董 燁 張益奇,2,3 張曉頔 胡學(xué)佳 戴志遠(yuǎn),2,3,*

(1 浙江工商大學(xué)海洋食品研究院，浙江 杭州 310035；2 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310035；3 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116000)

鳙魚(Aristichthysnobilis)是我國淡水魚養(yǎng)殖的主要品種之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2019年我國鳙魚產(chǎn)量達(dá)310.1萬噸[1]。在魚頭、魚片和魚丸等產(chǎn)品的加工過程中，不可避免地產(chǎn)生了大量的魚骨、內(nèi)臟、魚鱗和魚皮等副產(chǎn)物。合理利用這些副產(chǎn)物可以減少資源浪費(fèi)和環(huán)境污染，促進(jìn)漁業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。酶解是一種有效利用蛋白質(zhì)的途徑，蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后有助于改善其物理、化學(xué)性質(zhì)、功能和營養(yǎng)特性，同時(shí)也是制備生物活性肽的有效方法。魚皮中含有豐富的膠原蛋白，經(jīng)蛋白酶水解后可以獲得具有抗氧化和降血壓活性的生物活性肽[2-3]。然而膠原蛋白剛性的三螺旋結(jié)構(gòu)，對商品蛋白酶具有較強(qiáng)的抵抗力，使得酶解效率和底物轉(zhuǎn)化率低[4]，因此通常需要在酶解前對膠原蛋白進(jìn)行預(yù)處理。傳統(tǒng)的酸堿處理法雖然可以破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，但過程繁瑣，處理時(shí)間長，且會造成環(huán)境污染[5]。微波作為一種電磁輻射能，可以通過熱波動改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)[6-7]，柔化膠原蛋白剛性的三螺旋結(jié)構(gòu)，增加與酶的接觸機(jī)會，暴露更多的蛋白質(zhì)酶切割位點(diǎn)，提高酶解效率。

美拉德反應(yīng)，又稱非酶褐變[8]，是指在含有游離氨基的氨基酸、肽或蛋白質(zhì)與羰基化合物之間發(fā)生的一系列復(fù)雜化學(xué)反應(yīng)，會產(chǎn)生一系列具有特殊風(fēng)味與色澤的物質(zhì)，能夠改善食品的不良味道[9]。蛋白酶水解法制備的水解液通常具有一定的苦腥味，限制了其在食品行業(yè)中的廣泛應(yīng)用。因此，可通過美拉德反應(yīng)對其進(jìn)行風(fēng)味改良[10]。Yu等[11]將豆粕水解液進(jìn)行美拉德反應(yīng)后獲得了具有低苦味高鮮味的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(Maillard reaction products, MRPs)。此外，美拉德反應(yīng)對在糖-蛋白質(zhì)水解物系統(tǒng)中的最終產(chǎn)物抗氧化能力的提高有積極作用[12-13]。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在改善水解物風(fēng)味的同時(shí)可提高其功能特性[14]。然而，目前對鳙魚皮水解物美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性和揮發(fā)性化合物的研究鮮見報(bào)道。因此，本研究通過微波技術(shù)預(yù)處理魚皮，酶解法水解魚皮膠原蛋白，研究美拉德反應(yīng)條件對魚皮水解物(fish skins hydrolysates，F(xiàn)SH)抗氧化活性和揮發(fā)性成分的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鳙魚皮，杭州千島湖；堿性蛋白酶，上海源葉生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、木糖、核糖，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈(色譜純)，德國Meker公司。其余試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

e2695高效液相色譜，美國Waters公司；SPECTRA MAX190酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司；EM-F2116 MS1微波爐，合肥榮事達(dá)三洋電器股份有限公司；MLS-3781 L高壓滅菌鍋，日本Panasonic公司；FE20 pH計(jì)，上海梅特勒儀器有限公司；50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷涂層萃取頭，美國Supelco公司；Trace GC Ultra氣相色譜-DSQ II質(zhì)譜聯(lián)用儀、紫外-可見分光光度計(jì)、Fresco 21冷凍高速離心機(jī)，美國Thermo Fisher公司；DGG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 微波預(yù)處理 將新鮮魚皮浸泡于0.1 mol·L-1NaOH溶液中除去雜蛋白后，流水沖至中性，40℃烘干，以料液比1∶20(m∶v)配制成溶液，于700 W微波處理15 min后，凍干，-18℃儲存，備用。

