王彤，王杰，陸書華，解媛，項(xiàng)玉涵，金呈強(qiáng)

（濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東 濟(jì)寧 272000）

0 引言

人乳頭狀瘤病毒（HPV）是當(dāng)前世界范圍內(nèi)最常見的性傳播病毒，是女性宮頸癌的高危引發(fā)因素之一，并與男性和女性多部位的癌癥發(fā)展有關(guān)[1]。宮頸癌因其高發(fā)病率和病死率成為世界范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類生命健康的惡性腫瘤之一，世界衛(wèi)生組織于2020年11月17日正式啟動(dòng)《加速消除宮頸癌全球戰(zhàn)略》，為2020-2030這十年制定了明確的目標(biāo)和指標(biāo)[2]。研究表明，高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的必要原因。而HPV感染不僅限于女性群體，近年來，男性HPV感染陽性率也在逐年升高，且男性HPV的感染對其配偶HPV感染的治療、轉(zhuǎn)歸極為不利，甚至?xí)鹱陨砑怃J濕疣，肛門癌，陰莖癌等。本研究旨在了解魯西南地區(qū)男性HPV感染的情況及型別分布，為HPV感染引起的相關(guān)男性疾病早期預(yù)防篩查和診斷提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2020年1月17日至2021年3月16日來濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院行H P V分型檢查的門診男性患者600例，年齡2～74歲，平均（33.88±11.03）歲。按年齡段劃分標(biāo)準(zhǔn)分為5個(gè)年齡組，分別為少年組（≤18歲），青年組（19～34歲），壯年組（35～49歲），中年組（50～64歲），老年組（≥65歲）?；颊邅碓雌つw科531例，泌尿外科65例，其他科室4例。

1.2 試劑與儀器

采用HPV分型檢測試劑盒（PCR+膜雜交法），來自潮州凱普生物化學(xué)有限公司，可檢測21種HPV亞型，屬于高危亞型的有16種（16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、cp8304），低危亞型的有5種（6、11、43、42、44）。所用儀器為杭州博日科技股份有限公司生產(chǎn)的博日life express基因擴(kuò)增儀,潮州凱普生物化學(xué)有限公司生產(chǎn)的凱普HHM-2醫(yī)用核酸分子快速雜交儀。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集

由醫(yī)生用男性專用棉拭子伸入尿道約2～4cm處，捻動(dòng)拭子采集上皮細(xì)胞，或在龜頭、冠狀溝包皮遠(yuǎn)端黏膜上刮拭數(shù)次取材，取出后放入無菌管中密閉送檢。醫(yī)生將疣樣組織標(biāo)本采用無菌手術(shù)切除，放入裝有細(xì)胞保存液的洗脫管中密閉送檢。

1.3.2 HPV DNA提取

取保存液0.5mL，14000r/min離心3分鐘，棄上清。加入400μL溶液Ⅰ，振蕩混勻，100℃加熱15min。點(diǎn)動(dòng)離心，加入400μL溶液Ⅱ，振蕩混勻后，室溫下放置2 m i n，14000rpm離心5min，去上清液（務(wù)必去干凈）。室溫放置2min，加入60μL溶液Ⅲ充分溶解，靜置10min，14000rpm離心3～5min。提取完畢后取2 μL樣本用于擴(kuò)增。

1.3.3 PCR擴(kuò)增

按照試劑盒說明書配置好擴(kuò)增用的反應(yīng)體系（23.5μLPCR-Mix+0.5μLTaq酶），加入1-2μL提取好的DNA模板混勻，按擴(kuò)增儀設(shè)定好的程序上機(jī)擴(kuò)增。

20℃ 10min

95℃ 9min

95℃ 20sec ←—┐

55℃ 30sec 40個(gè)循環(huán)

72℃ 30sec ←—┙

72℃ 5min

4 ℃ HOLD

1.3.4 導(dǎo)流雜交分型

取PCR產(chǎn)物在95℃加熱5min后立即用冰水浴至少2min，然后按試劑盒說明書在凱普HybriMax醫(yī)用核酸分子快速雜交儀（HHM-2）上完成導(dǎo)流雜交并顯色。檢測結(jié)果陽性點(diǎn)為清晰可見的藍(lán)紫色圓點(diǎn)，雜交膜條上的Biotin對照點(diǎn)和內(nèi)對照（IC)點(diǎn)同時(shí)顯色，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果才有效。根據(jù)膜條HPV分型分布圖判斷陽性點(diǎn)為何種HPV病毒類型。有一個(gè)以上分型點(diǎn)陽性則為多重HPV感染。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用IBM SPSS 20進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：HPV感染采用絕對數(shù)和率相結(jié)合形式表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV檢測結(jié)果

魯西南地區(qū)600例男性患者通過HPV分型檢測，檢出陽性316例，陽性率52.67%，其中單一感染197例，占總陽性率62.34%，雙重感染83例，占總陽性率26.26%，三重感染21例，占總陽性率6.65%，四重及以上感染15例，占總陽性率4.75%。

