曹尚橋 呂 爽 李紅波,* 許 龍 劉振彬 胡梁斌 莫海珍,*

(1 陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450000)

秦川牛是我國(guó)陜甘寧地區(qū)的優(yōu)勢(shì)畜種，年產(chǎn)肉量在50萬噸以上[1]。秦川牛瘦肉率高、肉質(zhì)鮮嫩，越來越受到消費(fèi)者的喜愛[2]。隨著人們對(duì)秦川牛肉需求的增加，其加工副產(chǎn)物尤其是牛骨產(chǎn)量增大[3]。牛骨占?；铙w質(zhì)量的6%～12%，富含蛋白質(zhì)、脂肪、膠原蛋白及鈣、磷、鐵等礦物質(zhì)，是天然的食藥兼用原料[4]，其開發(fā)利用逐漸被重視[5]。秦川牛骨湯[2]、牛骨膠原蛋白肽[6]、骨粉[7]是牛骨主要的制作方式。由于揮發(fā)性脂肪酸是造成畜骨腥味的主要原因[8]，因此牛骨的開發(fā)利用大都去除油脂，從而造成了資源的極大浪費(fèi)。利用秦川牛骨油開發(fā)高附加值產(chǎn)品、減少環(huán)境污染成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。

牛骨中的脂肪含量大約占12%～20%，含有油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸[9]。研究表明，不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acid, UFA)尤其是n-3多不飽和脂肪酸(n-3 PUFA)在減少神經(jīng)炎癥[10]、預(yù)防心腦血管疾病[11]和治療骨質(zhì)疏松[12]等方面有重要功效。與植物油脂相比，牛骨油不僅具有動(dòng)物油脂特殊的香味，而且富含多種脂溶性維生素、礦物質(zhì)、脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有較大的開發(fā)潛力[13]。呂生華等[14]利用牛等動(dòng)物的骨頭在熬煉骨膠時(shí)所得油脂制備了硫酸化骨油、硫酸化含硅骨油及亞硫酸化骨油加脂劑，開辟了骨油深加工的新途徑。劉文媛等[9]以黃牛骨為原料，采用超聲波輔助水熱法提取牛骨油并對(duì)其進(jìn)行工藝參數(shù)優(yōu)化，同時(shí)對(duì)牛骨油的酸值、過氧化值和脂肪酸組成進(jìn)行分析，提高了骨油提取率并保持較高的骨油品質(zhì)。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)秦川牛腿骨油中的甘油酯及脂質(zhì)組成鮮有研究，因此本研究以秦川牛腿骨為原料，對(duì)牛腿骨油中脂質(zhì)組成進(jìn)行綜合分析并對(duì)部分氧化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，以期為牛骨油的高效利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秦川牛腿骨，購(gòu)自西安市索回德清真食品有限公司；氯仿(≥99.7%)、濃硫酸(98%)、氯化鈉(≥99.5%)、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT, ≥99.8%)均為分析純，天津天力化學(xué)試劑有限公司；正己烷(≥98%)、甲醇(≥99.9%)為色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

FW-100 D高速萬能粉碎機(jī)，天津鑫博得儀器有限公司；KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；JA2003 N電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司；LGJ-10C冷凍干燥機(jī)，青島圣吉儀器系統(tǒng)有限公司；HH-S6L電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；RE100-Pro旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，四環(huán)福瑞科技發(fā)展(北京)有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；MD200-1氮吹儀，杭州奧盛儀器有限公司；7000 D氣相色譜三重四極桿質(zhì)譜儀，北京安捷倫科技有限公司；TSQ Quantiva三重四極桿質(zhì)譜儀，上海賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 油脂提取 將牛腿骨表面的肉剔除，用高速粉碎機(jī)粉碎后冷凍干燥，-20℃冰箱保存待用。

