李程勛 徐曉俞 鄭開斌 李愛萍

(福建省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所，福建 福州 350013)

蠶豆，別名南豆、胡豆、蘭花豆等，豆科、豌豆屬，是主要的食用豆類作物[1-2]。蠶豆含有豐富的氨基酸、碳水化合物、纖維素、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分[3-4]，具有高蛋白、高淀粉、低脂肪等特性[5-6]，其蛋白質(zhì)含量比禾谷類作物小麥、稻米、玉米高2～3倍[7]。蠶豆蛋白中氨基酸種類豐富，含有人體所需的必需氨基酸，且蠶豆蛋白中只含有豆固醇，不含動物蛋白中的膽固醇，可以避免因攝入過多膽固醇而影響健康[8]，可見蠶豆是理想的蛋白來源[9-10]。埃及和摩洛哥將蠶豆作為蛋白質(zhì)的重要來源，伊朗將蠶豆作為物美價廉的兒童高蛋白食品[11]。

近年來，發(fā)芽蠶豆作為一種營養(yǎng)食品受到人們的關注[12]。研究表明，發(fā)芽能夠提高豆類的生理活性物質(zhì)含量，如綠豆發(fā)芽能提高其酚類和膳食纖維類化合物含量，顯著提高其營養(yǎng)價值[13-14]；大豆發(fā)芽可以提高其單糖、游離必需氨基酸[15]、有機酸[16-17]和功能因子含量[18-19]，產(chǎn)生新的活性物質(zhì)[20]，降低致敏原和脲酶活性[21]，提高其抗氧化能力[22-23]；蠶豆發(fā)芽能提高總酚和L-二羥苯丙氨酸的含量[24]；發(fā)芽是改善豆類種子營養(yǎng)成分和降低抗營養(yǎng)因子的有效方法[24-25]。

當前對于蠶豆發(fā)芽方面的研究較少，且主要集中在發(fā)芽蠶豆蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉、抗營養(yǎng)因子、植酸等的含量測定方面[26-27]，對于發(fā)芽蠶豆的蛋白質(zhì)變化趨勢及抗氧化能力方面的研究尚鮮見報道。因此，本研究采用凱氏定氮法測定蠶豆發(fā)芽過程中蛋白質(zhì)含量的變化，應用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)技術觀察蠶豆蛋白的變化趨勢，并對蠶豆發(fā)芽過程中氨基酸的含量和成分變化進行觀察和評估，應用自由基清除試驗測定蠶豆蛋白的抗氧化能力，分析蠶豆發(fā)芽過程中蛋白質(zhì)及其抗氧化能力的變化趨勢，以期為蠶豆發(fā)芽產(chǎn)品的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

福蠶1號蠶豆種子，取自福建省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所。

1.2 試驗儀器和試劑

DHG-9240A電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；HK-04A手提式粉碎機，廣州市旭朗機械設備有限公司；SB-5200DTDN超聲儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；Centrifuge5804R離心機，德國Eppendorf公司；T6新世紀紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

無水乙醇、氫氧化鈉、過硫酸鉀均為國產(chǎn)分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)，東京化成工業(yè)株式會社；2,2′-聯(lián)氮雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽[2,2′-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)ammonium salt, ABTS]，上海麥克林生化科技有限公司；1×磷酸鹽(phosphate buffered saline, PBS)緩沖液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、考馬斯亮藍蛋白膠快速染色液、5×蛋白上樣緩沖液[含二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)]，北京索萊寶科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)芽蠶豆樣品制備 取蠶豆種子浸泡12 h，浸泡后取出用水沖洗，蓋上濕布，在溫度25℃條件下培育，每隔24 h進行取樣，將發(fā)芽蠶豆樣品置于烘箱中，75℃烘干至恒重，去皮研磨成細粉過100目篩，即得發(fā)芽蠶豆細粉。

1.3.2 蛋白質(zhì)和氨基酸含量測定 采用《GB 5009.5-2016食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》的方法測定發(fā)芽蠶豆樣品的蛋白質(zhì)含量[28]；采用《GB 5009.124-2016食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》的方法測定發(fā)芽蠶豆樣品的氨基酸含量[29]。

1.3.3 發(fā)芽蠶豆營養(yǎng)品質(zhì)評價方法 采用聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織(Food and Agriculture Organization/World Health Organization, FAO/WHO)1973年推薦的全雞蛋氨基酸模式和必需氨基酸模式，分別計算發(fā)芽蠶豆蛋白氨基酸評分(amino acid score, AAS)和化學評分(chemical score, CS)[30]。

