郭鏵艷 葉勝海 翟榮榮 朱國富 俞法明 巫明明 葉 靖 張小明, *

(1 浙江師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004；2 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所，浙江 杭州 310021)

葉片是植物進(jìn)行光合作用的主要器官。水稻生長和發(fā)育過程中由葉片提供能量和營養(yǎng)，其過早衰老會(huì)直接影響植株的光合作用和呼吸作用。早期葉片衰老情況下，葉綠體破壞，葉綠素降解，光合色素含量急劇降低導(dǎo)致葉片顏色從綠色變?yōu)辄S色、棕色和枯萎[1]，有的出現(xiàn)衰老斑點(diǎn)；衰老的同時(shí)伴隨著其他細(xì)胞器的解體[2]，水解酶活性升高、數(shù)量增多，加劇水解反應(yīng)，導(dǎo)致可溶性蛋白含量降低[3]、rRNA和tRNA的合成減少[4]，細(xì)胞內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)功能紊亂導(dǎo)致大量的活性氧[5]、自由基和丙二醛等有害物質(zhì)積累，導(dǎo)致細(xì)胞膜被破壞，加劇衰老[6]。抽穗期水稻籽粒灌漿的營養(yǎng)物質(zhì)主要來源于葉片的光合作用，水稻葉片早衰導(dǎo)致光合作用和呼吸作用下降，葉片功能期縮短，嚴(yán)重影響籽粒發(fā)育[7-8]，導(dǎo)致產(chǎn)量與品質(zhì)下降[9-11]。

水稻葉片提前進(jìn)入衰老狀態(tài)即葉片早衰突變，為研究早衰及抗衰提供了豐富的材料和理論基礎(chǔ)。葉片早衰突變體分為葉片黃化、白化、有斑點(diǎn)等幾大類[12]。水稻葉片早衰多由一對(duì)隱性核基因控制，根據(jù)基因的功能將其分為葉綠素合成與降解途徑相關(guān)基因(OsSRLK[13]、OsPSE1[14]和OsPAO[15]等)、葉綠體發(fā)育相關(guān)基因(YPD1[16]、ELL1[17]、WGL5[18]、WLS5[19]、RLS3[20]和RLS1[21]等)、光合系統(tǒng)相關(guān)基因(PSL50[22])、蛋白質(zhì)合成、降解及轉(zhuǎn)運(yùn)途徑相關(guān)基因(SPL7[23]、SPL28[24]、ESL1[25]和LPS1[26]等)、細(xì)胞衰老凋亡相關(guān)基因(ES2[18]、OsNAP[27]和OsLED[6]等)、調(diào)控植物激素相關(guān)基因(LLB[28]、YL3[29]和OsDOS[30]等)、其他途徑相關(guān)基因(PLS5[31]等)。其中OsSRLK基因通過參與激素介導(dǎo)通路降解葉綠素，在水稻葉片衰老過程中起重要作用；OsPSE1基因突變導(dǎo)致葉綠素缺失，葉片黃化枯死；OsPAO和OsRCCR1基因分別編碼一個(gè)脫鎂葉綠素加氧酶和紅色葉綠素代謝產(chǎn)物還原酶，這兩種酶是葉綠素降解途徑中的關(guān)鍵酶，在葉片衰老過程中酶活性顯著上調(diào)；YPD1基因調(diào)控葉綠體發(fā)育，基因突變導(dǎo)致植株分蘗期葉片早衰，細(xì)胞內(nèi)活性氧積累，光合色素水平較低，葉綠體異常；ELL1基因參與葉綠體發(fā)育進(jìn)程，基因突變導(dǎo)致植株葉綠體降解，葉片中H2O2和胼胝質(zhì)積累，DNA降解嚴(yán)重、細(xì)胞異常死亡；WGL5基因編碼的蛋白是一個(gè)1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶，該酶主要作用在卡爾文循環(huán)中，對(duì)植物光合作用影響較大，WGL5基因突變導(dǎo)致葉綠體異常發(fā)育，導(dǎo)致植株早期白化；PSL50基因通過調(diào)控光合系統(tǒng)的穩(wěn)定以及光合脅適性，在水稻葉片衰老和熱脅迫響應(yīng)中起雙重調(diào)控作用；SPL7基因編碼一種熱脅迫轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)還原型輔酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleodite phosphate, NADPH)氧化酶有調(diào)節(jié)作用，對(duì)蛋白去磷酸化的信號(hào)傳導(dǎo)通路有調(diào)控作用；ESL1基因編碼黃嘌呤脫氫酶，通過調(diào)節(jié)尿素的含量影響植物的生長發(fā)育；LPS1是一種泛素結(jié)合酶，參與ABA的代謝途徑；ES2基因編碼肌醇多磷酸激酶OsIPK2，調(diào)控細(xì)胞凋亡，控制葉片衰老；OsNAP基因通過茉莉酸通路實(shí)現(xiàn)對(duì)葉片衰老的調(diào)控；LLB基因直接或間接抑制茉莉酸和油菜素內(nèi)酯介導(dǎo)的反應(yīng)，影響水稻的防衛(wèi)反應(yīng)和生長應(yīng)答，調(diào)控水稻葉片的衰老；YL3基因編碼轉(zhuǎn)錄因子OsNAC109，直接調(diào)控衰老和激素相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，影響內(nèi)源激素水平，影響衰老進(jìn)程；OsDOS基因通過參與茉莉酸甲酯和細(xì)胞分裂素調(diào)控過程，從而調(diào)控葉片早衰；PLS5基因通過調(diào)控淀粉合成代謝途徑調(diào)控葉片淀粉積累。目前已經(jīng)克隆的水稻葉片早衰基因用來研究高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)稻米仍不夠，還需要深入了解葉片早衰基因的調(diào)控機(jī)制，為培育出抗早衰水稻新品種提供材料。