根據(jù)Folch等[15]的方法稍加修改提取秦川牛腿骨的油脂。按照樣品∶有機(jī)溶劑=1∶15的體積比，向樣品中加入一定體積的有機(jī)溶劑(氯仿∶甲醇∶水=2∶1∶0.75，v/v/v)，加入0.005%的2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(butylated hydroxytolyene, BHT)。30℃超聲波(40 kHz，100 W)輔助萃取20 min[16]，靜置分層，真空抽濾收集下層，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40℃下蒸干有機(jī)溶劑。每個(gè)樣品重復(fù)3次萃取。

1.3.2 高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)分析甘油酯組成 參照Wang等[17]的方法，使用配備Phenomenex Luna硅膠柱(內(nèi)徑250 mm × 4.6 mm × 5 μm)、柱溫30℃的正相高效液相色譜(normal-phase high performance liquid chromatography, NP-HPLC，折射率檢測(cè)器)對(duì)?；视臀锓N進(jìn)行分析。流動(dòng)相為正己烷∶2-丙醇∶甲酸(21∶1∶0.003， v/v/v)，流速為1 mL·min-1，進(jìn)樣量為10 μL，每個(gè)樣品的測(cè)試持續(xù)時(shí)間為45 min。

1.3.3 氣相色譜-質(zhì)譜連用(gas chromatography-mass spectromete, GC-MS)分析脂肪酸組成 脂肪酸甲酯化[18]：取20 μL樣品于具塞管中，加入1.5 μL 1%的硫酸甲醇溶液，80℃水浴1 h，并不時(shí)搖晃。冷卻至室溫后，依次加入1 mL飽和氯化鈉溶液、1 mL去離子水、2 mL色譜純正己烷。搖勻后靜置分層，將上層轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中進(jìn)行GC-MS分析。

參照Wendlinger等[18]的方法并稍作修改。采用配備有DB-23色譜柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)的安捷倫7000D三重四極桿GC-MS儀進(jìn)行脂肪酸甲酯分析，全掃描模式(m/z 50～500)下的所有測(cè)量均采用以下程序進(jìn)行：初始溫度為130℃，保持1 min；然后以5℃·min-1的速度升至230℃，保持5 min，總運(yùn)行時(shí)間為26 min。用自動(dòng)進(jìn)樣器以分流模式(1∶20, μL∶μL)進(jìn)樣1 μL。

1.3.4 多維質(zhì)譜“鳥槍法”(multi-dimensional mass spectrometry-based shotgun lipidomics, MDMS-SL)分析脂質(zhì)組成 用200 μL氯仿/甲醇(1∶1，v/v)重新提取樣品(100 mg)中的油脂[19]。脂質(zhì)分析在配備了自動(dòng)納米噴霧離子源的三重四級(jí)質(zhì)譜儀上進(jìn)行，并在Xcalibur系統(tǒng)下運(yùn)行[20]?；谥|(zhì)組學(xué)原則[21]，通過MDMS-SL對(duì)不同脂質(zhì)類別和單個(gè)物種進(jìn)行鑒定和量化。

1.3.5 理化性質(zhì)及氧化穩(wěn)定性測(cè)定 參照《GB/T 5534-2008動(dòng)植物油脂 皂化值的測(cè)定》[22]測(cè)定皂化值，參照《GB/T 5532-2008動(dòng)植物油脂 碘值的測(cè)定》[23]測(cè)定碘值，參照《GB 5009.229-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中酸價(jià)的測(cè)定》[24]測(cè)定酸價(jià)，參照《GB/T 12766-2008動(dòng)物油脂 熔點(diǎn)測(cè)定》[25]測(cè)定熔點(diǎn)，參照《GB/T 26635-2011動(dòng)植物油脂 生育酚及生育三烯酚含量測(cè)定 高效液相色譜法》[26]測(cè)定生育酚及生育三烯酚，參照《GB 5009.227-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過氧化值的測(cè)定》[27]測(cè)定過氧化值，參照《GB/T 21121-2007動(dòng)植物油脂 氧化穩(wěn)定性的測(cè)定(加速氧化測(cè)試)》[28]測(cè)定氧化穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘油酯組成分析