1.3.2 水解物的制備 取未處理及微波預(yù)處理魚皮，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的溶液，加入2%堿性蛋白酶，設(shè)置酶解溫度50℃，溶液pH值8，酶解3 h后，于沸水浴中滅酶10 min，8 000 r·min-1離心15 min，得到魚皮酶解物上清液，凍干，-18℃儲存，備用。

1.3.3 水解度的計(jì)算 采用pH-stat法[14]，根據(jù)公式計(jì)算產(chǎn)物的水解度：

水解度 =B×Nb×(1/Mp)×(1/α)×

(1/htot)×100%

式中，B為消耗NaOH體積, mL;Nb為NaOH濃度, mol·L-1; α為α氨基的解離度;Mp為底物中蛋白質(zhì)總量, g;htot為底物中蛋白質(zhì)肽鍵總數(shù), mmol·g-1。

1.3.4 水解物美拉德反應(yīng) 選取葡萄糖、木糖和核糖作為參與美拉德反應(yīng)的糖類，糖比水解物為2∶1(m/m)、pH值7.0，溫度分別為90、100、121、135℃，反應(yīng)時(shí)間分別為15、35 min，以美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的褐變程度和抗氧化活性為指標(biāo)，確定美拉德反應(yīng)條件及合適的還原糖種類。

1.3.5 接枝度的測定 采用鄰苯二甲醛(O-phthalaldehyde, OPA)法測定產(chǎn)物的接枝度。參考Yang等[15]的方法，配制OPA試劑。取200 μL樣品加入4 mL OPA，37℃下反應(yīng)2 min后于340 nm處測定吸光度。根據(jù)公式計(jì)算產(chǎn)物的接枝度：

接枝度 =(A0-A1)/A0×100%

式中，A0為魚皮水解物的吸光度，A1為美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度。

1.3.6 美拉德反應(yīng)褐變程度測定 測定美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在294 nm(稀釋20倍)和420 nm波長處的吸光值，用于表示美拉德反應(yīng)的程度[16]。

1.3.7 抗氧化活性

1.3.7.1 總抗氧化活性測定 采用鐵離子還原法(ferric ion reducing antioxidant power, FRAP)測定總抗氧化活性。參考Benzie等[17]的方法配制三吡啶基三嗪(tripyridyltriazine, TPTZ)工作液(由醋酸鹽緩沖液、TPTZ溶液、FeCl3溶液組成，按10∶1∶1的比例混合，現(xiàn)配現(xiàn)用)。取濃度0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1FeSO4溶液各100 μL，分別加入3 mL TPTZ工作液，混勻后于37℃水浴條件下反應(yīng)10 min，測定593 nm波長處的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y=0.480 2X+0.332 1,R2=0.996 7)。取100 μL樣品溶液加入3 mL TPTZ工作液混勻按照上述條件反應(yīng)后，測定吸光度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得相同吸光度值處對應(yīng)的FeSO4濃度，F(xiàn)RAP值用對應(yīng)的FeSO4濃度(μmol·L-1)表示，用超純水代替樣品作為空白對照。FRAP值(μmol·L-1FeSO4)=樣品抗氧化能力-對照抗氧化能力。

1.3.7.2 1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical, DPPH)自由基清除能力測定[18]將1 mL DPPH溶液(0.1 mmol·L-1)與1 mL樣品混合，避光靜置20 min，在517 nm處測定該混合物的吸光度(A1)，1 mL樣品與1 mL 95%乙醇混合的吸光度(A2)，1 mL超純水與1 mL DPPH 混合的吸光度(A3)。按照公式計(jì)算DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率 =[1-(A1-A2)/A3]×100%

