存活率[34]。

植物受到脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生使細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的活性氧[50]。MDA在細(xì)胞內(nèi)積累會(huì)損害細(xì)胞膜，其含量可衡量細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化程度[51]。CAT、POD、SOD能清除活性氧以保護(hù)細(xì)胞膜不受損傷[50]。α-淀粉酶能為種子萌發(fā)生長(zhǎng)提供能量[52]。試驗(yàn)中，未經(jīng)超低溫保存的種子隨著含水量的降低，α-淀粉酶活性呈上升的變化趨勢(shì)，α-淀粉酶活性升高有助于種子萌發(fā)，與發(fā)芽檢測(cè)結(jié)果相對(duì)應(yīng)。MDA含量隨含水量的降低呈上升的變化趨勢(shì)，說(shuō)明脫水過(guò)程刺激種子產(chǎn)生了活性氧，導(dǎo)致MDA含量積累；MDA會(huì)抑制細(xì)胞保護(hù)酶的活性，降低抗氧化物的含量，與SOD活性隨含水量的降低呈現(xiàn)下降的變化趨勢(shì)結(jié)果一致。隨著含水量的降低，過(guò)氧化氫酶和過(guò)氧化物酶總體上呈上升的變化趨勢(shì)，13.05%前變化不大，含水量降至6.00%時(shí)，脫水刺激導(dǎo)致活性氧增加，同時(shí)脫水脅迫又促使細(xì)胞內(nèi)保護(hù)酶大量升高來(lái)清除活性氧以減少細(xì)胞膜的受損程度。試驗(yàn)中，經(jīng)直接冷凍超低溫保存后的6.00%含水量的種子POD活性降低了，表明在超低溫冷凍影響下，種子抗氧化能力減弱了，這與對(duì)益智[27]種子、玉蟬花[46]種子的研究結(jié)果一致。而其他生理生化活性測(cè)定指標(biāo)均與未超低溫處理的種子差異不顯著，說(shuō)明直接冷凍法超低溫保存對(duì)種子傷害不大，這與石蠟切片觀察結(jié)果一致。綜合分析發(fā)芽情況、石蠟切片結(jié)果及生理生化指標(biāo)，表明海南龍血樹(shù)種子進(jìn)行超低溫保存是可行的。

本試驗(yàn)對(duì)海南龍血樹(shù)種子的超低溫保存方法和最適保存含水量進(jìn)行了探索，結(jié)果顯示，6.00%的含水量和直接冷凍法是海南龍血樹(shù)種子進(jìn)行長(zhǎng)期超低溫保存的最優(yōu)組合條件，為日后海南龍血樹(shù)種質(zhì)資源的保存提供了理論依據(jù)。