費諾亞，陳華民，楊玉文，關 巍，劉寶玉，趙廷昌

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學 沈陽 110866； 2.中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所 北京 100193；3.巴彥淖爾市現(xiàn)代農(nóng)牧事業(yè)發(fā)展中心 內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000）

瓜類細菌性果斑?。˙acterial fruit blotch，BFB）是由西瓜噬酸菌（）引發(fā)的高危種傳細菌性病害，自1965 年首次在美國報道以來，不斷向其他地區(qū)和國家擴散與傳播，近幾年在法國的瓜德羅普島、北馬其頓共和國等又有新的發(fā)現(xiàn)與報道，此外，關于西瓜噬酸菌新寄主番茄和茄子的報道也非常值得關注。西瓜感染該病原菌后，通常子葉葉緣出現(xiàn)水漬狀病斑并沿葉脈發(fā)展，斑點周圍有黃色暈圈。因其發(fā)生重、危害廣、防治難等特點，多年來科研工作者們對西瓜噬酸菌（.）開展了大量研究。筆者對近5 年國外西瓜噬酸菌（.）的主要研究與報道進行了梳理，有助于制定科學有效的瓜類細菌性果斑病防治策略，并且可在一定程度上探明今后的研究方向。

1 西瓜噬酸菌種內(nèi)分化

西瓜噬酸菌于2008 年正式被確立為一個獨立的種，為變形菌門β-變形菌綱噬酸菌屬的一個種。其種內(nèi)可分為3 個亞組，在致病性方面，I 組菌株大多數(shù)分離自葫蘆科的非西瓜寄主，對葫蘆科中的幾種寄主具有中等致病性或強致病性；而Ⅱ組菌株大多數(shù)分離自西瓜，對西瓜致病性強，但對葫蘆科非西瓜寄主致病力弱，且I 組和II 組西瓜噬酸菌無論是在田間自然發(fā)病還是人工接種時都有明顯的西瓜和甜瓜寄主偏好，尤其是在果實組織中更明顯；Ⅲ組為一組弱致病性的菌株，最初發(fā)現(xiàn)于印度。I 組和Ⅱ組均已有代表菌株基因組數(shù)據(jù)上傳至NCBI，在最近的研究中，Yang 等重新組裝了I組菌株M6 的基因組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了一個天然存在的質粒pACM6，而在Ⅱ型菌株目前未發(fā)現(xiàn)有類似的質粒存在。

2 西瓜噬酸菌的檢測

種子傳播是BFB 的重要傳播途徑，因此，種子檢疫與病原菌檢測技術在控制病害中起著重要作用。目前，應用較多的檢測技術多基于PCR 或血清學方法。

2.1 PCR檢測

PCR 是檢測病原菌中最常用的檢測方法之一，在西瓜噬酸菌中有報道的PCR 檢測方法包括傳統(tǒng)PCR、多重PCR、實時熒光定量PCR（qRT-PCR）以及交叉引物核酸恒溫擴增（cross-priming amplification，CPA）等。與其他檢測方法相比，普通PCR 檢測是較快的檢測方式，qRT-PCR 則是人工成本較低的方法，且假陽性概率非常低。近年來，新的引物與PCR 檢測體系不斷被開發(fā)，Slovareva 與Starikova基于編碼PAS 結構域（Per-周期晝夜蛋白-Arnt-芳基烴受體核轉運蛋白-Sim-專一蛋白結構域）S-box 蛋白的序列，開發(fā)了一種新的鑒定西瓜噬酸菌的qPCR 檢測引物PAS F/R 與鑒定方法；Shneider 等基于富亮氨酸重復核糖核酸抑制酶基因（Leucine-rich repeat ribonuclease inhibitor）設計并應用了新的引物AC-1 F/R 對西瓜噬酸菌進行檢測。PCR 檢測還可用于區(qū)分西瓜噬酸菌的不同亞組，Zhao 等利用不同組的特異性檢測引物，建立了雙重PCR 體系用于檢測樣品中I 組和Ⅱ組西瓜噬酸菌的分布情況。