1.3.4 蠶豆蛋白提取 參照楊海濤等[31]的試驗方法。取適量發(fā)芽蠶豆細粉，以1∶5的料液比加入5×10-5mol·L-1的氫氧化鈉(NaOH)溶液，震蕩均勻，超聲20 min，4 000 r·min-1離心10 min后取上清，加入氯化氫(HCl)調(diào)節(jié)上清液pH值至4.5，置于4℃冰箱中靜置過夜，4 000 r·min-1離心10 min，用95%乙醇洗滌沉淀3次后干燥，即得蠶豆蛋白樣品。

1.3.5 蠶豆蛋白SDS-PAGE凝膠電泳 利用SDS-PAGE凝膠制備試劑盒制膠，分離膠濃度12%，濃縮膠濃度5%，用PBS溶液配置1 mg·mL-1蠶豆蛋白溶液，取10 μL蠶豆蛋白溶液與2.5 μL 5×蛋白上樣緩沖液混勻，100℃水浴5 min，上樣，電泳后用考馬斯亮藍蛋白膠快速染色液進行染色，觀察譜帶并拍照。

1.3.6 蠶豆蛋白DPPH自由基清除能力測定 參照Baltrusaityte等[32]的試驗方法。取蠶豆蛋白粉用PBS溶液配置成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg·mL-1蠶豆蛋白溶液進行測定。

取蠶豆蛋白溶液和DPPH自由基溶液(39.40 μg·mL-1)等量混合均勻，靜置30 min，測定混合液在517 nm波長下的吸光度，并按以下公式計算蠶豆蛋白溶液對DPPH自由基的清除率，每個樣品重復3次。

DPPH自由基清除率=(1-A1/A2)×100%

式中，A1為DPPH自由基溶液與蠶豆蛋白溶液混合的吸光度值；A2為DPPH自由基溶液與純水混合的吸光度值。

1.3.7 蠶豆蛋白ABTS自由基清除能力測定 參照管瑛等[33]的試驗方法。取76 mg ABTS和13 mg過硫酸鉀配置成20 mL的溶液，室溫下暗室靜置反應16 h，將溶液稀釋50倍后待用。

取蠶豆蛋白溶液和ABTS自由基溶液混合均勻，靜置30 min，測定混合液在734 nm波長下的吸光度值，并計算蠶豆蛋白溶液對ABTS自由基的清除率，每個樣品重復3次。

ABTS自由基清除率=(1-A3/A4)×100%

式中，A3為ABTS自由基溶液與蠶豆蛋白溶液混合的吸光度值；A4為ABTS自由基溶液與純水混合的吸光度值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2003和SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用BandScan 5.0軟件進行凝膠圖像分析，采用GraphPad Prism 5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 蠶豆發(fā)芽過程中蛋白質(zhì)的變化

由圖1可知，蠶豆發(fā)芽后蠶豆蛋白的含量有顯著升高，在發(fā)芽9 d時，蠶豆蛋白的含量達到最大值，為34.1 g·100g-1，比發(fā)芽0 d的蠶豆蛋白含量高25.4%。

注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

蠶豆蛋白中除了少量可溶于水的清蛋白外，大多數(shù)是鹽溶性的球蛋白，清蛋白主要是功能蛋白，如糖苷酶和蛋白酶類等代謝過程中起重要作用的蛋白[34]，球蛋白主要是儲藏蛋白，主要有11S球蛋白和7S球蛋白兩種組分[35]，11S球蛋白存在4種酸性亞基和4種堿性亞基，它們之間的分子量相差很小，分別在34～45 kDa之間和17～20 kDa之間；7S球蛋白為三聚體蛋白，由3個分子量為68、72、52 kDa的亞基組成。由圖2和圖3可知，蠶豆蛋白SDS-PAGE凝膠電泳共檢測出17條條帶，相對分子量分別為116、97、96、72、68、64、63、56、52、47、42、40、38、32、27、22、17 kDa。隨著蠶豆芽的生長，發(fā)芽蠶豆蛋白的分子量有變小的趨勢，其中35 kDa以上的蛋白條帶變淡，25～35 kDa和14.4～18.4 kDa之間的蛋白條帶變深，可見在蠶豆芽生長的過程中，蠶豆蛋白部分由大分子量轉(zhuǎn)變成小分子量。其中32 kDa處的蛋白表達量隨著蠶豆發(fā)芽天數(shù)的增加而增大，32 kDa蛋白又稱D1蛋白，是葉綠體psbA基因編碼的位于類囊體膜上的一種蛋白質(zhì)，是光合作用的調(diào)控位點[36-37]。