2.2 HPV感染亞型分布

診斷試劑中的21種亞型均有檢出，主要以亞型6，11，16為主，其中 低危亞型6型感染最多共98例，感染率16.33%；高危亞型45型感染最少僅有一例，感染率0.17%。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 魯西南地區(qū)男性感染HPV亞型分布

2.3 HPV陽性感染者年齡段分布

根據(jù)年齡劃分標(biāo)準(zhǔn)將陽性患者年齡分為五個(gè)年齡組，分別為少年組（≤18歲）15例占陽性感染率4.75%，青年組（19～34歲）166例占陽性感染率52.53%，壯年組（35～49歲）93例占陽性感染率29.43%，中年組（50～64歲）35例占陽性感染率11.08%，老年組（≥65歲）7例占陽性感染率2.22%。青年組＞壯年組＞中年組＞少年組＞老年組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 魯西南地區(qū)不同年齡段HPV分型分布 例(%)

3 討論

HPV是閉合雙鏈?zhǔn)壬掀ば訢NA 病毒，其基因型種類繁多，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)130多種HPV型別，不同型別的HPV，其生物學(xué)行為及致病能力各不相同，根據(jù)不同亞型的HPV與腫瘤發(fā)生的危險(xiǎn)性高低，分為低危型和高危型。其中，高危型HPV主要與宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤病變和陰莖癌有關(guān)；而低危型的HPV主要與外生殖器尖銳濕疣等良性病變有關(guān)[3]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，女性HPV感染與其男性性伴侶的HPV感染也存在一定關(guān)系[4]，故男性HPV的感染問題也得到了重視[5]。而HPV的致病性與其分型有密切關(guān)系，因此針對HPV的分型檢測及其評價(jià)具有重要的臨床意義。本文采用凱普核酸分子導(dǎo)流雜交分型檢測技術(shù)對魯西南地區(qū)600例男性患者尿道口標(biāo)本進(jìn)行HPV分型檢測，統(tǒng)計(jì)分析所有受檢者HPV分型結(jié)果及其特點(diǎn)。

本研究表明：（1）600例男性患者中，檢出陽性感染者316例，陽性率52.67%（316/600），表明在本院就診的男性患者中有超過1/2的感染HPV，感染比例較大；（2）其中單一感染占總陽性率62.34%，雙重感染占總陽性率26.26%，三重感染占總陽性率6.65%，四重及以上感染占總陽性率4.75%，說明單一型別的感染和多型別的混合感染共同存在，且以單一型別感染為主，混合型感染為輔，單一型（197例）和混合型（119例）比例為1.65:1。這可能與此次研究的被檢人群及其取材部位有關(guān)，本研究的取材部位不僅對男性患者尿道口取材，也對其龜頭、冠狀溝包皮遠(yuǎn)端黏膜等部位取材；在600例被測樣本中，其中皮膚性病科尖銳濕疣患者居多，共有531例，占88.50%，而檢測結(jié)果中排名前兩位的型別是HPV6和HPV11這兩種亞型，這與以往報(bào)道結(jié)果一致[6-7]；（3）本研究中，男性HPV感染出現(xiàn)頻率前6位的型別為HPV 6型（98人次），HPV 11型（68人次），HPV 16型（55人次），HPV 52型（32人次），HPV 39型（31人次），HPV 51型（26人次），這6種型別是魯西南地區(qū)男性患者HPV感染出現(xiàn)頻率最高的亞型。在HPV各亞型中，高危型的致癌力比低危型高出10倍，故我們在關(guān)注和監(jiān)測HPV低危型別的同時(shí)，更應(yīng)重視HPV16型、52型、39型和51型，相關(guān)部門在研發(fā)HPV疫苗時(shí)，可有所偏重和擴(kuò)大覆蓋范圍，這樣有針對性的且多價(jià)的疫苗接種對減少HPV的傳播會(huì)起到至關(guān)重要的作用[8]；（4）本組316例陽性結(jié)果中，低危亞型6型感染最多共98例，占總陽性率31.01%其次以HPV 11，16，52，39，26等亞型為主。這與文獻(xiàn)報(bào)道的東莞地區(qū)[9]（11，6，16，52，58，33）相似。

有研究表明[10]，男性HPV感染與女性性伴侶的HPV感染有一定關(guān)系，謝莉莉等也發(fā)現(xiàn)[11]被HPV感染的女性其男性性伴也有較高的HPV感染率，且男女感染型別有較高的一致性，說明男性在女性HPV感染過程中充當(dāng)了“載體”和“橋梁”的作用，因此，對性活躍期的男性進(jìn)行HPV監(jiān)控，并對HPV陽性的男性患者予以及時(shí)的治療，對HPV的防控和宮頸 癌的防治具有十分重要的意義。