閆 佼 任新宇 魏宏宇 彭帥英 程 新,*

(1 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用微生物研究所，江西 南昌 330045；2 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045)

硒(selenium)是人體生長必需的微量元素[1]，具有增強機體免疫活性[2]、抗衰老、抗腫瘤、抗氧化[3]等作用，對人體健康起到不可替代的作用。同時，硒可以促進植物生長發(fā)育[4]，提高植物中谷胱甘肽過氧化物酶的活性，防止膜脂質(zhì)過氧化，保護生物膜不受損傷[5]，對植物生長繁殖具有重要的生物學(xué)意義。然而自然界中存在的無機硒和有機硒具有較高的毒性[6]，難以直接被動植物利用。因此如何對其進行改造以提高硒的生物利用率以及安全性已成為學(xué)術(shù)界研究的熱點之一[7]，其中將硒元素制備成納米硒已被證實是目前最為有效的改造方法之一[8]。

納米硒的制備方法主要包括物理法、載體模板法和超聲化學(xué)法[9]。物理方法制備得到的納米硒可以通過調(diào)節(jié)激光參數(shù)來控制粒徑大小，且不易受到化學(xué)試劑的污染，但因其制備效率和產(chǎn)量較低，未被廣泛應(yīng)用；化學(xué)法通常是通過亞硒酸鈉與還原劑發(fā)生氧化還原反應(yīng)制備納米硒，但生成的納米硒產(chǎn)物不穩(wěn)定，且生物活性相對較低；而載體模板法是利用活潑基團來吸附包裹納米硒粒子，防止納米硒顆粒的聚沉，是目前常用的制備技術(shù)，蛋白質(zhì)[10]、聚合物[11]、多糖[12]等均可作為載體模板來制備納米硒。多糖作為一類生物大分子，因其所具有的特殊結(jié)構(gòu)可以在構(gòu)建納米硒體系中發(fā)揮很好的懸浮、乳化以及穩(wěn)定作用[13]，降低納米硒顆粒表面的自由能，有效防止納米硒顆粒的團聚，改善納米硒的生物相容性，可以作為制備納米硒復(fù)合物的最佳原料。

菌糠(spent mushroom substrate, SMS)是食用菌產(chǎn)業(yè)的廢棄物[14]，含有大量多糖成分，但其開發(fā)利用一直未得到很好的解決，且有關(guān)利用菌糠多糖(polysaccharide from spent mushroom substrate)修飾納米硒的報道尚未涉及過多。茶樹菇(Agrocybecylindracea)是江西代表性食用菌品種，年產(chǎn)量達130萬噸以上。茶樹菇菌糠中含有糖類、有機酸類、生物活性酶等代謝產(chǎn)物，具有極高的利用潛力。本研究以茶樹菇菌糠多糖為原料，探究菌糠多糖-納米硒復(fù)合物的制備工藝，并通過形態(tài)學(xué)指標測定、抗氧化活性測定等手段，探索菌糠多糖-納米硒復(fù)合物對水稻的促生效果，以期為利用菌糠多糖作為模板制備納米硒復(fù)合物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗于2021年7月在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)實訓(xùn)基地內(nèi)進行。茶樹菇菌糠由撫州市黎川縣江西利康綠色農(nóng)業(yè)有限公司提供；水稻種子為五優(yōu)308，由湖南隆平種業(yè)有限公司提供。選取顆粒飽滿的水稻種子，浸泡于5%的次氯酸鈉溶液中消毒15 min，用蒸餾水沖洗7～10次，直至無次氯酸鈉氣味。放置于28℃培養(yǎng)箱中，用蒸餾水浸泡24 h，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 茶樹菇菌糠多糖的提取 茶樹菇菌糠多糖的提取工藝參照趙澤文等[15]的方法進行。

1.2.2 菌糠多糖-納米硒復(fù)合物的制備 吸取20 mL 0.1 mol·L-1的Vc溶液于錐形瓶中，添加10 mg·mL-1的菌糠多糖溶液，再加入10 mL 0.05 mol·L-1的亞硒酸鈉(Na2SeO3)溶液，搖勻后置于恒溫水浴鍋中加熱。通過改變茶樹菇菌糠多糖的用量、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、抗壞血酸和亞硒酸鈉的配比研究工藝參數(shù)對菌糠多糖-納米硒復(fù)合物合成的影響(圖1)。并根據(jù)膠體溶液的雙波長比色法[16]，選用A410/A490值表征菌糠多糖-納米硒復(fù)合物的粒徑大小。