早衰突變體es33是由常規(guī)單季晚粳稻浙粳99經(jīng)過甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate,EMS)化學(xué)誘變而來，在杭州和海南試驗(yàn)基地進(jìn)行多代種植，受環(huán)境影響小、突變性狀穩(wěn)定，突變體從播種后第10天開始出現(xiàn)早衰表型，第2和第3葉的葉尖干枯變白，衰老持續(xù)到成熟期。本試驗(yàn)對(duì)早衰突變體es33(earlysenescence33)的衰老進(jìn)程、衰老指標(biāo)進(jìn)行鑒定，并定位早衰基因ES33以及后續(xù)基因功能研究，旨在為培育抗早衰新品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所和浙江勿忘農(nóng)種業(yè)股份有限公司選育的常規(guī)單季晚粳稻浙粳99經(jīng)過化學(xué)試劑EMS處理誘變得到早衰突變體es33，在海南和杭州經(jīng)過連續(xù)多代種植，使早衰性狀穩(wěn)定遺傳。2019年7月在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院海寧基地以es33為母本，分別與野生型浙粳99、秈稻明恢86雜交得到F1種子；將F1種子播種于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院海南陵水南繁育種基地，F(xiàn)1自交，2020年4月得到F2種子，同年5月于浙江海寧基地播種F2種子，得到F2遺傳群體和定位群體。

1.2 早衰表型分析和成熟期農(nóng)藝性狀的調(diào)查

1.2.1 早衰表型分析 取適量飽滿的突變體es33和野生型浙粳99的種子分別放于牛皮紙種子袋中，置于裝滿清水的發(fā)芽盒常溫下浸泡48 h，催芽48 h后播種于大田，播種后每天上午10：00左右到稻田隨機(jī)觀察并記錄突變體es33和浙粳99的生長情況，觀察期為一個(gè)月，記錄突變體es33早衰開始時(shí)間，并拍照。

1.2.2 農(nóng)藝性狀的調(diào)查 于成熟期隨機(jī)選取突變體es33和野生型浙粳99植株各10株，分別測(cè)量株高、穗長、粒長和粒寬，調(diào)查單株分蘗數(shù)、每穗粒數(shù)和每穗實(shí)粒數(shù)，計(jì)算結(jié)實(shí)率，稱取千粒重，共10次重復(fù)，記錄并用SPSS 22軟件分析數(shù)據(jù)，分析突變體與野生型之間的差異。

1.3 光合色素含量和葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

1.3.1 光合色素含量的測(cè)定 苗期、分蘗初期和分蘗盛期，上午10：00在大田取突變體es33和浙粳99植株各3株，取相同部位的葉片0.1 g，剪成2 mm×2 mm左右的小片置于14 mL的離心管中，加入10 mL 95% 的乙醇，避光條件下置于4℃冰箱中浸提48 h，8 000×g高速離心5 min，UV-2550紫外可見分光光度計(jì)(日本島津)分別測(cè)量665、649和470 nm 3個(gè)波長處上清液的吸光度值，3次重復(fù)，利用Lichtenthaler[32]修正的公式計(jì)算葉片單位鮮重葉綠素a(chlorophyll a, Chla)、葉綠素b(chlorophyll b, Chlb)、類胡蘿卜素(carotenoid, Car)含量，取平均值：

