王廣龍 劉夢婷 王云鵬 任旭琴 陳伯清 熊愛生

(1 淮陰工學院生命科學與食品工程學院，江蘇 淮安 223003；2 淮陰工學院應(yīng)用技術(shù)學院，江蘇 淮安 223003；3 南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院/作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東地區(qū)園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，江蘇 南京 210095)

擴展蛋白(expansin，EXP)又稱膨脹素，是植物細胞壁的重要組成部分。該物質(zhì)可以打斷細胞壁中纖維素與半纖維素的非共價鍵，釋放細胞壁多聚物的機械張力，繼而加強細胞壁的柔韌性，使植物細胞壁松弛和伸展[1-2]。

1992年，在黃瓜(Cucumissativus)細胞壁中首次鑒定得到2個擴展蛋白CsEXP1和CsEXP2。上述蛋白可以在酸性條件下誘導(dǎo)細胞壁的擴展伸長[3]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，擴展蛋白具有一個龐大的基因家族。在植物中發(fā)現(xiàn)的擴展蛋白主要分為4類，包括α擴展蛋白(α-expansin，EXPA)、β擴展蛋白(β-expansin，EXPB)、類擴展蛋白A(expansin-like A，EXLA)和類擴展蛋白B(expansin-like B，EXLB)[4]。目前，在許多植物中已經(jīng)分離得到擴展蛋白基因，如在胡蘿卜(Daucuscarota)中獲得24個DcEXPA基因、4個DcEXPB基因、1個DcEXLA基因和1個DcEXLB基因[5]。其中，以EXPA的研究較為廣泛和深入，其在種子萌發(fā)[6]、果實成熟[7]、花粉管發(fā)育[8]以及產(chǎn)量形成[9]等植物生命活動中發(fā)揮著重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，EXPA除參與上述生命活動外，還參與植物應(yīng)對非生物脅迫的進程。在小麥(Triticumaestivum)中過表達TaEXPA2提高了抗氧化酶的活性，促進了側(cè)根形成，繼而增強了植株對干旱的適應(yīng)性[10]；小麥中的TaEXPA8基因可以調(diào)控抗氧化酶活性以及可溶性蛋白和脯氨酸含量，增強植株在低溫條件下的抗性[11]。在煙草(Nicotianatabacum)中的研究發(fā)現(xiàn)，相對于對照，EXPA4過表達植株在干旱和鹽脅迫下呈現(xiàn)出更好的生長狀態(tài)[12]。楊樹(Populustomentosa)PtoEXPA12基因影響植株對Cd的吸收和積累，同時也改變了植株對Cd毒害的耐受性[13]。

大蒜(AlliumsativusL.)是重要的蔬菜作物，在世界范圍內(nèi)廣泛種植。我國是世界上大蒜種植面積和產(chǎn)量最多的國家，同時也是最大的大蒜消費國[14-15]。但大蒜栽培過程中，容易遭受土壤干旱和鹽漬化等非生物脅迫的侵害。挖掘抗逆基因可提高定向選育效率和水平，為高抗大蒜種質(zhì)創(chuàng)新提供理論依據(jù)。鑒于此，本研究從大蒜中分離擴展蛋白基因AsEXPA8，對其進行序列分析，并檢測其在大蒜不同組織和滲透脅迫下的表達模式，以期為鑒定該基因的生物學功能，以及為改造大蒜抗逆特性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料及處理

供試大蒜品種為蒼山四六瓣，來源于山東蘭陵，蒜瓣一般為4～6片，肉質(zhì)飽滿，質(zhì)地清脆，辣味濃郁，品質(zhì)較高。

將大蒜蒜瓣分別于2017年10月3日和2018年10月12日播種于蛭石和有機質(zhì)組成的混合基質(zhì)(體積比為1∶1)中，分別于20 d(2017年)和16 d(2018年)后將幼苗移至Hogland標準營養(yǎng)液中培養(yǎng)。7 d后進行鹽脅迫(200 mmol·L-1NaCl)和模擬干旱脅迫(15% PEG6000)處理，時間為0、1、4和12 h，分別取5株大蒜的葉片、根和蒜瓣進行液氮凍樣并保存在 -80℃ 超低溫冰箱中，用于后續(xù)分析。其中，葉片取樣選擇第1和第2片葉的中間部位各一半進行混合，根取樣選取所有須根的中間部位進行混合，蒜瓣取樣選取整個種瓣。