圖1 不同溶液的紫外吸收光譜

1.2.3 菌糠多糖-納米硒復(fù)合物體外抗氧化活性的測定 以Vc、亞硒酸鈉、茶樹菇菌糠多糖為陽性對照，分別測定菌糠多糖-納米硒復(fù)合物的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical, DPPH)自由基清除率[17]、羥基自由基清除率[18]、超氧陰離子自由基清除率以及還原力[19]。

1.2.4 水稻種子萌發(fā)及形態(tài)指標的測定 將用5%次氯酸鈉浸泡消毒過的種子平鋪在墊有兩層濾紙的平板中，每個平板放30粒種子，分別用不同濃度的茶樹菇菌糠多糖、亞硒酸鈉和菌糠多糖-納米硒復(fù)合物溶液處理培養(yǎng)，設(shè)置每種溶液處理的濃度分別為0、5、10、15、20 mg·mL-1，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。每2 d更換一次處理液，28℃培養(yǎng)8 d備用。在水稻種子萌發(fā)至第3天時測定發(fā)芽勢，第8天時測定種子發(fā)芽率、根長和芽長。

1.2.5 不同噴施方式對水稻幼苗生長的影響 將消毒后的種子平鋪在墊有兩層紗布的托盤中，28℃培養(yǎng)箱黑暗催芽48 h，保持紗布濕潤。將長勢一致的幼苗移至Hoagland營養(yǎng)液[20]中，以未添加菌糠多糖-納米硒復(fù)合物為對照(CK)，設(shè)置根部添加(2、20 mg·L-1)和葉面噴施(2、20、100 mg·L-1)兩種添加方式處理，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。當(dāng)水稻生長至三葉一心時，每2 d添加一次處理，當(dāng)添加處理后水稻生長至第3和第10天時取樣，用于測定生理指標。可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定[21]，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250法測定[22]，總黃酮含量采用分光光度法測定[23]，葉綠素含量采用分光光度法測定[24]，總酚含量采用Folin-Ciocalteu法測定[23]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用Origin 2019軟件進行作圖，圖表中數(shù)值為平均值±標準差。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)溫度及反應(yīng)時間對菌糠多糖-納米硒復(fù)合物制備效果的影響

由圖2可知，在不同的反應(yīng)溫度下，菌糠多糖-納米硒復(fù)合物的A410/A490值均隨時間的延長整體呈先上升后下降的趨勢，并在反應(yīng)4 h達到最大值，其中以50℃時的比值最大，達到2.05左右。由此可知，當(dāng)反應(yīng)溫度為50℃、反應(yīng)時間為4 h時制備的菌糠多糖-納米硒復(fù)合物顆粒粒徑最小、最均勻穩(wěn)定。

圖2 反應(yīng)溫度及反應(yīng)時間對菌糠多糖-納米硒復(fù)合物制備效果的影響

2.2 多糖占比以及Vc與亞硒酸鈉配比對菌糠多糖-納米硒復(fù)合物的影響

由圖3-A可知，當(dāng)Vc與亞硒酸鈉的配比為2∶1和4∶1時，A410/A490值分別為1.45和1.40。有研究表明Vc在制備納米硒的體系中可提供還原體系，使反應(yīng)不斷向生成菌糠多糖-納米硒復(fù)合物的方向進行，有助于納米硒的生成[24]，因此選擇4∶1為最佳反應(yīng)配比。由圖3-B可知，菌糠多糖-納米硒復(fù)合物的A410/A490值隨著多糖占比的增加呈先上升后下降趨勢，當(dāng)菌糠多糖的體積分數(shù)為10%時，A410/A490值最大，為2.06，說明此時制備的菌糠多糖-納米硒復(fù)合物產(chǎn)物均一穩(wěn)定。

圖3 多糖占比以及Vc與亞硒酸鈉配比對菌糠多糖-納米硒復(fù)合物的影響

2.3 菌糠多糖-納米硒復(fù)合物的抗氧化活性

由圖4可知，在試驗范圍內(nèi)，菌糠多糖-納米硒復(fù)合物的抗氧化活性均隨濃度的增加呈現(xiàn)量效依賴關(guān)系，且明顯高于同濃度下的菌糠多糖和無機硒。說明經(jīng)過硒化后的菌糠多糖-納米硒復(fù)合物對自由基的清除率有了明顯提升。

圖4 菌糠多糖-納米硒復(fù)合物的體外抗氧化活性

采用SPSS軟件分析菌糠多糖-納米硒復(fù)合物及菌糠多糖自由基清除率的半數(shù)抑制率(median inhibition concentration，IC50)，結(jié)果如表1所示。菌糠多糖-納米硒復(fù)合物清除3種自由基的IC50值相比茶樹菇菌糠多糖均降低，說明菌糠多糖-納米硒復(fù)合物清除自由基的能力得到了明顯增強。