Chla含量=(13.95×OD665-6.88×OD649)V/1 000W

(1)

Chlb含量=(24.96×OD649-7.32×OD665)V/1 000W

(2)

Car含量=(1 000×OD470+811.74×OD665-2 851.32×OD649)/245

(3)。

Chla含量、Chlb含量和Car含量單位為mg·g-1。V為葉綠素提取液總體積，mL；W為葉片鮮重，g。

1.3.2 葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定 從大田取分蘗盛期突變體es33和野生型浙粳99植株各3株，黑暗處理20 min，使用PAM-2500 Imaging 葉綠素?zé)晒饪焖俪上駜x(德國Walz)和Imaging win軟件處理和分析葉綠素?zé)晒飧黜?xiàng)參數(shù)并成像，將待測(cè)植株相同部位的葉片放在儀器的鏡頭下，測(cè)定PSII最大能轉(zhuǎn)化效率(maximum photochemical,Fv/Fm)、光損傷程度Y(NO)值并成像，3次重復(fù)。

1.4 葉綠體超微結(jié)構(gòu)的觀察和光合指標(biāo)的測(cè)定

1.4.1 葉綠體超微結(jié)構(gòu)的觀察 大田環(huán)境下突變體es33葉片出現(xiàn)早衰表型時(shí)，分別取突變體es33和野生型浙粳99相同部位的葉片，用手術(shù)刀切成2 mm×2 mm的小片，浸入2.5%戊二醛溶液，抽真空固定，4℃過夜；用0.1 mol·L-1的磷酸緩沖液(pH值7)漂洗樣品3次，每次15 min；用1%鋨酸溶液固定1～2 h后；經(jīng)過0.1 mol·L-1的磷酸緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)漂洗3次，依次用梯度濃度(30%、50%、70%、80%)的酒精脫水，每個(gè)濃度處理15 min后過渡到90%和95%丙酮溶液中脫水，分別處理15 min，最后用純丙酮處理2次，每次20 min。用同等體積Spurr包埋劑與丙酮混合液處理1 h，再用Spurr包埋劑與3倍體積丙酮混合液處理3 h。用純包埋劑Spurr處理樣品過夜。將經(jīng)過滲透處理過的樣品包埋，70℃加熱過夜，使用EM UC7超薄切片機(jī)切片(德國徠卡)(每片70～90 nm)，檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液雙重染色10 min 后干燥過夜，用H-7650透射電子顯微鏡(日本日立)觀察葉綠體超微結(jié)構(gòu)，采集圖像。

1.4.2 光合指標(biāo)的測(cè)定 于分蘗盛期，選擇天氣晴朗、光合作用穩(wěn)定的上午10：00，在田間用LI-6400XT便攜式光合作用測(cè)量系統(tǒng)(美國Li-COR)分別測(cè)定突變體es33和野生型浙粳99植株相同部位葉片的凈光合速率(μmol CO2·m-2·s-1)、氣孔導(dǎo)度(mmol·m-2·s-1)、胞間CO2濃度(μmol·mol-1)和蒸騰速率(g·(m-2·h-1)，5次重復(fù)，取平均值，用SPSS 22軟件獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)。

1.5 早衰生理指標(biāo)測(cè)定

分蘗盛期，大田中分別取3株突變體es33和野生型浙粳99相同部位的葉片，迅速放入液氮中，用生物檢測(cè)試劑盒(蘇州格銳思生物科技有限公司)分別測(cè)定鮮重0.1 g葉片中丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量、過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)含量、過氧化氫酶(catalase，CAT)活性、過氧化物酶(peroxidase，POD)活性、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、超氧陰離子(superoxide anion，OFR)含量和超氧陰離子產(chǎn)生速率，3次重復(fù)，取平均值。

1.6 遺傳分析和基因定位

1.6.1 遺傳分析 以野生型浙粳99為母本，與穩(wěn)定遺傳的早衰突變體es33雜交獲得F1種子，F(xiàn)1植株自交得到F2種子；播種F2種子，構(gòu)建遺傳群體，觀察并統(tǒng)計(jì)F1和F2植株表型性狀分離情況，并進(jìn)行遺傳分析。