1.2 RNA提取及cDNA合成

采用天根生化科技(北京)有限公司的RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒提取大蒜根、葉片和蒜瓣的總RNA，利用南京諾唯贊生物科技有限公司的HiScriptⅡ QRT SuperMix for qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.3 大蒜擴展蛋白基因AsEXPA8的克隆

根據(jù)淮陰工學院設(shè)施蔬菜綠色高效栽培及生理實驗室測定的大蒜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[16]，檢索AsEXPA8基因。設(shè)計克隆引物AsEXPA8-F(5′-A T G A C T A A C T C A T C T A C T G C C C C TT-3′)和AsEXPA8-R(5′-C T A A A T C T G G C T T C C C T C G A A G G TC-3′)，以大蒜蒼山四六瓣cDNA為模板進行擴增。根據(jù)2×Tag Master Mix試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)的說明書進行逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(大連TaKaRa公司)回收和純化，連接pMD19-T載體并轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂于溶菌肉湯(lysogeny broth, LB)平板上培養(yǎng)，挑取單菌落進行菌液PCR驗證，將陽性菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.4 序列分析

采用ExPASy蛋白質(zhì)組分析工具中的ProtParam軟件預(yù)測相對分子量和等電點；通過NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST功能檢索其他植物的EXPA序列，利用MEGA 5.1軟件構(gòu)建同源進化樹；使用DNAMAN 6.0軟件對預(yù)測的AsEXPA8及其他植物的EXPA8氨基酸進行多序列比對；利用Plant-mPLoc server在線軟件預(yù)測亞細胞定位；采用SignalP 5.0軟件進行信號肽預(yù)測分析；采用TMHMM 2.0軟件進行網(wǎng)上運行分析跨膜結(jié)構(gòu)域；使用STRING網(wǎng)站預(yù)測蛋白的相互作用。

1.5 實時熒光定量PCR

以大蒜SAND作為內(nèi)參基因[17]，其表達引物為BD-SAND-F(5′-G C G T C A A C G A A T G T T C C A A T T A C CA-3′)和BD-SAND-R(5′-T C T C T T C A G T C T C A A C T T C A T C A G C AT-3′)。根據(jù)從大蒜中分離的AsEXPA8序列設(shè)計表達檢測引物BD-AsEXPA8-F(5′-C A C G G C G T T G T T C A A T A A T G G A C TT-3′)和BD-AsEXPA8-R(5′-G T A T G C G T T G C T C T G C C A G T T CT-3′)。按照南京諾唯贊生物科技有限公司提供的ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，目的基因相對表達水平用2-ΔΔCt法[18]進行計算。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Office Excel 2019進行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析，并采用Duncan法分析基因表達水平在P=0.05水平上的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜AsEXPA8基因的分離

以大蒜品種蒼山四六瓣cDNA為模板，以AsEXPA8-F和AsEXPA8-R為上下游引物進行擴增，得到一條介于750～1 000 bp的產(chǎn)物(圖1)。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因含有1個774 bp的開放閱讀框，編碼257個氨基酸(圖2)。預(yù)測其蛋白質(zhì)相對分子量為27.75 kDa，理論等電點為7.57。

注：M：DNA分子量標準；1：AsEXPA8基因。Note: M: DNA marker. 1: AsEXPA8 gene.圖1 大蒜AsEXPA8基因的RT-PCR擴增圖譜Fig.1 RT-PCR amplification pattern of AsEXPA8 gene from garlic

注：*表示終止密碼子。Note: * indicate termination codon.圖2 大蒜AsEXPA8基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide acids and deduced amino acid sequences of AsEXPA8 gene from garlic

2.2 大蒜AsEXPA8的進化樹分析

采用MEGA 5.1軟件中將大蒜AsEXPA8和擬南芥(Arabidopsisthaliana)的20個EXPA一同構(gòu)建進化樹(圖3)。結(jié)果顯示，大蒜AsEXPA8與擬南芥的AtEXPA8(NP_181 593.1)在進化關(guān)系上最為接近，并且與AtEXPA2同屬于一個分支。

圖3 大蒜與擬南芥EXPA氨基酸序列的進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of EXPA from garlic and Arabidopsis