2.2 血清學檢測

基于免疫反應的檢測方法在西瓜噬酸菌上的應用也有報道，但傳統(tǒng)免疫學方法在靈敏度與準確度方面有一定欠缺，在現(xiàn)代成像技術的加持下，免疫學檢測技術的靈敏度與準確性被不斷推上新的峰值。側向流動免疫分析（lateral flow immunoassays，LFA）快速檢測試劑盒可以提供半定量結果，提高可重復性，并減少誤差。Saisin 等通過手動優(yōu)化圖像采集設備的參數(shù)，如相機曝光時間等，與自動模式設置相比，將西瓜噬酸菌LFA 的檢測限和靈敏度分別提高了3 倍和5 倍。

2.3 拉曼高光譜成像檢測

除上述常見的檢測方法外，研究人員也對其他一些檢測方法進行了嘗試，Hoonsoo 等認為拉曼高光譜成像技術在檢測西瓜噬酸菌種子帶菌方面具有較大的潛力，利用400～1800 cm范圍內(nèi)的拉曼高光譜成像數(shù)據(jù)，分析確定1 076.8 cm和437 cm處的2 條譜帶可作為區(qū)分病菌感染種子和健康種子的最佳拉曼峰，具有快速、準確和非破壞性的優(yōu)點。

3 西瓜噬酸菌的致病機制

雖然瓜類細菌性果斑病目前危害嚴重，但對致病菌致病機制的研究尚未形成完善的網(wǎng)絡。深入了解西瓜噬酸菌致病過程，解析其致病機制，是研發(fā)靶向制劑及制定針對性防治策略的重要基礎，也是防治果斑病的必由之路。近年來，國外對西瓜噬酸菌致病機制的研究主要集中在三型分泌系統(tǒng)、菌毛等關鍵致病因子方面。

目前，已經(jīng)證明西瓜噬酸菌的三型分泌系統(tǒng)（Type Ⅲsecretion system，T3SS）是其關鍵致病因子，但其天然寄主西瓜由于遺傳操作困難，在寄主與T3SS 的互作研究中，很難應用西瓜作為互作對象，嚴重限制了西瓜噬酸菌T3SS 的進一步研究。但隨著煙草（species）被證明可作為西瓜噬酸菌的寄主并用于研究西瓜噬酸菌T3SS 在寄主中的作用機制，T3SS 效應蛋白（T3SS effectors，T3Es）及其作用靶標逐漸被發(fā)掘?；贏raC 型轉錄調(diào)節(jié)因子HrpX 對T3Es 編碼基因的調(diào)控以及生物信息分析，Jiménez-Guerrero 等初步篩選到了7 個候選T3Es。2018 年，Rosenberg 等發(fā)現(xiàn)功能型Ⅳ菌毛（Type Ⅳpilus，T4P）是西瓜噬酸菌致病的重要因素之一，通過T4P 轉座子突變體文庫鑒定了多個突變體的表型，并對T4P 相關基因功能進行了研究，所有突變體均在定殖能力、致病能力及生物膜形成能力等方面弱于野生型M6。Kim 等證實了.中一個假定的雙功能分支酸變位酶/預苯酸脫水酶CmpAc 和假定的Glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase（GlpdAc）均與西瓜噬酸菌的毒力相關，且證明了GlpdAc 參與甘油代謝等。

4 瓜類細菌性果斑病的防治方法

現(xiàn)階段，瓜類細菌性果斑病尚無商品化的、有推廣價值的抗病品種，當前的很多抗性育種材料仍處于試驗階段或小范圍應用中，主要的防治方法仍是農(nóng)業(yè)防治、化學防治與生物防治等。