1.6.2 基因定位 以穩(wěn)定遺傳的早衰突變體es33為母本，以秈稻明恢86為父本，雜交獲得F1種子，F(xiàn)1植株自交得到F2種子；后播種F2種子，構(gòu)建F2基因定位群體。

從F2定位群體中選擇570株具有早衰突變表型的單株作為定位植株，用CTAB法[33]分別提取母本、父本和F2早衰植株葉片DNA；根據(jù)浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所常規(guī)稻實(shí)驗(yàn)室己有的均勻分布在水稻12條染色體上174對(duì)簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat, SSR)分子標(biāo)記，通過PCR擴(kuò)增和聚丙烯酰胺凝膠電泳，用10個(gè)早衰單株進(jìn)行多態(tài)篩選和初步定位，確定葉片早衰基因ES33定位區(qū)間，之后在RiceVarMap(http://ricevarmap.ncpgr.cn/)設(shè)計(jì)Indel引物，用560個(gè)早衰單株進(jìn)行精細(xì)定位。其中PCR擴(kuò)增體系總計(jì)10 μL：2 × Taq master mix酶5 μL、目的DNA 1 μL、正、反向引物各1 μL、ddH2O 2 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸6 min，產(chǎn)物于4℃條件下保存。

1.7 基因重測(cè)序、候選基因的分析及尿酸含量的測(cè)定

1.7.1 基因重測(cè)序 在精細(xì)定位的基礎(chǔ)上，取早衰突變體es33苗期葉片，由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成基因ES33的重測(cè)序工作。

1.7.2 候選基因的分析 在利用分子標(biāo)記和基因組重測(cè)序的基礎(chǔ)上，篩選到候選基因，設(shè)計(jì)候選基因突變位點(diǎn)測(cè)序引物(見附表1)，在野生型浙粳99和早衰突變體es33之間進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序驗(yàn)證。引物合成和測(cè)序工作由杭州擎科生物技術(shù)有限公司完成。

1.7.3 尿酸含量的測(cè)定 分蘗盛期，分別取3株突變體es33和野生型浙粳99相同部位的葉片，放入液氮中，用Grace尿酸含量生物檢測(cè)試劑盒測(cè)定鮮重0.1 g葉片中尿酸含量，3次重復(fù)。

1.8 基因突變位點(diǎn)氨基酸序列比對(duì)分析和同源性分析

在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站上獲取不同物種的ES33基因cDNA序列及蛋白質(zhì)黃嘌呤脫氫酶(XANTHINE DEHYDROGENASE，XDH)氨基酸序列，篩選出與水稻同源性較高的22個(gè)物種的氨基酸序列，用MEGA 7.0進(jìn)行序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 早衰突變體es33的表型特征及農(nóng)藝性狀分析

與野生型相比，葉片早衰突變體es33在播種后第10天出現(xiàn)早衰表型，第2和第3葉的葉尖干枯，到第28天除了新葉，其他葉片的葉尖均出現(xiàn)干枯現(xiàn)象(圖1)，成熟后，對(duì)突變體和野生型進(jìn)行農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，與野生型(WT)浙粳99相比，突變體es33的株高、單株分蘗、穗長、每穗粒數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重都極顯著降低，粒寬顯著降低，而粒長無顯著差異(表1)。成熟期突變體es33植株整株葉片基本干枯，穗明顯比沂粳99短小(圖2)。

注：A、B、C、D分別是播種后第10、第14、第21和第28天野生型浙粳99和早衰突變體es33的表型。Note: A, B, C and D are the phenotypes of Zhejing 99 and early senescence mutant es33 at the 10th, 14th, 21th and 28th days after sowing.圖1 早衰突變體es33和浙粳99苗期表型Fig.1 Seedling phenotypes of early senescence mutant es33 and Zhejing 99

表1 早衰突變體es33和浙粳99的農(nóng)藝性狀Table 1 Agronomic traits of early senescence mutant es33 and Zhejing 99

注：A：成熟期株型對(duì)比；B：成熟期葉形對(duì)比；C：成熟期穗型對(duì)比；D：成熟期粒型對(duì)比。Note: A: Comparison of plant type at maturity. B: Comparison of leaf shape at maturity. C: Comparison of panicle type at maturity. D: Comparison of grain shape at maturity.圖2 早衰突變體es33和浙粳99成熟期表型Fig.2 Maturity phenotypes of early senescence mutant es33 and Zhejing 99