表1 納米硒復(fù)合物自由基清除的IC50值

2.4 菌糠多糖-納米硒復(fù)合物對水稻種子萌發(fā)的影響

由圖5可知，與CK相比，菌糠多糖-納米硒復(fù)合物顯著提高了水稻種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢，且其對發(fā)芽勢的促進效果明顯高于同濃度的菌糠多糖。菌糠多糖較CK顯著提高了水稻種子的發(fā)芽率，但在相對較高濃度下，對水稻種子的發(fā)芽勢有一定的抑制效果。菌糠多糖-納米硒復(fù)合物可顯著提高水稻種子的根長，且濃度越高，菌糠多糖-納米硒復(fù)合物對根長的促進作用越明顯。當(dāng)菌糠多糖-納米硒復(fù)合物濃度為5、10、15、20 mg·mL-1時，水稻種子根長分別較CK增加了224.06%、309.77%、406.02%、482.71%，而芽長并未隨菌糠多糖-納米硒復(fù)合物的加入而產(chǎn)生明顯變化。菌糠多糖也不同程度地促進了水稻種子的根長，在濃度為5、10、15、20 mg·mL-1時，水稻種子根長分別較CK增加了45.11%、51.88%、33.08%、42.11%，但其促進效果顯著低于菌糠多糖-納米硒復(fù)合物。同時，菌糠多糖對水稻芽長表現(xiàn)出明顯的抑制作用，與CK相比，芽長減少了76.68%、78.54%、77.40%、77.25%。從圖6也可看出不同處理條件下水稻種子的萌發(fā)情況有明顯差異。

注：不同小寫字母表示同一濃度不同處理間差異顯著(P<0.05)。

圖6 不同處理條件下水稻種子的根長、芽長變化

2.5 不同噴施方式對菌糠多糖-納米硒復(fù)合物促進水稻幼苗生長的效果

2.5.1 不同噴施方式對水稻幼苗根莖葉發(fā)育的影響 由表2可知，葉面噴施菌糠多糖-納米硒復(fù)合物對水稻幼苗根和莖的影響較大。與CK相比，葉面噴施菌糠多糖-納米硒復(fù)合物濃度為20 mg·L-1時，第3天水稻幼苗的根長和莖長分別增加了18.09%、19.10%，第10天水稻幼苗的根長和莖長分別增加了32.28%、26.36%，說明葉面噴施的處理方式對水稻幼苗的生長有明顯促進作用。根部添加菌糠多糖-納米硒雖然在一定程度上促進了水稻幼苗的生長，但促生效果低于葉面噴施處理。

表2 不同噴施方式對水稻幼苗根莖葉的影響

2.5.2 不同添加方式對水稻幼苗可溶性糖、可溶性蛋白及葉綠素含量的影響 由圖7可知，與CK相比，葉面噴施菌糠多糖-納米硒復(fù)合物明顯提高了水稻幼苗的可溶性蛋白、可溶性糖及葉綠素含量，并且其含量整體隨濃度的增大而呈先上升后下降的趨勢。根部添加2 mg·mL-1菌糠多糖-納米硒復(fù)合物對第3天水稻根部可溶性蛋白含量的影響較大(圖7-A)。在第10天，葉面噴施菌糠多糖-納米硒復(fù)合物濃度為20 mg·L-1時，水稻幼苗的根部和葉片可溶性蛋白含量最高，分別為1 450和2 850 μg·g-1，比對照分別提高了72.62%和27.80%(圖7-B)。第3天時，根部添加2 mg·L-1菌糠多糖-納米硒復(fù)合物使根中可溶性糖含量較CK顯著增加，而當(dāng)處理至第10天時，葉面噴施菌糠多糖-納米硒復(fù)合物對水稻葉面可溶性糖的影響較明顯，當(dāng)復(fù)合物施用濃度為20 mg·L-1時，葉片中可溶性糖含量相比CK增加了180.87%(圖7-D)。在處理至第10天時，葉面噴施20 mg·L-1菌糠多糖-納米硒復(fù)合物的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量分別比CK顯著增加了67%、58%、21%(圖7-F)。綜上，根部添加菌糠多糖-納米硒復(fù)合物對水稻幼苗根部的影響明顯高于葉面，提高了水稻幼苗的可溶性糖、可溶性蛋白含量，但隨著水稻生長周期的增加，根部添加處理對水稻生長的促進速率明顯低于葉面噴施的促生速率。