1.3.7.3 超氧陰離子自由基清除能力測定 采用鄰苯三酚自氧化法，參考Zhang等[19]的方法并稍作修改，取0.2 mL樣品與5.6 mL 50 mmol·L-1的Tric-HCl(pH值8.2)混合均勻，25℃保溫10 min，加入0.2 mL保溫于25℃的鄰苯三酚溶液(3 mmol·L-1，用10 mmol·L-1HCl配制)，混勻，于325 nm波長下每隔30 s測定吸光度值，記錄5 min內(nèi)的吸光度值變化，計(jì)算相應(yīng)斜率，超純水做對照，以10 mmol·L-1HCl代替鄰苯三酚調(diào)零。按照公式計(jì)算超氧陰離子自由基清除率:

超氧陰離子自由基清除率 =(K0-K)/K0×100%

式中，K0為對照組斜率；K為樣品斜率。

1.3.8 分子排阻色譜分析 采用Waters e2695高效液相系統(tǒng)分析樣品的分子量分布[20]，色譜柱為TSKgel G2000 SWxl(7.8 mm×300 mm，東曹)，檢測波長220 nm，洗脫液為45%乙腈-55%水-0.1%三氟乙酸，0.5 mL·min-1等度洗脫30 min，進(jìn)樣量10 μL。采用細(xì)胞色素C、碳酸酐酶、抑肽酶和馬尿酰-組氨酰-亮氨酸作標(biāo)準(zhǔn)品，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線lgM=-0.201 5t+6.852 7，R2=0.972 1，計(jì)算分子質(zhì)量分布情況。其中，M為分子質(zhì)量，t為保留時(shí)間。

1.3.9 紫外吸收光譜掃描 將美拉德產(chǎn)物樣品稀釋20倍，在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描。

1.3.10 揮發(fā)性成分分析[21]固相微萃取(solid phase microextraction, SPME)條件：將4 mL樣品置于頂空瓶中于50℃下保溫10 min。將活化好的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入頂空瓶，60℃吸附30 min，取出后插入GC進(jìn)樣口，250℃解吸3 min。氣相色譜(gas chromatography, GC)條件：TR-35 MS色譜柱(30 m× 0.25 mm，0.25 μm)；高純氦氣作為載氣；進(jìn)樣口溫度250℃，不分流進(jìn)樣。升溫程序：初始溫度35℃，保持3 min，以2.5℃·min-1升至70℃，8℃·min-1升至150℃，最后以20℃·min-1升至230℃，保持5 min。質(zhì)譜(mass spectrometry, MS)條件：檢測器溫度280℃；電子電離源，離子源溫度200℃；傳輸線溫度250℃；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍m/z 30～500。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)，Duncan多重比較法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)，Origin 2019軟件作圖。揮發(fā)性成分通過NIST2.0譜庫進(jìn)行定性分析，僅保留正反匹配度均大于800(最大值為1 000)的鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解度分析

由圖1可知，經(jīng)微波預(yù)處理后的魚皮水解物具有更高的水解度，達(dá)18.56%，是未處理組(12.07%)的1.54倍。微波預(yù)處理使部分蛋白質(zhì)降解為小分子物質(zhì)，更易溶出，同時(shí)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，更易被蛋白酶酶切，因此水解度增大。