2.2 早衰突變體es33光合色素含量和葉綠素動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析

2.2.1 光合色素含量變化分析 為了確定早衰突變體es33葉尖干枯表型是否由光合色素含量變化導(dǎo)致，測(cè)定了大田環(huán)境下生長的野生型浙粳99和早衰突變體es33在苗期、分蘗初期和分蘗盛期時(shí)相同部位葉片光合色素含量。結(jié)果顯示(圖3)，早衰突變體es33在苗期，即早衰表型出現(xiàn)時(shí)期，葉綠素a和葉綠素b的含量分別顯著低于野生型18%和37%，類胡蘿卜素的含量無明顯變化，表明早衰突變體es33的葉尖早衰退綠表型主要由葉綠素a和葉綠素b含量下降所致；類胡蘿卜素的含量無明顯下降，導(dǎo)致葉尖發(fā)黃。分蘗初期，早衰突變體es33的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量分別顯著低于野生型26%、9%和26%，差異均達(dá)極顯著水平。分蘗盛期，早衰突變體es33的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量分別顯著低于野生型43%、48%和34%。上述結(jié)果表明，從苗期開始，突變體es33伴隨著光合色素含量的下降，以及隨著生長進(jìn)程的推進(jìn)，早衰逐漸嚴(yán)重，光合色素含量下降程度逐漸加大，由此推測(cè)突變體es33葉尖早衰表型與光合色素含量下降有關(guān)。

圖3 早衰突變體es33和浙粳99不同生長時(shí)期光合色素含量Fig.3 Photosynthetic pigment contents of early senescence mutant es33 and Zhejing 99 at different growth stages

2.2.2 葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)分析 在光合色素含量顯著下降的基礎(chǔ)上，為了比較野生型浙粳99與早衰突變體es33葉片之間光合效率的差異，在分蘗盛期對(duì)突變體和野生型進(jìn)行了葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定。其中Fv/Fm是最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，亦稱最大PSII的光能轉(zhuǎn)換效率，Y(NO)是光損傷的重要標(biāo)志，Y(NO)值越大，表明入射光超過了植物能接受的程度，植物已經(jīng)受到損傷或者繼續(xù)照光的植物將受到損傷。結(jié)果顯示，與野生型浙粳99相比，早衰突變體es33 的Fv/Fm顯著降低(圖4)，表示光轉(zhuǎn)換效率越低，Y(NO)值顯著增大，表明es33受到損傷較嚴(yán)重，早衰特征明顯。

注：A：分蘗盛期野生型和es33葉片F(xiàn)v/Fm；B：分蘗盛期野生型和es33葉片Y(NO)；C：分蘗盛期野生型和es33葉片葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)對(duì)比。Note: A: Wild type and es33 leaf Fv/Fm in tillering stage. B: Leaf Y(NO)of wild type and es33 in tillering stage. C: Histogram of comparison of chlorophyll fluorescence dynamic parameters between wild type and es33 leaves at tillering stage.圖4 早衰突變體es33和浙粳99分蘗盛期葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)Fig.4 Chlorophyll fluorescence kinetics parameters of early senescence mutant es33 and Zhejing 99 at tillering stage

2.3 早衰突變體es33葉綠體超微結(jié)構(gòu)的變化和光合指標(biāo)分析

2.3.1 葉綠體超微結(jié)構(gòu)變化分析 為了探究早衰突變體es33發(fā)生早衰的過程中伴隨的葉綠體超微結(jié)構(gòu)變化，在苗期突變體es33開始出現(xiàn)早衰表型時(shí)，用透射電鏡觀察了野生型和突變體葉綠體的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，野生型浙粳99葉綠體形狀規(guī)則，基粒數(shù)較多，類囊體片層結(jié)構(gòu)排列緊密有序，早衰突變體es33葉綠體發(fā)育畸形、形狀不規(guī)則，基粒數(shù)明顯減少，類囊體疏松紊亂，嗜鋨顆粒明顯增多、變大(圖5)，推測(cè)葉片早衰表型與葉綠體發(fā)育不正常有關(guān)。

注：A、B、C為野生型浙粳99葉綠體超微結(jié)構(gòu)圖；D、E、F為早衰突變體es33葉綠體超微結(jié)構(gòu)圖；G為基粒；OG為嗜鋨顆粒。Note: A, B, and C are the chloroplast ultrastructure of the wild type Zhejing 99. D, E, and F are the chloroplast ultrastructure of the early senescence mutant es33. G: Grana. OG: Osmophilic gramules.圖5 早衰突變體es33和浙粳99分蘗盛期葉綠體超微結(jié)構(gòu)Fig.5 Chloroplast ultrastructure of early senescence mutant es33 and Zhejing 99 at tillering stage