通過HPLC法測(cè)定秦川牛腿骨油中的甘油酯組成及含量(圖1)。結(jié)果表明，樣品中含有豐富的甘油三酯(triqcylglyceride, TAG)(93.84%)，少量的甘油二酯(diacylglycerol, DAG)(2.89%)以及游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)(3.27%)，在秦川牛腿骨油中未鑒定到甘油一酯(monoacylglycerol, MAG)。甘油三酯在人體中起到供給能量、儲(chǔ)存能量以及固定和保護(hù)內(nèi)臟的作用[29]。研究表明，DAG尤其是1,3-甘油二酯(1,3-diacylglycerol, 1,3-DAG)是一種健康的食用油，具有降低血清和肝臟膽固醇含量、降低體內(nèi)甘油三酯水平及減少體內(nèi)脂肪堆積的功效[29]。

圖1 秦川牛腿骨油中的酰基甘油組成Fig.1 Acylglycerol species in the lipids extracted from Qinchuan cattle leg bones

2.2 脂肪酸組成分析

由表1可知，秦川牛腿骨油中的脂肪酸組成較為豐富。通過GC-MS在牛腿骨油中共鑒定到24種脂肪酸，其中飽和脂肪酸(saturated fatty acid, SFA)占總脂肪酸的29.99%，單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid, MUFA)占62.85%，多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PUFA)占2.18%，其他脂肪酸占4.98%。飽和脂肪酸以C16：0(棕櫚酸)和C18：0(硬脂酸)為主，含量分別為19.18%和8.84%；單不飽和脂肪酸以C18：1(油酸)為主，含量達(dá)到57.82%，是秦川牛腿骨油中含量最高的脂肪酸；多不飽和脂肪酸含量最高的是亞油酸，含量為2.03%，還鑒定出少量的α-亞麻酸(0.15%)，兩種脂肪酸均為人體必需脂肪酸。秦川牛腿骨油中的脂肪酸主要是不飽和脂肪酸，具有降低血液粘稠度、預(yù)防心腦血管疾病、提高大腦神經(jīng)細(xì)胞活力等作用。α-亞麻酸屬于n-3多不飽和脂肪酸。有研究表明，服用少量的α-亞麻酸即可使體內(nèi)血壓明顯降低[30]。因此，秦川牛腿骨油在醫(yī)藥方面具有極大的應(yīng)用前景。

表1 GC-MS分析秦川牛腿骨油中的脂肪酸組成Table 1 Fatty acids species in the lipids extracted from Qinchuan cattle leg bones analyzed using GC-MS

2.3 脂質(zhì)組成分析

通過基于多維質(zhì)譜“鳥槍法”(MDMS-SL)對(duì)秦川牛骨油中的脂質(zhì)分子進(jìn)行分析(表2～4)，鑒定到24種?；鈮A(acylcarnitine，ACar)、17種鞘磷脂(sphingomyelin，SM)以及38種磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC)，其中鞘磷脂(35.36 nmol·g-1)和磷脂酰膽堿(22.16 nmol·g-1)的總含量較高，且均屬于磷脂。

2.3.1 ?；鈮A的種類及含量 秦川牛腿骨油中?；鈮A總含量為1.18 nmol·g-1，其中ACar(14：1-OH)和ACar(18：0)的含量最豐富，分別為0.35和0.20 nmol·g-1(表2)。

表2 秦川牛腿骨油中的ACar種類Table 2 ACar species in the lipids extracted from Qinchuan cattle leg bones

2.3.2 鞘磷脂的種類及含量 由表3可知，鞘磷脂中N16：0和N15：0的含量較多，分別為19.25和2.51 nmol·g-1；N20：0的含量最少，僅有0.02 nmol·g-1。 鞘磷脂在高等動(dòng)物組織中含量較豐富，是動(dòng)物細(xì)胞膜及其他各種生物膜的主要組成部分[31]。研究表明，當(dāng)鞘磷脂與膽固醇的微膠溶液濃度相等時(shí)，能夠顯著抑制Caco-2細(xì)胞膽固醇的吸收[31-32]。