圖1 魚皮水解物的水解度

2.2 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的褐變強(qiáng)度

褐變強(qiáng)度常用于評價(jià)美拉德反應(yīng)的程度。在美拉德反應(yīng)早期，羰基與氨基反應(yīng)，生成無色的中間產(chǎn)物，在294處有吸收峰；隨著美拉德反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行，美拉德反應(yīng)最終產(chǎn)物類黑精在420 nm處有最大吸收峰，吸光度值越大，褐變強(qiáng)度越高[22]。由圖2可知，單獨(dú)加熱魚皮水解物時(shí)，在294和420 nm處的吸收峰幾乎沒有變化。將葡萄糖、木糖和核糖分別與魚皮水解物加熱進(jìn)行美拉德反應(yīng)后，3種美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的紫外吸收隨加熱溫度的升高和時(shí)間的延長而增大。核糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在加熱溫度135℃、反應(yīng)時(shí)間35 min時(shí)表現(xiàn)出最高的紫外吸收，褐變強(qiáng)度最大，在294和420 nm處的吸光度值分別達(dá)1.76和1.65，是葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物組的1.64倍和3.17倍。上述結(jié)果表明，反應(yīng)時(shí)間和溫度，以及糖的種類均會影響美拉德反應(yīng)的速率和進(jìn)程。

圖2 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的褐變強(qiáng)度

2.3 接枝度分析

蛋白質(zhì)分子側(cè)鏈上的游離氨基脫水與還原糖的羰基縮合，游離態(tài)的氨基轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)合態(tài)，結(jié)合態(tài)氨基含量，即接枝度，可以反映美拉德反應(yīng)的程度[15]。接枝度越大，表明美拉德反應(yīng)程度越高。由圖3可知，3種糖美拉德反應(yīng)的接枝度均隨反應(yīng)時(shí)間的延長和反應(yīng)溫度的升高而增大，與褐變程度呈正相關(guān)。在反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度相同的條件下，核糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的接枝度最高，其次是木糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。135℃、35 min條件下，核糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物接枝度最大，為48.60%，木糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物次之，為44.33%，而葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物最小，為38.23%。核糖和木糖美拉德反應(yīng)程度較高，可能是因?yàn)楹颂呛湍咎亲鳛槲逄继?，開鏈程度大，反應(yīng)活性比六碳糖高。

圖3 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的接枝度

2.4 紫外光譜分析

為進(jìn)一步研究魚皮水解物在不同糖的美拉德反應(yīng)中的程度和結(jié)構(gòu)修飾，比較了在135℃、35 min條件下魚皮水解物以及3種糖的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在200～400 nm內(nèi)的紫外吸收光譜特性，結(jié)果如圖4所示。魚皮水解物和3種糖的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物均在218 nm左右出現(xiàn)吸收峰，這是蛋白質(zhì)和氨基酸的紫外吸收峰。美拉德反應(yīng)生成類黑精的過程中產(chǎn)生的生色團(tuán)結(jié)構(gòu)，如呋喃、吡喃和吡咯等化合物在275～278 nm處出現(xiàn)吸收峰。美拉德反應(yīng)過程中由于游離氨基的損失形成了席夫堿，在280 nm左右波長處出現(xiàn)吸收峰，這一過程是可逆的[23]，而產(chǎn)生的游離氨基可能是由于Heyns化合物在美拉德反應(yīng)后期不可逆的降解造成的。上述結(jié)果表明魚皮水解物在與糖的美拉德反應(yīng)中通過席夫堿的形成和Heyns化合物的降解進(jìn)行修飾[12]。

圖4 魚皮水解產(chǎn)物及美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的紫外吸收光譜

2.5 分子量分布

采用分子排阻色譜法測定未處理組、微波預(yù)處理組以及135℃、35 min條件下美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的分子量分布。由圖5、圖6可知，微波預(yù)處理的魚皮水解物分子量更小，未處理組分子量大于1 000 Da的達(dá)53.03%，而微波預(yù)處理組大于1 000 Da的僅為19.29%，說明微波預(yù)處理可促進(jìn)膠原蛋白大分子降解成小分子。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的分子量小于魚皮水解物，這是由于美拉德反應(yīng)過程中發(fā)生了熱降解，導(dǎo)致肽段斷裂，使分子量減小。3種糖的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中，核糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中分子量大于300 Da的最多，其次是木糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，這是因?yàn)槊览路磻?yīng)過程中肽的交聯(lián)和聚集產(chǎn)生了新的組分[24-25]。核糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物反應(yīng)程度最高，肽的交聯(lián)和聚集更多，與木糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物和葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物相比，核糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中新成分較多，因此分子量大于300 Da的成分最多，這一結(jié)果證明還原糖的美拉德反應(yīng)程度按葡萄糖、木糖和核糖的順序依次增大。

