巫旗生，祁劍飛，寧 岳，羅 娟，龐小鵬，郭 香，羅輝玉，曾志南*

(1.福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建省海洋生物資源開(kāi)發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，海洋生物種業(yè)技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 廈門 361013；2.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021)

鈍綴錦蛤(Tapesconspersus)俗稱“沙包螺”，隸屬于軟體動(dòng)物門、瓣鰓綱、簾蛤目、簾蛤科，是中國(guó)南方沿海的重要經(jīng)濟(jì)貝類品種。鈍綴錦蛤主要分布在中國(guó)、日本、菲律賓、印度、印度尼西亞、澳大利亞和新西蘭等國(guó)家沿海地區(qū)，在中國(guó)常見(jiàn)于東海、南海及臺(tái)灣海峽等[1]。鈍綴錦蛤生長(zhǎng)速度快、個(gè)體較大，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，目前在我國(guó)福建、廣東、廣西等沿海地區(qū)已經(jīng)小規(guī)模養(yǎng)殖。國(guó)內(nèi)外科研人員以鈍綴錦蛤?yàn)檠芯繉?duì)象，在種類鑒定[2-6]、繁殖生物學(xué)[7]、生態(tài)習(xí)性[8-10]、人工選育及養(yǎng)殖[11-15]等相關(guān)方面開(kāi)展了大量的研究工作，但尚未見(jiàn)鈍綴錦蛤卵母細(xì)胞體外促熟的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 精、卵的獲得

實(shí)驗(yàn)用鈍綴錦蛤?yàn)閺B門市翔安區(qū)大嶝街道小嶝池塘養(yǎng)殖的2齡親貝，平均體質(zhì)量為(35.77±7.40)g，平均殼長(zhǎng)為(62.44±3.91)mm，平均殼高為(40.53±2.34)mm，平均殼寬為(26.08±1.65)mm。鈍綴錦蛤親貝經(jīng)過(guò)池塘?xí)吼B(yǎng)1個(gè)月后，從中挑選性腺成熟度好的個(gè)體，解剖獲得精、卵。卵液用300目篩絹網(wǎng)過(guò)濾去除較大組織等，再用500目篩絹網(wǎng)收集卵子等。精液用500目篩絹網(wǎng)過(guò)濾雜質(zhì)。檢查卵子成熟度及精子活力等情況，并選擇成熟度高的卵子及活力好的精子用于開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。

1.2 解剖卵母細(xì)胞的體外促熟

在室溫(22℃)條件下，在50 mL離心管中分別加入30 mL成熟度高的卵液，然后加入不同濃度的5-HT和氨海水處理液，卵母細(xì)胞密度保持在500～1 000個(gè)/mL，混勻后開(kāi)始計(jì)時(shí)。5-HT處理濃度梯度設(shè)定為0.01、0.1、1、10、100、1 000 μmol/L；氨海水處理濃度梯度設(shè)定為0.002 5%、0.005%、0.010%、0.015%、0.020%和0.025%。藥品處理時(shí)間梯度分別為15、30、45、60 min。采用在自然海水中浸泡的卵母細(xì)胞作為對(duì)照組，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行組。

1.3 人工授精

用500目篩絹網(wǎng)過(guò)濾去除處理液，將卵子收集在500 mL燒杯中，然后加入2～3滴活力好的精子，充分混勻。在受精過(guò)程中，應(yīng)盡量攪動(dòng)受精卵液，保證溶解氧充足。

1.4 觀察記錄GVBD發(fā)生率和受精率

受精卵發(fā)育2 h后，取樣進(jìn)行顯微鏡拍照計(jì)數(shù)，同時(shí)計(jì)算GVBD發(fā)生率和受精率。

GVBD發(fā)生率=發(fā)生GVBD的卵子數(shù)/卵子總數(shù)×100%

(1)

受精率=卵裂的受精卵數(shù)量/卵子總數(shù)×100%

(2)

1.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan’s多重比較檢驗(yàn)不同組差異顯著性，顯著水平設(shè)置為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈍綴錦蛤卵母細(xì)胞體外促熟的形態(tài)變化

解剖獲得的鈍綴錦蛤卵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)自然海水的浸泡，生發(fā)泡幾乎不發(fā)生破裂(圖1A)；采用一定濃度的5-HT、氨海水浸泡鈍綴錦蛤卵母細(xì)胞后，生發(fā)泡發(fā)生了不同程度的破裂(圖1B)。經(jīng)過(guò)適宜濃度和處理時(shí)間體外促熟的卵母細(xì)胞受精后，部分受精卵可以正常發(fā)育(圖1C)；當(dāng)藥物濃度過(guò)高或處理時(shí)間太長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞出現(xiàn)不受精、發(fā)育速度過(guò)慢、發(fā)育畸形等情況(圖1D)。