2.3.3 磷脂酰膽堿的種類及含量 P16:0～16:0是秦川牛腿骨油中占比最大的一種磷脂酰膽堿，含量達(dá)到3.73 nmol·g-1；而PC(D18:0～22:3)占比最少，僅為0.01 nmol·g-1(表4)。磷脂酰膽堿又稱卵磷脂，具有降低血脂與預(yù)防血管疾病、改善腦及神經(jīng)功能、改善脂類代謝以及抗炎抗氧化的作用。因此卵磷脂含量豐富的秦川牛腿骨油在功能食品的開發(fā)、食品包裝涂膜材料上有廣泛的應(yīng)用前景[33]。

表3 秦川牛腿骨油中的SM種類Table 3 SM species in the lipids extracted from Qinchuan cattle leg bones

表4 秦川牛腿骨油中的PC種類Table 4 PC species in the lipids extracted from Qinchuan cattle leg bones

2.4 理化性質(zhì)及氧化穩(wěn)定性分析

2.4.1 氧化穩(wěn)定性曲線 油脂的自動(dòng)氧化是導(dǎo)致其酸敗變質(zhì)的主要因素。氧化穩(wěn)定性反映油脂抵御自動(dòng)氧化的能力，即可反映油脂的耐貯性。油脂的氧化穩(wěn)定性由誘導(dǎo)期到氧化期之間時(shí)間的長(zhǎng)短決定，誘導(dǎo)時(shí)間越長(zhǎng)，表明油脂的氧化穩(wěn)定性越強(qiáng)。由圖2可知，秦川牛腿骨油的誘導(dǎo)時(shí)間為9.37 h，氧化穩(wěn)定性較強(qiáng)。

圖2 秦川牛腿骨油的氧化穩(wěn)定性曲線Fig.2 Oxidation stability curve of the lipids extracted from Qinchuan cattle leg bones

2.4.2 理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果 酸價(jià)和過氧化值是評(píng)價(jià)油脂性質(zhì)重要的理化指標(biāo)。由表5可知，秦川牛腿骨油脂的酸價(jià)為16.43 mg KOH·g-1，過氧化值為5.22 mmol·kg-1， 碘值為24.84 g·100 g-1。

表5 秦川牛腿骨油的理化指標(biāo)Table 5 Physical and chemical indicators of the lipids in the lipids extracted from Qinchuan cattle leg bones

2.4.3 酚類化合物的測(cè)定結(jié)果 由表6可知，秦川牛腿骨油中具有三種酚類化合物，包括α-生育酚、α-三烯酚和γ-三烯酚，含量分別為2.29、1.75和4.89 mg·kg-1。最近研究發(fā)現(xiàn)，生育三烯酚在抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血壓、抑制心血管炎癥等方面有較好的效果[34]，甚至在某些情況下比α-生育酚更優(yōu)良，且α-生育三烯酚的抗氧化活性是α-生育酚的40～60倍[35]。因此，秦川牛腿骨油可以有效清除脂質(zhì)細(xì)胞膜上的自由基，有一定的抗炎作用。

表6 秦川牛腿骨油中的酚類化合物Table 6 Phenolic compounds of the lipids in the lipids extracted from Qinchuan cattle leg bones /(mg·kg-1)

3 討論

食用油中的甘油三酯含量高達(dá)95%～98%，是主要的營(yíng)養(yǎng)成分，為人體提供能量和必需脂肪酸，其次是甘油二酯和游離脂肪酸[36]。甘油二酯分為1,2-甘油二酯和1,3-甘油二酯兩種異構(gòu)體，其中1,3-甘油二酯在降血脂、減少內(nèi)臟脂肪、抑制體重增加等方面有重要功能[36]。本研究發(fā)現(xiàn)，秦川牛腿骨油中甘油三酯含量約94%，可以被用作一種新的食用油的原料，來維持人體體重以及預(yù)防一些心血管疾病。