注：圖中不同小寫字母表示同一部位及類型間差異顯著(P<0.05)。下同。

2.5.3 不同添加方式對水稻幼苗中總酚和總黃酮含量的影響 由圖8可知，葉面噴施菌糠多糖-納米硒復(fù)合物濃度為100 mg·L-1時，第3和第10天的總酚與總黃酮含量均顯著高于CK，其中第10天水稻根部和葉面的總酚含量相比CK分別增加了311%、27.8%，總黃酮含量相比CK分別增加了300%、42.5%，且根部的提升效率高于葉面。根部添加菌糠多糖-納米硒復(fù)合物雖然在一定程度上增加了水稻幼苗根部和葉面的總酚和總黃酮含量，但相比葉面噴施處理的促進效果略低。并且隨著水稻幼苗生長天數(shù)的增加，總酚和總黃酮含量出現(xiàn)明顯累積現(xiàn)象。

圖8 不同添加方式對水稻幼苗總酚和總黃酮含量的影響

2.5.4 不同添加方式對水稻幼苗中硒含量的影響 由圖9可知，當(dāng)葉面噴施菌糠多糖-納米硒復(fù)合物濃度為20 mg·L-1時，第3和第10天的水稻幼苗葉面硒含量均高于根部和莖部，并且顯著高于CK，其中第10天的水稻幼苗葉面硒含量為12.7 mg·g-1，是CK的25倍。雖然根部添加處理也促進了水稻幼苗的硒含量，但其明顯低于葉面噴施處理。

圖9 不同添加方式對水稻幼苗的硒含量的影響

3 討論

近年來，以多糖為模板制備納米硒日益受到關(guān)注。Wang等[25]采用化學(xué)還原法制備了羊棲菜多糖納米硒，結(jié)果表明以多糖螯合制備的納米硒對羥基自由基和DPPH自由基的清除能力均強于裸納米硒，但低于羊棲菜多糖。Lian等[26]研究發(fā)現(xiàn)以甘草多糖硒化得到的納米硒抗氧化能力稍強于甘草多糖，比小分子抗氧化劑更能有效地抵抗自由基引起的損傷，顯示出其作為抗氧化劑的潛力。本研究以菌糠多糖為模板所制備的納米硒復(fù)合物對自由基的清除率明顯高于茶樹菇菌糠多糖和無機硒，而進一步的水稻栽培試驗也證實，菌糠多糖-納米硒復(fù)合物的促生效果明顯高于單一的菌糠多糖，說明硒化多糖的生物學(xué)活性提升可能與多糖的種類與結(jié)構(gòu)有關(guān)，但需要進一步研究證明。

有關(guān)納米硒在農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用已被廣泛報道。研究表明，納米硒在一定程度上可以促進作物生長，提高作物的品質(zhì)和抗逆性{26]。Domokos-Szabolcsy等[27]研究發(fā)現(xiàn)較高濃度納米硒可以顯著促進煙草的根系生長，在265～530 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，刺激了根的伸長，使得根系分布更加廣泛和密集，而硒酸鹽在任何濃度下對煙草的生長均有抑制作用，抑制了根的再生。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，菌糠多糖-納米硒復(fù)合物在較高濃度下對水稻生長起促進作用，較低濃度下則抑制水稻的生長，適宜濃度的納米硒可以提高水稻對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，進而促進水稻生長。Li等[28]研究發(fā)現(xiàn)將納米硒噴施在辣椒葉片上，有助于提高辣椒素、類黃酮和總酚的合成，并且納米硒處理可促進植物激素合成基因的表達，提高茉莉酸、脫落酸和水楊酸水平，降低丙二醛和羥基自由基水平，從而促進次生代謝產(chǎn)物和抗氧化劑的積累。本研究發(fā)現(xiàn)，菌糠多糖-納米硒復(fù)合物添加提高了水稻幼苗中總黃酮和總酚的含量，推測可能是由于納米硒具有較強的抗氧化能力，刺激水稻幼苗產(chǎn)生多種抗氧化物質(zhì)，進而提高了水稻幼苗的抗氧化能力。肖賢等[29]通過水培試驗研究了不同濃度納米硒對豌豆芽苗生長品質(zhì)、抗氧化活性及硒含量的影響，結(jié)果表明施用納米硒后豌豆芽苗的生物量明顯提高，光合作用效率和抗氧化活性顯著提高，同時還增加了豌豆芽苗中的硒含量。當(dāng)植物生長發(fā)育受到環(huán)境脅迫時，納米硒可能會干擾植物的光合作用，打開葉面氣孔，促進蒸騰作用，增加光合速率，從而調(diào)節(jié)逆境中植物的生長發(fā)育。在本試驗結(jié)果中，葉面噴施菌糠多糖-納米硒顯著提高了水稻幼苗的硒含量。一般而言，硒酸鹽主要是通過主動吸收被植物利用，而亞硒酸鹽主要通過磷轉(zhuǎn)運蛋白。Wang等[30]通過水培試驗研究了納米硒在水稻中的吸收轉(zhuǎn)化和亞細胞分布情況，并與亞硒酸鹽和硒酸鹽進行了比較，結(jié)果表明水稻根系對納米硒的吸收速率大約是硒酸鹽或亞硒酸鹽的1.7倍，經(jīng)過納米硒和亞硒酸鹽處理的水稻植株吸收的硒大部分分布在細胞壁上，被水稻植株吸收后迅速同化為有機形式。本研究發(fā)現(xiàn)，菌糠多糖-納米硒復(fù)合物促進了水稻種子的萌發(fā)，亞硒酸鈉則明顯抑制了水稻種子的萌發(fā)，說明水稻種子對納米硒的吸收速率強于無機態(tài)的亞硒酸鹽。