圖2 蠶豆發(fā)芽過程中蛋白的SDS-PAGE圖

圖3 蠶豆發(fā)芽過程中蛋白變化

2.2 蠶豆發(fā)芽過程中氨基酸的變化

由表1可知，蠶豆發(fā)芽后氨基酸含量有一定的提升，隨著蠶豆發(fā)芽天數(shù)的增加，氨基酸總量呈增加趨勢，在發(fā)芽第9天時，氨基酸的總含量達到最大，為29.16 g·100g-1，比發(fā)芽0 d的蠶豆氨基酸含量高11.30%，其中天門冬氨酸的變化最為顯著，在發(fā)芽9 d時達到最大值，為5.39 g·100g-1，比發(fā)芽0 d時的含量高76.14%。隨著蠶豆發(fā)芽天數(shù)的增加，大部分氨基酸的含量都呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，胱氨酸和組氨酸在蠶豆發(fā)芽過程中變化較小。必需氨基酸總量占氨基酸總量(essential amino acid/total amino acids, ΣEAA/ΣAA)的比例隨著蠶豆發(fā)芽天數(shù)的增加整體呈下降趨勢，鮮味氨基酸總量占氨基酸總量(delicious amino acid/total amino acids, ΣDAA/ΣAA)的比例隨蠶豆發(fā)芽天數(shù)的增加，呈上升趨勢。由表2和表3可知，氨基酸評分(amino acid score, AAS)中除Met+Cys外，其他氨基酸的得分均大于或接近1，說明蠶豆蛋白的必需氨基酸含量豐富，營養(yǎng)價值較高，隨著蠶豆發(fā)芽天數(shù)的增加，氨基酸AAS和化學評分(chemical score, CS)均有下降的趨勢。綜上，隨著蠶豆發(fā)芽天數(shù)的增加，蠶豆氨基酸總量升高，必需氨基酸的比例下降，鮮味氨基酸的比例上升。

表1 蠶豆發(fā)芽過程中氨基酸的含量

表2 發(fā)芽蠶豆的氨基酸組成評價(AAS)

表3 發(fā)芽蠶豆的氨基酸組成評價(CS)

2.3 蠶豆發(fā)芽過程中蠶豆蛋白抗氧化能力的變化

2.3.1 蠶豆蛋白的DPPH自由基清除能力 由圖4可知，蠶豆蛋白的DPPH自由基清除能力較弱，蠶豆蛋白濃度在0.5～2.5 mg·mL-1時，DPPH自由基清除能力均低于10%；在蠶豆發(fā)芽過程中，蠶豆蛋白的DPPH自由基清除能力有一定提升，在蠶豆發(fā)芽9 d時，蠶豆蛋白的DPPH自由基清除能力達到最大。

注：圖中每個濃度內(nèi)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.3.2 蠶豆蛋白的ABTS自由基清除能力 由圖5可知，蠶豆蛋白對ABTS自由基具有一定的清除能力，蠶豆蛋白濃度在0.5～1.5 mg·mL-1時，不同蠶豆發(fā)芽時間的蛋白ABTS自由基清除能力隨蛋白濃度增加而增強，其中蠶豆發(fā)芽9 d的蠶豆蛋白在0.5～1.0 mg·mL-1濃度下，其ABTS自由基清除能力均比其他發(fā)芽時間的強；在蠶豆蛋白濃度為1.5 mg·mL-1時，蠶豆發(fā)芽9、10和11 d的蛋白ABTS自由基清除能力均達到最大值，清除率為99.53%；蠶豆蛋白濃度在2.0～2.5 mg·mL-1時，不同蠶豆發(fā)芽時間的蠶豆蛋白的ABTS自由基清除能力基本保持穩(wěn)定，均達到最大值。