2.3.2 光合指標(biāo)變化分析 分蘗盛期，與野生型浙粳99相比，早衰突變體es33葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，推測(cè)其光合性能受到影響，用光合作用測(cè)量系統(tǒng)測(cè)得分蘗盛期野生型和突變體的光合指標(biāo)，結(jié)果如表2所示。突變體es33凈光合速率極顯著低于野生型，氣孔導(dǎo)度顯著低于野生型，蒸騰速率顯著低于野生型，胞間CO2濃度與野生型無顯著差異，說明葉綠體結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)一步影響了突變體es33的光合性能。

表2 早衰突變體es33和野生型浙粳99的光合性能Table 2 Photosynthetic properties of early senescence mutant es33 and wild type Zhejing 99

2.4 早衰突變體es33早衰生理指標(biāo)變化分析

為了得知變體es33植株胞內(nèi)有害物質(zhì)和活性氧含量的變化，檢測(cè)了突變體和野生型各項(xiàng)生理指標(biāo)。結(jié)果顯示，突變體es33的MDA、H2O2、OFR等有害物質(zhì)的含量極顯著高于野生型(圖6)，CAT活性、POD活性、SOD活性極顯著低于野生型，說明突變體細(xì)胞已受到極大的損傷。

圖6 早衰突變體es33和浙粳99分蘗盛期生理指標(biāo)Fig.6 Physiological parameters of early senescence mutant es33 and Zhejing 99 at tillering stage

2.5 早衰突變體es33遺傳分析和基因ES33的定位

2.5.1es33的遺傳分析 為了分析突變體es33早衰表型的遺傳特性，將其與野生型浙粳99雜交，觀察F1和F2表型，并統(tǒng)計(jì)數(shù)量。結(jié)果顯示，F(xiàn)1植株均為野生型表型，沒有出現(xiàn)早衰現(xiàn)象，F(xiàn)2植株出現(xiàn)早衰性狀分離，總株數(shù)為2 196株，其中正常表型株數(shù)為 1 655 株，早衰表型株數(shù)為541株，用SPSS軟件卡方檢驗(yàn)進(jìn)行遺傳分析，結(jié)果顯示(表3)，正常植株與早衰植株的分離比符合3∶1的孟德爾分離定律，說明es33受單隱性核基因控制。

表3 es33突變基因的遺傳分析Table 3 Genetic analysis of es33 mutant gene

2.5.2 早衰基因ES33的定位 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室己有的均勻分布在水稻12條染色體上的174對(duì)SSR標(biāo)記和后續(xù)設(shè)計(jì)的9對(duì)InDel分子標(biāo)記對(duì)早衰基因ES33進(jìn)行定位，通過PCR擴(kuò)增和聚丙烯酰胺凝膠電泳，用10個(gè)早衰單株進(jìn)行多態(tài)篩選和初步定位，將基因ES33初步定位在水稻第3號(hào)染色體上，用8對(duì)InDel引物對(duì)560個(gè)早衰單株連鎖分析，最終將該基因定位在STS-15(17.9 Mb)和G24(18.8 Mb)標(biāo)記之間(圖7)，物理距離為0.9 Mb(圖7)。

注：n：群體大小。Note: n: Number of group.圖7 早衰基因ES33定位圖Fig.7 Map of the early senescence gene ES33

2.6 早衰基因ES33重測(cè)序、突變位點(diǎn)及尿酸含量變化分析

2.6.1 早衰基因ES33重測(cè)序 通過基因定位得到的精細(xì)區(qū)間(17.9～18.8 Mb)位于3號(hào)染色體的著絲粒(17.7～20.2 Mb)上，著絲粒位于染色體的異染色質(zhì)區(qū)域，該區(qū)域含有大量DNA重復(fù)序列，通常認(rèn)為該區(qū)域是轉(zhuǎn)錄沉默區(qū)，限制了進(jìn)一步的精細(xì)定位，因此借助全基因組重測(cè)序的方法將候選基因暫定為LOC_Os03g31550。