注：A.生發(fā)泡未破裂的卵細(xì)胞；B.生發(fā)泡破裂的卵細(xì)胞；C.正常發(fā)育的受精卵；D.畸形受精卵。

2.2 5-HT對(duì)鈍綴錦蛤卵母細(xì)胞的促熟作用

鈍綴錦蛤解剖卵母細(xì)胞在正常海水中浸泡一段時(shí)間后，生發(fā)泡幾乎不會(huì)發(fā)生破裂；采用5-HT浸泡可以顯著促使鈍綴錦蛤卵母細(xì)胞的成熟(圖2)。當(dāng)處理時(shí)間相同時(shí)，采用10 μmol/L～1 mmol/L 5-HT 浸泡鈍綴錦蛤卵母細(xì)胞，GVBD發(fā)生率差異不顯著(P>0.05)；采用0.01～1 μmol/L 5-HT 浸泡鈍綴錦蛤卵母細(xì)胞，GVBD發(fā)生率差異顯著(P<0.05)，表現(xiàn)出一定的濃度依賴關(guān)系。除45 min和60 min同一濃度實(shí)驗(yàn)組之間差異不顯著(P>0.05)外，其他不同時(shí)間同一濃度實(shí)驗(yàn)組差異顯著(P<0.05)，表現(xiàn)出一定的時(shí)間依賴關(guān)系。

鈍綴錦蛤的卵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同濃度5-HT浸泡處理后，人工授精的受精率見(jiàn)圖3。卵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)5-HT浸泡后，可以顯著提高受精率(P<0.05)。除了0.01～0.1 μmol/L 5-HT實(shí)驗(yàn)組外，其他實(shí)驗(yàn)組(1 μmol/L～1 mmol/L 5-HT)表現(xiàn)出一定的時(shí)間依賴關(guān)系，受精率隨時(shí)間增加而提高。當(dāng)處理時(shí)間相同時(shí)，表現(xiàn)出一定的濃度依賴關(guān)系，1～10 μmol/L 5-HT實(shí)驗(yàn)組的受精率顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)；其中，10 μmol/L 5-HT浸泡60 min實(shí)驗(yàn)組受精率最高，達(dá)到48.57%。

2.3 氨海水對(duì)鈍綴錦蛤卵母細(xì)胞的促熟作用

對(duì)鈍綴錦蛤解剖卵母細(xì)胞采用一定濃度的氨海水浸泡，可以顯著促使卵母細(xì)胞的成熟(圖4)。當(dāng)處理時(shí)間相同時(shí)，采用0.002 5%～0.010%氨海水浸泡鈍綴錦蛤卵母細(xì)胞，GVBD發(fā)生率差異不顯著(P>0.05)；采用0.015%～0.025%氨海水浸泡鈍綴錦蛤卵母細(xì)胞，GVBD發(fā)生率差異顯著(P<0.05)，表現(xiàn)出一定的濃度依賴關(guān)系。除了0.002 5%氨海水實(shí)驗(yàn)組外，其他實(shí)驗(yàn)組隨著處理時(shí)間的增加，GVBD發(fā)生率差異顯著(P<0.05)，表現(xiàn)出一定的時(shí)間依賴關(guān)系。

鈍綴錦蛤的卵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同濃度氨海水浸泡處理后，人工授精的受精率見(jiàn)圖5。卵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)氨海水浸泡后，可以顯著提高受精率(P<0.05)。除了0.002 5%～0.005%、0.025%氨海水實(shí)驗(yàn)組外，其他實(shí)驗(yàn)組(0.015%～0.020%氨海水)表現(xiàn)出一定的時(shí)間依賴關(guān)系，15 min至45 min時(shí)間內(nèi)受精率隨時(shí)間增加而提高。當(dāng)處理時(shí)間相同時(shí)，表現(xiàn)出一定的濃度依賴關(guān)系，0.015%～0.025%氨海水實(shí)驗(yàn)組的受精率顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)；其中，0.020%氨海水浸泡45 min實(shí)驗(yàn)組受精率最高，達(dá)到50.75%。

采用不同濃度的氨海水浸泡鈍綴錦蛤卵母細(xì)胞，雖然可以獲得較高GVBD發(fā)生率和受精率，但受精卵的畸形率較高，部分受精卵在卵裂過(guò)程中就停止胚胎發(fā)育。