圖5 蠶豆蛋白的ABTS自由基清除能力

3 討論

3.1 蠶豆發(fā)芽過程中氨基酸、蛋白質(zhì)含量的變化規(guī)律

蠶豆發(fā)芽后種子內(nèi)儲存的某些物質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)化或含量提升，其中發(fā)芽后蠶豆蛋白質(zhì)含量顯著增加[38]。本研究結果表明，蠶豆發(fā)芽后，蠶豆蛋白和氨基酸含量有顯著提升，主要是由于蠶豆發(fā)芽過程中，種子從休眠的靜態(tài)轉(zhuǎn)變成生理活動頻繁的動態(tài)過程，種子內(nèi)的酶活性增強，蠶豆蛋白、氨基酸含量增多，蠶豆蛋白由大分子量向小分子量轉(zhuǎn)變[38]。另外，試驗還發(fā)現(xiàn)蠶豆發(fā)芽過程中鮮味氨基酸天門冬氨酸的增加最為顯著，說明發(fā)芽能增加蠶豆蛋白的鮮味，該結果與安廣杰等[39]在大豆發(fā)芽過程中得出的結果一致。發(fā)芽過程中必需氨基酸含量的增加程度較小，必需氨基酸的AAS和CS評分下降，這可能是由于蠶豆發(fā)芽過程中蛋白質(zhì)發(fā)生水解加上氨基酸轉(zhuǎn)化形成的結果。

發(fā)芽過程是蠶豆蛋白不斷分解和合成的過程，在發(fā)芽前期，部分高分子儲藏蛋白分解轉(zhuǎn)化成分子量較小的蛋白、肽和氨基酸[40]，使得蠶豆蛋白、氨基酸含量在前 9 d 有增加的趨勢，到蠶豆發(fā)芽后期，蠶豆儲藏蛋白減少，儲藏蛋白的分解轉(zhuǎn)化量亦減少，加上發(fā)芽對營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，使得發(fā)芽10 d后蠶豆蛋白和氨基酸含量有一定的下降。

本研究中，SDS-PAGE試驗共檢測出17條條帶，相對分子量為17～116 kDa，這些蛋白的亞基與Warsame等[41]和劉珍珍等[42]的研究結果基本一致。35 kDa以上的蛋白條帶變淡，25～35 kDa和14.4～18.4 kDa之間的蛋白條帶變深，可見在蠶豆發(fā)芽過程中球蛋白含量減少，清蛋白含量增多，其中11S球蛋白的酸性亞基和7S球蛋白的亞基降解較快，11S球蛋白的堿性亞基降解較慢，這與安廣杰等[39]在大豆發(fā)芽過程中得出的結果一致。蠶豆發(fā)芽過程中大分子量球蛋白含量減少，部分轉(zhuǎn)化為多個小分子量的清蛋白，清蛋白含量增多，提高了蛋白的生物活性和營養(yǎng)價值。

3.2 蠶豆發(fā)芽過程中蠶豆蛋白抗氧化能力的變化規(guī)律

本研究提取的蠶豆蛋白具有較強的ABTS自由基清除能力，這可能是由于蠶豆蛋白中所含有的抗氧化肽組分具有良好的抗氧化作用。許慶鵬等[43]研究表明，豌豆蛋白肽具有較好的抗氧化作用，且豌豆蛋白肽分子質(zhì)量越小的肽段抗氧化能力越好。崔素萍等[44]研究表明，蕓豆蛋白抗氧化肽組分在大豆油氧化中具有一定的抗氧化作用，且分子量越低，抗氧化作用越強。大豆蛋白抗氧化肽組分、馬鈴薯蛋白抗氧化肽組分、乳清蛋白抗氧化肽組分等都被發(fā)現(xiàn)具有較好的抗氧化作用[44]。但蠶豆蛋白中起到抗氧化作用的抗氧化肽組分還有待進一步提取分析。

本研究發(fā)現(xiàn)，蠶豆蛋白對DPPH自由基的清除能力很弱，而對ABTS自由基有較強的清除能力，該結果與秦高一鑫等[45]在豌豆蛋白抗氧化試驗中得出的結果一致，這可能是由于ABTS自由基比DPPH自由基更容易清除。發(fā)芽后蠶豆蛋白的ABTS自由基清除能力有一定提升，主要是因為蠶豆發(fā)芽后蛋白質(zhì)含量提高，且小分子量的肽鏈占比增大，蛋白功效活性增強。

4 結論

本研究結果表明，蠶豆發(fā)芽可以促進蠶豆蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化，增加蠶豆蛋白質(zhì)、氨基酸含量，增強蠶豆蛋白的抗氧化能力，結果證實發(fā)芽可以改善豆類的營養(yǎng)成分，增強豆類的功效作用。本研究結果為發(fā)芽蠶豆的開發(fā)利用提供了參考依據(jù)，但此研究僅對發(fā)芽蠶豆蛋白的提取工藝進行了初步探討，后續(xù)可通過對蠶豆發(fā)芽、蛋白提取等過程進行更深入的研究，建立一套適宜生產(chǎn)應用的發(fā)芽蠶豆蛋白提取工藝。