2.6.2 早衰基因ES33突變位點(diǎn)分析 基因測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用日本晴和野生型浙粳99作為對(duì)照，突變體es33中基因LOC_Os03g31550編碼區(qū)第11個(gè)外顯子出現(xiàn)4個(gè)堿基AACA缺失，造成移碼突變。突變體es33的氨基酸序列與野生型浙粳99的氨基酸序列比對(duì)顯示堿基缺失造成的移碼突變導(dǎo)致翻譯提前終止(圖8)。

注：突變體es33和野生型浙粳99的堿基序列比對(duì)圖(上)和氨基酸序列對(duì)比圖(下)。Note: Comparison of base sequence (top) and amino acid sequence (bottom) of mutant es33 and wild type Zhejing 99.圖8 早衰基因ES33突變位點(diǎn)分析Fig.8 Mutation locus analysis of early senescence gene ES33

2.6.3 早衰突變體es33和野生型浙粳99尿酸含量變化分析 由National Center for Biotechnology Information(NCBI)數(shù)據(jù)庫得知，基因ES33(LOC_Os03g31550)編碼黃嘌呤脫氫酶(xanthine dehydrogenase, XDH)，該酶在植物細(xì)胞中參與重要的酶促反應(yīng)，催化黃嘌呤和次黃嘌呤生成尿酸。本研究測(cè)得突變體es33分蘗盛期葉片中尿酸含量極顯著低于野生型浙粳99(圖9)，說明突變體中該酶促反應(yīng)被阻滯，推測(cè)基因ES33突變導(dǎo)致蛋白XDH結(jié)構(gòu)的改變，造成酶活性降低，酶促反應(yīng)受阻。

圖9 早衰突變體es33和浙粳99分蘗盛期尿酸含量Fig.9 Uric acid content of early senescence mutant es33 and Zhejing 99 at tillering stage

2.7 早衰基因ES33的同源性分析

用NCBI篩選出與水稻同源性較高的22個(gè)物種的氨基酸序列，對(duì)水稻(Oryzasativa)和二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、烏拉爾圖小麥(Triticumurartu)、山羊草(Aegilopstauschiisubsp)、狗尾草(Setariaviridis)、高粱(Sorghumbicolor)、玉米(Zeamays)、油菜(Brassicarapasubsp)、野大豆(Glycinesoja)、黍(Panicummiliaceum)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、豌豆(Pisumsativum)、葡萄(Vitisvinifera)、芭蕉(Musaacuminatasubsp)、油棕(Elaeisguineensis)、大葉藻(Zosteramarina)、茶(Camelliasinensis)、木豆(Cajanuscajan)、江南卷柏(Selaginellamoellendorffii)、原殼小球藻(Auxenochlorellaprotothecoides)、克里藻(Klebsormidiumnitens)和超微藻(Bathycoccusprasinos)中蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示(圖10)，水稻中ES33基因與二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、小麥(Triticumurartu)、山羊草(Aegilopstauschiisubsp)等禾本科親緣關(guān)系較近；用DNA MAN軟件對(duì)水稻與山羊草、二穗短柄草、黍、狗尾草、高粱、小麥和玉米等禾本科作物的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，該基因在進(jìn)化的過程中蛋白質(zhì)的氨基酸序列在禾本科作物中高度保守(圖11)。

圖10 早衰基因ES33的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.10 Phylogenetic tree of the early senescence gene ES33

圖11 不同物種中蛋白ES33的氨基酸序列比對(duì)分析Fig.11 Comparative analysis of amino acid sequences of protein ES33 from different species