圖5 魚皮水解物相對分子質(zhì)量分布色譜圖

圖6 魚皮水解物及美拉德反應(yīng)產(chǎn)物相對分子質(zhì)量分布色譜圖

2.6 抗氧化活性

2.6.1 總抗氧化活性 采用鐵離子還原法(FRAP法)[26]測定了微波預(yù)處理魚皮水解物和其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的總抗氧化能力。通過FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度表示總抗氧化能力，濃度越大，表明總抗氧化能力越強(qiáng)。美拉德反應(yīng)條件為135℃、35 min時(shí)，核糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的總抗氧化能力最強(qiáng)，其次是木糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的總抗氧化能力最弱。隨著加熱溫度的升高，3種糖的總抗氧化能力增加(圖7)。核糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物總抗氧化能力的提高可能歸因于中間產(chǎn)物的快速生成，中間產(chǎn)物中的還原酮化合物可以通過提供氫原子而破壞自由基鏈[27]，從而提高抗氧化能力。

圖7 魚皮水解物及美拉德反應(yīng)產(chǎn)物總抗氧化活性

2.6.2 DPPH自由基清除能力 由圖8可知，魚皮水解物清除DPPH自由基的能力低于其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，隨著加熱溫度的升高和反應(yīng)時(shí)間的延長，3種糖的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對DPPH自由基的清除能力均增大，加熱溫度的升高和反應(yīng)時(shí)間的延長加速了美拉德反應(yīng)的進(jìn)程和焦糖化，因此褐變程度加深，同時(shí)發(fā)生了肽的降解和交聯(lián)[24]。反應(yīng)條件為135℃、35 min時(shí)，核糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的DPPH自由基清除活性最高，清除率達(dá)到96.53%，其次是木糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。核糖的反應(yīng)活性最高，相比于木糖和葡萄糖的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，核糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物形成最早，因此DPPH自由基清除能力最高。上述結(jié)果表明，糖的反應(yīng)活性是影響美拉德反應(yīng)產(chǎn)物清除DPPH自由基的主要因素之一，核糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對魚皮水解物的抗氧化能力具有促進(jìn)作用。

圖8 魚皮水解物及美拉德反應(yīng)產(chǎn)物DPPH自由基清除能力

2.6.3 超氧陰離子自由基清除能力 由圖9可知，魚皮水解物對超氧陰離子的清除活性為45.27%，單獨(dú)加熱時(shí)變化不明顯，而在美拉德反應(yīng)系統(tǒng)中，隨著加熱溫度的升高和反應(yīng)時(shí)間的延長，3種糖的清除活性增強(qiáng)。在135℃、35 min時(shí)核糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(88.07%)清除超氧陰離子自由基能力最強(qiáng)，其次為木糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(68.69%)和葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(63.22%)。這一結(jié)果與其他抗氧化活性測定結(jié)果一致，證實(shí)了核糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在抗氧化活性方面的高反應(yīng)性。