2.3 大蒜AsEXPA8的氨基酸序列分析

將大蒜AsEXPA8氨基酸序列與擬南芥的AtEXPA8、萵苣(Lactucasativa)的LsEXPA8(XP_023737376.1)、 大桉(Eucalyptusgrandis)的EgEXPA8(XP_010031088.1)、棉花(Gossypiumhirsutum)的GhEXPA8(XP_016729402.1)和大麻(Cannabissativa)的CsEXPA8(XP_030506062.1)等進行比對(圖4)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，來源于不同植物的EXPA8序列高度保守，序列一致性均高于70%，其中，AsEXPA8與大桉和棉花的EXPA8的一致性高達78.38%。AsEXPA8基因推導(dǎo)的氨基酸序列具有典型的擴展蛋白特征，有1個組氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸(His-Phe-Asp，HFD)基序，N端含有8個保守的半胱氨酸(Cys)殘基，C端含有4個保守的色氨酸(Trp)殘基。

注：紅色橫線表示保守功能結(jié)構(gòu)域；*表示8個保守的半胱氨酸殘基；#表示4個保守的色氨酸殘基。Note: Red lines represent the conserved functional domain. * indicates 8 conserved Cys residues. # indicates 4 Trp residues.圖4 AsEXPA8與其他植物EXPA的氨基酸序列比對Fig.4 Alignment of the deduced amino acid sequences of AsEXPA8 and EXPA from other plants

2.4 亞細胞定位、信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

用Plant-mPLoc server對AsEXPA8進行亞細胞定位預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AsEXPA8主要存在于細胞壁中。用SignalP 5.0檢測到第1到第30個氨基酸的一段信號肽，序列為M T N S S T A P S S K N T L F L F L F S L Y Y L T T S I FA(圖5)。進一步通過ExPASy中的在線工具TMHMM 2.0對AsEXPA8進行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測，結(jié)果表明，在AsEXPA8氨基酸中存在1個跨膜結(jié)構(gòu)域，在第13和第35個氨基酸之間(圖6)。

圖5 大蒜AsEXPA8信號肽預(yù)測分析Fig.5 Signal peptide prediction of garlic AsEXPA8

圖6 大蒜AsEXPA8氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.6 Transmembrane domain prediction of amino acid sequences of the garlic AsEXPA8

2.5 大蒜AsEXPA8的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

通過STRING在線網(wǎng)站，以擬南芥AtEXPA8為模板構(gòu)建了AsEXPA8的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖7)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EXPA8可與細胞壁重構(gòu)相關(guān)的木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶15(xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase protein 15，XTH15)和果膠裂解酶超家族蛋白(pectin lyase-like superfamily protein，AT3G07010/AT5G63180)作用。激素響應(yīng)蛋白如赤霉素調(diào)節(jié)蛋白6(gibberellin-regulated protein，GASA6)、小生長素上調(diào)RNA(small auxin up RNA，SAUR)SAUR26和SAUR15也與EXPA8作用密切。螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(helix-loop-helix，HLH)轉(zhuǎn)錄因子多效唑抗性(paclobutrazol resistance，PRE)蛋白PRE1和PRE5也參與了EXPA8的蛋白作用網(wǎng)絡(luò)(圖7)。

圖7 大蒜AsEXPA8的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測Fig.7 Prediction of protein-protein interaction network of garlic AsEXPA8

2.6 大蒜AsEXPA8基因在滲透脅迫條件下的表達分析

采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測大蒜AsEXPA8基因在模擬干旱脅迫和鹽脅迫條件下的表達特性(圖8)。AsEXPA8在各組織中均可以表達，且鹽脅迫和干旱脅迫均顯著誘導(dǎo)了AsEXPA8轉(zhuǎn)錄水平的變化。

注：A：15% PEG6000； B：200 mmol·L-1 NaCl。相同組織內(nèi)不同字母表示在P<0.05水平差異顯著。Note: A: 15% PEG6000. B: 200 mmol·L-1 NaCl. Different lowercase letters in the same tissue represent significant differences at 0.05 level.圖8 大蒜AsEXPA8基因在模擬干旱脅迫(A)和鹽脅迫(B)下的表達Fig.8 Expression profiles of garlic AsEXPA8 gene under simulated drought stress(A) and salt stress(B)

由圖8-A可知，干旱脅迫處理1 h后，AsEXPA8在蒜瓣中的表達水平升至最高，之后隨著脅迫時間的延長，轉(zhuǎn)錄水平下降；葉片中的AsEXPA8基因表達水平在PEG6000誘導(dǎo)后呈持續(xù)下降的趨勢，至處理12 h時較對照降低了95.79%；根中的AsEXPA8轉(zhuǎn)錄水平在干旱脅迫處理呈先升高后下降的趨勢，并在處理4 h時達到最高。由圖8-B可知，鹽脅迫處理后，AsEXPA8基因在蒜瓣中的表達水平呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢，在處理4 h時最低；在葉片中，AsEXPA8基因在鹽脅迫誘導(dǎo)后迅速下降，之后立即升高，且顯著低于對照；鹽脅迫后根中的AsEXPA8基因表達水平在處理1 h時迅速升至最高，為對照的1.97倍。