邢田等[37]研究了牛油中的脂肪酸組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)飽和脂肪酸含量為52.77%，不飽和脂肪酸為47.23%，其中亞麻酸占1.44%。飽和脂肪酸含量高于不飽和脂肪酸含量，這與本研究的結(jié)論相反。劉文媛等[9]研究發(fā)現(xiàn)牛骨油中的不飽和脂肪酸含量略高于飽和脂肪酸含量，這與本研究結(jié)果相似。說明脂肪酸的檢測(cè)結(jié)果與牛骨油的提取方式以及牛油的來源有密切聯(lián)系[9-11]。牛腿骨油和牛油中含量最高的脂肪酸均為油酸，油酸對(duì)軟化血管有一定的功效，在人體新陳代謝過程中也起著重要的作用[11]。研究表明，食用飽和脂肪酸較高的食物可能會(huì)引起高血脂、高血壓等疾病，而高含量的不飽和脂肪酸會(huì)降低動(dòng)物油脂對(duì)人體的危害[38]。秦川牛腿骨油中不飽和脂肪酸含量遠(yuǎn)高于牛油，約為62%，且含有亞油酸(2.03%)和α-亞麻酸(0.15%)兩種必需脂肪酸。因此，牛腿骨油相較于牛油更健康，在食品和醫(yī)藥方面均有極大的開發(fā)利用潛力。

衛(wèi)海蓮[39]采用超高效液相色譜-飛行時(shí)間-串聯(lián)質(zhì)譜的脂質(zhì)分析方法從青刺果油中鑒定出磷脂、甘油酯和糖脂三大類脂質(zhì)，其中包括21種磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)、13種PC和1種溶血磷脂酰膽堿(lyso-phosphatidylcholine, LPC)等。本研究采用MDMS-SL檢測(cè)牛腿骨油脂質(zhì)組成，檢測(cè)出磷脂、甘油酯以及酰基肉堿，且?；鈮A和磷脂種類較為豐富，這與衛(wèi)海蓮[39]的研究結(jié)果類似。磷脂具有維持人體基本生命活動(dòng)，提高人體免疫力，同時(shí)延緩衰老的作用。秦川牛腿骨油中豐富的磷脂種類及含量使其在保健品、功能食品等健康領(lǐng)域都有極大的利用潛力。

酸價(jià)可作為油脂變質(zhì)程度的指標(biāo)，酸價(jià)越小，說明油脂質(zhì)量、新鮮度和精煉程度越好[40]。本研究檢測(cè)出秦川牛腿骨油酸價(jià)為16.43 mg KOH·g-1，與食用動(dòng)物油的標(biāo)準(zhǔn)相比較高[24]，與何鑫等[41]的研究結(jié)果也不完全一致，可能是由于本研究只是粗提取，未進(jìn)行一系列脫膠、脫酸、脫色和脫臭的油脂精煉過程。過氧化值也能反應(yīng)油脂的酸敗程度[40]。本研究檢測(cè)到的牛腿骨油中的皂化值和碘值與椰子油類似[42]，因此可以進(jìn)一步研究其在緩解骨質(zhì)疏松、抗氧化等方面的作用。而要將秦川牛腿骨油進(jìn)一步加工成食用油，精煉過程是必不可少的。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，秦川牛腿骨油含有豐富的不飽和脂肪酸、酚類化合物、卵磷脂以及少量的甘油二酯和α-亞麻酸，并且具有較強(qiáng)的抗氧化能力，可能在抗炎抗氧化、降壓降血脂等方面有一定的功效。然而，秦川牛腿骨油在功能性食品、醫(yī)藥以及食品涂膜材料上的應(yīng)用還需進(jìn)一步探索。