圖9 魚皮水解物及美拉德反應(yīng)產(chǎn)物超氧陰離子自由基清除能力

2.7 揮發(fā)性成分分析

采用SPME-GC-MS檢測了魚皮水解物以及135℃、35 min條件下3種糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的揮發(fā)性物質(zhì)，結(jié)果如表1所示?？偣茶b定出62種揮發(fā)性化合物，其中魚皮水解物中共檢測出19種揮發(fā)性化合物，其中47.4%的風(fēng)味物質(zhì)為醛類化合物，雜環(huán)類化合物僅2種。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中共檢測出50種揮發(fā)性化合物，包括3種酮類、13種醛類、11種烴類、3種酯類、1種醇類、5種酸類和14種雜環(huán)類。烴類的閾值較高，對產(chǎn)物的整體風(fēng)味影響不大。酸類、酚類和酯類相對含量較低，對產(chǎn)物的整體風(fēng)味影響不大。醛類通常是由氨基酸的Strecker降解反應(yīng)產(chǎn)生。由圖10可知，魚皮水解物中醛類物質(zhì)相對含量最高，達(dá)12.74%，其次是葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，達(dá)9.62%。其中，己醛具有果香味，是蔬菜和水果香氣的主要成分[27]，在魚皮水解物中含量較高，美拉德反應(yīng)后其相對含量減少；苯甲醛具有櫻桃及堅(jiān)果的香味[28]，在葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中較高。雜環(huán)化合物主要有呋喃類和吡嗪類，其中呋喃類物質(zhì)如呋喃甲醛、乙酰基呋喃等具有甜香和焦香味，是呋喃類雜環(huán)化合物的前體物質(zhì)[29]。吡嗪類具有烤香味，是美拉德反應(yīng)的主要產(chǎn)物之一；2,5-二甲基吡嗪具有爆米花香味，甲基吡嗪具有烤香和堅(jiān)果香[30]。在木糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物和核糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物體系中，呋喃甲醛是主要的揮發(fā)性成分。Han等[12]也發(fā)現(xiàn)呋喃甲醛是扇貝殼水解物-核糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中的主要揮發(fā)性成分。雜環(huán)類的氣味閾值較低，對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的整體感官風(fēng)味貢獻(xiàn)較大，魚皮水解物中雜環(huán)化合物相對含量僅為2.71%，而3種糖的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中雜環(huán)化合物的相對含量均達(dá)50%以上。以上結(jié)果表明，美拉德反應(yīng)可以通過形成雜環(huán)化合物來增強(qiáng)魚皮水解物的風(fēng)味。

表1 魚皮水解物和美拉德反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性成分組成

圖10 魚皮水解物和美拉德反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性成分組成和含量

3 討論

微波法作為一種新型的加熱技術(shù)，加熱速度快且均勻，對物料穿透力強(qiáng)、操作簡單、綠色安全，已廣泛應(yīng)用于烹飪和焙烤等食品加工領(lǐng)域。其原理是微波輻射與帶電離子和極性分子相互作用，使物料內(nèi)的分子頻繁摩擦損耗以及發(fā)生離子遷移，使電磁能轉(zhuǎn)化為熱能加熱物料[31]。李忍等[31]研究發(fā)現(xiàn)高粱蛋白經(jīng)微波處理后，粒徑顯著減小，總蛋白質(zhì)含量得到提高。Zheng等[32]采用微波結(jié)合超聲預(yù)處理牛骨蛋白，提高了牛骨蛋白的水解度和抗氧化性能。而本研究采用微波技術(shù)預(yù)處理鳙魚皮，從水解度和分子量分布的結(jié)果可以看出，微波處理使魚皮膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)變得松散，暴露出更多酶切位點(diǎn)，有效提高了酶解效率，酶解產(chǎn)物的水解度更高，小分子肽含量更多。