3 討論

滲透脅迫指由于環(huán)境因素導(dǎo)致植物不能充分吸水甚至失水的一種現(xiàn)象，會對作物的產(chǎn)量和品質(zhì)造成重大威脅，嚴重時可導(dǎo)致植株死亡。常見的滲透脅迫因素有干旱、鹽害及凍害等[19-20]。細胞壁是細胞抵御外界環(huán)境變化的第一層屏障。研究逆境條件下細胞壁及其重構(gòu)關(guān)鍵基因的響應(yīng)特征對于作物抗逆育種和栽培實踐具有重要意義[21-22]。本研究從大蒜中克隆了1個編碼細胞壁關(guān)鍵組分擴展蛋白的基因AsEXPA8，對其序列特征和在滲透脅迫條件下的表達進行了分析，研究結(jié)果為大蒜等作物抗逆育種提供了理論依據(jù)。

植物中的擴展蛋白一般分為4類，而在大蒜中尚鮮見關(guān)于擴展蛋白結(jié)構(gòu)及其功能的報道。本研究中分離的擴展蛋白屬于EXPA類，含有1個組氨酸功能域HFD基序，8個保守的半胱氨酸(Cys)殘基和4個保守的色氨酸(Trp)殘基，具備擴展蛋白的典型特征。另外，本研究鑒定的AsEXPA8含有一段信號肽，并具有跨膜結(jié)構(gòu)域，這可能與其功能行使具有重要關(guān)系[1-2]。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，本研究鑒定的AsEXPA8可能與其他細胞壁組分共同參與細胞壁重構(gòu)，同時其可能受到赤霉素、生長素和油菜素內(nèi)酯等激素信號的調(diào)控[23-25]，說明激素可通過調(diào)節(jié)植物細胞壁的重構(gòu)，參與植物響應(yīng)逆境的過程，這為改造植物細胞壁結(jié)構(gòu)和特性以及誘導(dǎo)植物抗逆性提供了新的方向。

前人研究表明，擴展蛋白基因在植物體內(nèi)不同組織中具有特異的表達模式。擬南芥中AtEXPA1在保衛(wèi)細胞中特異表達，其可通過控制保衛(wèi)細胞結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)氣孔開度[26]。在向日葵(Helianthusannuus)中的研究發(fā)現(xiàn)，子房、種皮和胚中擴展蛋白基因的特異表達可能與其產(chǎn)量形成密切相關(guān)[27]。本研究中AsEXPA8基因在葉片中表達較高，說明其可能參與大蒜葉片發(fā)育的過程。越來越多的研究表明，擴展蛋白基因可能在植物應(yīng)對外界環(huán)境變化的過程中發(fā)揮重要作用。擬南芥中過表達月季(Rosahybrida)RhEXPA4基因改變了葉片表皮結(jié)構(gòu)、葉綠素含量和側(cè)根生長，繼而提高了植株在逆境環(huán)境條件下的抗性[28]。水稻(Oryzasativa)中的Osexpa7基因可以通過鈉離子轉(zhuǎn)運、活性氧清除以及細胞壁松弛等過程調(diào)控植株在鹽脅迫下的生長[29]。這些研究結(jié)果表明，擴展蛋白可能通過改變細胞壁結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)植株對外界環(huán)境變化的適應(yīng)性。本研究鑒定的AsEXPA8能夠同時響應(yīng)干旱和鹽脅迫，說明其可能參與大蒜植株抵御或適應(yīng)干旱和鹽脅迫的過程。后續(xù)研究可以聚焦于明確該基因的具體功能和作用機制，并挖掘其在大蒜等作物抗逆育種中的潛力。

4 結(jié)論

大蒜AsEXPA8基因開放閱讀框全長774 bp，編碼的蛋白含有257個氨基酸，具有擴展蛋白典型的HFD基序，N端和C端分別含有8個保守的半胱氨酸殘基和4個保守的色氨酸殘基。干旱和鹽脅迫在不同組織內(nèi)均誘導(dǎo)了AsEXPA8基因的表達，說明其可能參與了大蒜植株應(yīng)對滲透脅迫的過程，具體的作用機制仍需進一步鑒定。