3 討論

ES33編碼黃嘌呤脫氫酶，該蛋白有一個(gè)β折疊和α-β-α核心結(jié)構(gòu)域，在泛素中可以找到相似的結(jié)構(gòu)[34]。在2Fe-2S鐵氧還蛋白家族[35]和2Fe-2S鐵氧還蛋白相關(guān)家族(包括醛還原酶和黃嘌呤脫氫酶)[36]中可以找到類似的結(jié)構(gòu)。醛氧化酶和黃嘌呤脫氫酶都是含有鉬輔助因子的酶[37]，其共有的錘狀結(jié)構(gòu)域是一種進(jìn)化保守的2Fe-2S鐵氧還蛋白結(jié)構(gòu)域[38-39]。該區(qū)域?yàn)棣抡郫B，是由4個(gè)β鏈和1個(gè)β螺旋側(cè)翼組成的β-薄片，由大約100個(gè)氨基酸和4個(gè)保守的半胱氨酸殘基組成，連接2Fe-2S基團(tuán)。在植物中，活性中心是2Fe-2S團(tuán)簇，其中2個(gè)鐵原子由2個(gè)無機(jī)硫原子和4個(gè)保守的半胱氨酸殘基提供的硫四面體配位[40]。醛氧化酶是一種同型二聚體，催化醛在氧和水的存在下轉(zhuǎn)化成羧酸和過氧化氫，需要FAD、鉬和2個(gè)2Fe-2S團(tuán)簇作為輔助因子；黃嘌呤脫氫酶具有相同的輔助因子，該酶通過蛋白水解酶水解或巰基氧化，不可逆地從脫氫酶形式轉(zhuǎn)化為氧化酶形式，催化黃嘌呤氫化成為次黃嘌呤和尿酸鹽[41]，這種活性通常存在于具有黃嘌呤氧化酶活性的雙功能酶中。研究表明，XDH參與尿素和尿酸的合成，在水稻的各組織中表達(dá)，XDH基因沉默造成嘌呤代謝物酰尿類物質(zhì)缺陷，酰尿類物質(zhì)是一種有效的活性氧清除劑[42-43]，導(dǎo)致植株出現(xiàn)生長延遲等不利的影響[44]；XDH活性升高可以催化產(chǎn)生有效的活性氧清除劑，減少自由基對(duì)組織和細(xì)胞的損傷[45]，提高植物抗氧化能力，有效延緩水稻葉片衰老過程，提高產(chǎn)量[46]。因此，XDH可通過調(diào)控植株內(nèi)酰脲的含量[47]，影響植物細(xì)胞清除ROS的能力，從而影響衰老進(jìn)程。

本研究中突變體es33分蘗期葉片尿酸含量顯著降低，推測(cè)由于基因ES33突變導(dǎo)致黃嘌呤脫氫酶的生物合成提前終止，造成XDH活性下調(diào)或者結(jié)構(gòu)上的缺陷造成酶促反應(yīng)受阻，尿酸的合成受阻，尿酸含量降低，加劇了活性氧自由基的積累，從而造成植株的衰老。

本研究發(fā)現(xiàn)，葉片早衰突變體es33苗期開始出現(xiàn)葉尖變黃早衰表型，衰老逐漸嚴(yán)重直到成熟期。ES33受一對(duì)隱性核基因控制，位于水稻3號(hào)染色體上，確定為LOC_Os03g31550，編碼XDH，是基因ESL1[25]的等位基因。前人研究表明，XDH具有延緩葉片衰老的功能[45]，含有鉬輔助因子結(jié)合的結(jié)構(gòu)域(455～561 AA)，位于第4個(gè)外顯子，構(gòu)成底物結(jié)合部位和氧化還原部位[48]，還存在進(jìn)化保守結(jié)構(gòu)域(620～727 AA)，位于第5和第6個(gè)外顯子中?；駿SL1的第4個(gè)外顯子中堿基T的缺失(第558個(gè)AA)，移碼突變導(dǎo)致翻譯提前終止，早衰可能是由XDH鉬輔助因子結(jié)合域不完整和進(jìn)化保守結(jié)構(gòu)域缺失造成蛋白功能的損壞引起的。ES33第11個(gè)外顯子出現(xiàn)4個(gè)堿基的缺失，造成移碼突變(圖12)導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯提前終止。ES33的突變位點(diǎn)不在XDH的功能結(jié)構(gòu)域和保守結(jié)構(gòu)域，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相對(duì)比較完整，但是突變體es33出現(xiàn)早衰性狀的時(shí)間比突變體esl1早，推測(cè)基因ES33在調(diào)控水稻衰老過程中，除了蛋白質(zhì)XDH鉬輔助因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域和進(jìn)化保守結(jié)構(gòu)域以外，還有其他因素起著關(guān)鍵性作用。

圖12 不同突變位點(diǎn)比較Fig.12 Comparison of different mutation sites

迄今為止，黃嘌呤脫氫酶基因?qū)λ舅ダ险{(diào)控的作用機(jī)制很少被報(bào)道，本研究為進(jìn)一步明確黃嘌呤脫氫酶基因影響水稻衰老機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為利用早衰分子機(jī)制培育出抗衰老新品種提供了依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，由于ES33基因發(fā)生堿基缺失突變，導(dǎo)致突變體es33苗期出現(xiàn)早衰表型，分蘗期葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，光合作用減弱，植株衰老持續(xù)到成熟期，結(jié)實(shí)率和千粒重顯著下降，產(chǎn)量降低。

附表1 本研究所用引物序列Table S1 Primer sequences used for this study