美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性是當(dāng)今食品領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。前人研究發(fā)現(xiàn)，美拉德反應(yīng)可以有效提高水解物的功能活性[33-34]。美拉德反應(yīng)過程中產(chǎn)生的類黑精、還原酮及一些雜環(huán)化合物具有良好的抗氧化活性[35-36]。有學(xué)者提出將美拉德反應(yīng)產(chǎn)物加入食品體系，取代合成的抗氧劑，提高產(chǎn)品抗氧化的穩(wěn)定性[37-38]。本研究發(fā)現(xiàn)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性與美拉德反應(yīng)進(jìn)行的程度有關(guān)，與褐變強(qiáng)度和接枝度的變化趨勢一致，隨反應(yīng)時(shí)間的延長和加熱溫度的升高，褐變強(qiáng)度增強(qiáng)，其抗氧化活性也逐漸增強(qiáng)。這可能是由于隨著美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)生了一系列類黑精和雜環(huán)化合物，從而提高了產(chǎn)物的抗氧化活性。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中產(chǎn)生的類黑精是一種色素和小肽結(jié)合的具有抗氧化、降血壓和抑菌性等生理功能的高分子聚合物混合體，因種類和結(jié)構(gòu)太過復(fù)雜，對其形成機(jī)理及結(jié)構(gòu)功能還有待進(jìn)一步研究[39]。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的揮發(fā)性雜環(huán)化合物，如呋喃和吡咯等，除了影響其風(fēng)味特性[40]，還通過引入它們的雙鍵來提高其抗氧化活性。Liu等[41]發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白水解物的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中產(chǎn)生的吡嗪、吡咯和呋喃等雜環(huán)化合物與Fe2+螯合活性和還原能力顯著相關(guān)。本研究中，美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的雜環(huán)類揮發(fā)性化合物對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的風(fēng)味增強(qiáng)和抗氧化活性也都產(chǎn)生了影響。本研究中核糖具有較高的反應(yīng)性，產(chǎn)生了較多含量的雜環(huán)類化合物，因此核糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有更高的抗氧化活性。還原糖的種類會影響美拉德反應(yīng)的程度，從而影響產(chǎn)物的抗氧化活性。Chen等[42]評價(jià)了魚鱗明膠水解物美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)核糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有最高的抗氧化活性。胡曉等[43]研究了裂壺藻酶解物與不同種類還原糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性，同樣發(fā)現(xiàn)核糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有最高的抗氧化活性。這可能是因?yàn)楹颂亲鳛橐环N五碳糖，碳鏈短，空間位阻小，相比于六碳糖反應(yīng)速度大，更易于裂解參與美拉德反應(yīng)[42]，生成更多的類黑精，增加褐變程度，從而提高產(chǎn)物抗氧化活性，這與本研究結(jié)果一致。

美拉德反應(yīng)在提高水解物功能活性的同時(shí)，也產(chǎn)生了一系列結(jié)構(gòu)復(fù)雜的物質(zhì)，其中研究比較熱門的主要是晚期糖基化末端終產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGEs)[43]。AGEs是美拉德反應(yīng)的重要產(chǎn)物，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，攝人后會在體內(nèi)積累，導(dǎo)致諸多慢性疾病，如阿爾茲海默癥、糖尿病和動脈粥樣硬化等[44]。為了減少本研究美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中的AGEs含量，可以通過控制加工條件來實(shí)現(xiàn)，如減少加熱時(shí)間和降低加熱溫度，但這可能會影響產(chǎn)物的品質(zhì)和色香味。因此，可以考慮通過添加一些天然產(chǎn)物來抑制糖化反應(yīng)的發(fā)生[44]，如黃酮和酚類等抗氧化性組分，大蒜、茶和迷迭香等提取物，通過抑制糖鏈裂解為具有高反應(yīng)活性的AGEs前體化合物，從而減少AGEs的生成和蛋白質(zhì)交聯(lián)[45]。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)微波預(yù)處理有效提高了魚皮水解產(chǎn)物的水解度和小分子肽的含量，將魚皮水解產(chǎn)物與葡萄糖、木糖和核糖加熱制備美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，評價(jià)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化能力和揮發(fā)性成分。結(jié)果表明，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化能力高于魚皮水解產(chǎn)物。135℃、35 min條件下美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的褐變程度最高，抗氧化能力較強(qiáng)，還原糖的種類可影響美拉德反應(yīng)的速率，其中核糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物比葡萄糖和木糖的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有更高的褐變程度和抗氧化能力。揮發(fā)性成分分析結(jié)果表明，美拉德反應(yīng)后吡嗪類、呋喃類等雜環(huán)類化合物相對含量增多，改善了魚皮水解產(chǎn)物的風(fēng)味。美拉德反應(yīng)對產(chǎn)物的風(fēng)味和色澤帶來積極作用的同時(shí)，也有著不可忽視的負(fù)面作用，后續(xù)可對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物提高抗氧化活性的機(jī)理，以及如何有效減少美拉德反應(yīng)過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)的含量進(jìn)行深入研究。