3 討論

3.1 5-HT和氨海水對(duì)海水貝類卵母細(xì)胞促熟作用

在海水貝類人工育苗過(guò)程中，親貝性腺成熟程度非常關(guān)鍵，卵子質(zhì)量的好壞直接決定整個(gè)育苗過(guò)程的成功率[28]。海水貝類卵母細(xì)胞的形態(tài)、GVBD發(fā)生率以及細(xì)胞器的狀態(tài)等都是判斷卵母細(xì)胞成熟度的重要依據(jù)[29]，因此，在開(kāi)展鈍綴錦蛤解剖卵母細(xì)胞的體外促熟過(guò)程中，應(yīng)選擇卵徑在70～80 μm、形狀圓形的卵母細(xì)胞。海水貝類的解剖配子存在兩種狀態(tài)：一種是卵生型牡蠣等[30]的解剖卵母細(xì)胞可以直接人工授精發(fā)育，而絕大部分海水貝類，如菲律賓蛤仔、硬殼蛤(Mercenariamercenaria)、馬氏珠母貝(Pinctadafucata)、櫛孔扇貝(Chlamysfarrer)等解剖卵母細(xì)胞不能直接受精或受精率極低[31]，這是因?yàn)榻馄事涯讣?xì)胞含有的生發(fā)泡在生理上是不成熟的，必須經(jīng)過(guò)一定濃度的藥物(5-HT、氨海水、維生素、多巴胺等)浸泡處理后，卵母細(xì)胞才能夠受精。

本研究采用了5-HT和氨海水浸泡鈍綴錦蛤解剖卵母細(xì)胞，結(jié)果表明5-HT和氨海水均能夠促使卵母細(xì)胞的生發(fā)泡破裂，GVBD發(fā)生率達(dá)到80%以上，受精率達(dá)到45%左右。采用5-HT和氨海水浸泡卵母細(xì)胞，鈍綴錦蛤與其他海水貝類獲得的最高GVBD發(fā)生率和受精率各不相同(表1)，這可能與不同種類生活習(xí)性及生活環(huán)境條件(溫度、pH等)有關(guān)。

表1 海水貝類卵母細(xì)胞經(jīng)5-HT和氨海水浸泡獲得的最高GVBD發(fā)生率和受精率

3.2 處理時(shí)間和藥物濃度對(duì)鈍綴錦蛤卵母細(xì)胞受精發(fā)育的影響

卵母細(xì)胞的生發(fā)泡破裂是卵子成熟最明顯的標(biāo)志[16]，因此采用不同濃度藥物和不同處理時(shí)間，可以有效地提高解剖卵母細(xì)胞的GVBD發(fā)生率和受精率。5-HT和氨海水作為海水貝類卵母細(xì)胞體外促熟有效的化學(xué)藥物，在海水貝類繁殖過(guò)程中起著非常重要的作用，特別是在促使卵母細(xì)胞進(jìn)一步成熟等方面[22]。

邸煒鵬等[19]采用0.005%氨海水處理15 min后、再用2 mmol/L 5-HT處理櫛孔扇貝解剖卵子，卵子的受精率達(dá)到40.02%。李浩浩等[27]采用一定濃度的氨海水(0.008%～0.014%)浸泡櫛江珧解剖卵母細(xì)胞40～60 min，可以顯著提高GVBD發(fā)生率和受精率，受精卵在發(fā)育過(guò)程中的畸形率較低；而采用5-HT、多巴胺和維生素浸泡卵母細(xì)胞，體外促熟效果不明顯。本研究表明，1～10 μmol/L 5-HT和0.015%～0.025%氨海水均能夠顯著提高鈍綴錦蛤解剖卵母細(xì)胞的GVBD發(fā)生率和受精率，0.015%～0.025%氨海水實(shí)驗(yàn)組的GVBD發(fā)生率高于1～10 μmol/L 5-HT實(shí)驗(yàn)組，雖然受精率相似，但氨海水實(shí)驗(yàn)組的受精卵發(fā)育過(guò)程中畸形較多；當(dāng)藥物浸泡時(shí)間為45～60 min時(shí)，GVBD發(fā)生率和受精率達(dá)到了最大值。因此，對(duì)鈍綴錦蛤解剖卵母細(xì)胞進(jìn)行體外促熟時(shí)，藥物濃度及浸泡時(shí)間應(yīng)控制在適宜范圍內(nèi)，從而確保較高的GVBD發(fā)生率和受精率。

3.3 解剖授精在海水貝類遺傳育種中的作用

目前在海水貝類人工育苗生產(chǎn)中，只有牡蠣等極少數(shù)海水貝類采取人工授精方法進(jìn)行育苗生產(chǎn)，其他海水貝類主要采用人工催產(chǎn)方法進(jìn)行育苗生產(chǎn)[31]。由于海水貝類是分批成熟、分批產(chǎn)卵的，在人工催產(chǎn)時(shí)的產(chǎn)卵不同步、產(chǎn)卵時(shí)間長(zhǎng)等因素都直接影響育種工作的順利開(kāi)展。因此，開(kāi)展海水貝類卵母細(xì)胞的體外促熟方法研究可以解決卵子受精同步性等問(wèn)題，為海水貝類多倍體育種、選擇育種、雜交育種的開(kāi)展提供有力的技術(shù)支撐。