研究發(fā)現(xiàn)土壤添加硒肥后，只有少部分被農(nóng)作物吸收利用，大部分則會被土壤吸附固定，造成農(nóng)作物硒利用率低的現(xiàn)象，而葉面噴施硒肥提高了硒的吸收轉(zhuǎn)化率，顯著提高了水稻的富硒量和生物活性[31]。Badawy等[32]認為葉面噴施納米硒是提高水稻耐鹽性和產(chǎn)量的有效途徑，在水稻的不同生長階段進行葉面噴施可提高根系生物量，維持細胞適當(dāng)?shù)臐B透狀態(tài)，并提高水稻的葉綠素含量。本研究發(fā)現(xiàn)，葉面噴施菌糠多糖-納米硒復(fù)合物提高水稻幼苗的葉綠素含量，原因在于適量納米硒的使用可以增加植物的氣孔導(dǎo)度，提高水稻幼苗的光合速率，促進水稻葉綠素的合成，進而提高水稻幼苗中葉綠素的含量。Zahedi等[33]研究發(fā)現(xiàn)，葉面噴施納米硒顆粒減輕了干旱脅迫對石榴樹葉片和果實的不利影響，增強了葉片光合能力，提高了生物量。本試驗對水稻葉面噴施菌糠多糖-納米硒復(fù)合物也明顯促進了水稻幼苗的生長，與前人研究結(jié)果[34]一致。菌糠多糖-納米硒復(fù)合物促進水稻幼苗生長的原因在于，納米硒的使用促進了水稻幼苗對營養(yǎng)物質(zhì)和微量元素的吸收和轉(zhuǎn)運，同時促進水稻的生理代謝，進而提高了水稻的根系活力。綜上，適宜濃度的納米硒對農(nóng)作物的生長具有促進作用，提高了農(nóng)作物的生理代謝、元素吸收以及富硒水平。原因可能在于低濃度的硒能夠上調(diào)過氧化酶和還原酶等抗氧化酶的活性，從而增強植物對不利因素的抵抗能力。

不同來源的食用菌菌糠的成分和理化性質(zhì)差異較大，因此利用難度大，利用率偏低[35]，并且菌糠原料本身極易存在或產(chǎn)生相關(guān)毒素[36]，存在安全隱患，因此如何加工利用菌糠是目前亟待解決的問題，其中開發(fā)菌糠中的活性成分成為行之有效的一種方法。本研究結(jié)果顯示菌糠中的多糖對農(nóng)作物生長發(fā)育有較大影響，以菌糠多糖為原料制備的菌糠多糖-納米硒復(fù)合物對水稻有較好促生效果。該研究結(jié)果在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景，可為菌糠的精深加工提供新思路。

4 結(jié)論

本研究以茶樹菇菌糠多糖為模板還原亞硒酸鈉，制備得到了菌糠多糖-納米硒復(fù)合物，結(jié)果表明，當(dāng)反應(yīng)溫度為50℃、反應(yīng)時間為4 h、Vc與亞硒酸鈉的配比為4∶1、多糖體積分數(shù)為10%時，可以獲得顆粒粒徑較小、均一穩(wěn)定的產(chǎn)物顆粒。與菌糠多糖和亞硒酸鈉相比，菌糠多糖-納米硒復(fù)合物表現(xiàn)出較強的體外抗氧化活性。此外，相比根部添加處理，葉面噴施菌糠多糖-納米硒復(fù)合物顯著促進了水稻幼苗生長。