4.1 農(nóng)業(yè)防治

硅肥被廣泛應用于農(nóng)業(yè)防治，含硅礦渣肥的施用使甜瓜的果斑病的病情指數(shù)顯著降低了14%，發(fā)生率降低了12%，改善了土壤肥力、植株生長和營養(yǎng)狀況，果肉厚度增加了8%，可溶性固形物含量增加了7%。同時，試驗中也發(fā)現(xiàn)甜瓜不同雜交種之間的硅積累沒有差異。一些傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)防治手段經(jīng)當代分子生物學技術的揭示，對其有效性與作用機制都有了新的解讀。Zhao 等研究了溫度對西瓜噬酸菌定殖的影響，結果發(fā)現(xiàn)，與持續(xù)在28 ℃下培養(yǎng)相比，在28 ℃下播種并在接種后3 d 后轉移到40 ℃下的種子果斑病發(fā)病率與帶菌數(shù)量均顯著降低；但溫度升高對BFB 幼苗傳播率降低的影響是可逆的，將種子從40 ℃再次轉至28 ℃培養(yǎng)，果斑病發(fā)病率重新升高；且在接種后的前3 d，西瓜噬酸菌對溫度最敏感。

4.2 化學防治

化學防治和種子處理仍是果斑病比較有效的防治方法，研究表明，利用ClO等進行種子處理可在對種子較安全的情況下有效減少種子的帶菌量，但一些藥劑如銅離子制劑處理可造成西瓜噬酸菌進入存活而不可培養(yǎng)狀態(tài)（VBNC），若后續(xù)條件適宜，仍有復蘇的可能。乙酸和丙酸蒸氣（100 mg·L；50 ℃；相對濕度43%或85%）處理1 h 即對西瓜噬酸菌有顯著的抑菌活性，且不會顯著影響種子的發(fā)芽率。

4.3 生物防治

針對瓜類細菌性果斑病的生物防治也有諸多研究，目前已有多種生防菌株及其代謝產(chǎn)物被證明對西瓜噬酸菌有抑制效果，熒光假單胞菌（）、枯草芽孢桿菌（）、溶磷細菌伯克氏菌（sp.）、棲稻假單胞菌（）等及異常畢赤酵母菌（）都可一定程度降低病害發(fā)生率，噬菌體也被認為是潛在的生防材料。Rahimi-Midani 等利用從西瓜、甜瓜和南瓜中采集的樣品分離的噬菌體建立了一種潛在的BFB 生物防治方法。其研究結果表明，未經(jīng)噬菌體處理的種子接種西瓜噬酸菌后表現(xiàn)為不萌發(fā)或萌發(fā)后出現(xiàn)BFB 癥狀，相比之下，噬菌體包衣的西瓜種子在接種西瓜噬酸菌后可健康發(fā)芽的比例高達90%。另外，一些生防菌株的代謝產(chǎn)物如哈茨木霉產(chǎn)生的賴氨酸-α-氧化酶、新赤殼屬的菌株（sp.）產(chǎn)生的萘醌類物質也對西瓜噬酸菌有抑制作用，基于比較基因組學等方法，其生防機制也逐漸清晰。但并非所有的生防菌都適用于西瓜噬酸菌，捕食性細菌蛭弧菌及其類似物（and like organisms，BALOs）會大量捕食其他細菌且殺菌譜較廣。近期研究發(fā)現(xiàn)，西瓜噬酸菌對蛭弧菌具有一定抗性，Aharon 等通過對西瓜噬酸菌菌株M6 的文庫建立與篩選，發(fā)現(xiàn)了西瓜噬酸菌編碼微小假菌毛蛋白的基因在其對噬菌蛭弧菌（）的抗性方面起重要作用，且與II 型分泌系統(tǒng)相關。

4.4 抗病育種

目前市場上仍未發(fā)現(xiàn)具有較高商業(yè)價值的瓜類細菌性果斑病抗病品種，因此抗性材料的挖掘是目前瓜類細菌性果斑病抗病育種的首要任務。雖然尚無有價值的抗性材料投入到實際生產(chǎn)中，完全免疫瓜類細菌性果斑病的種質資源還未發(fā)現(xiàn)，但最近報道的瓜類對西瓜噬酸菌抗性相關QTL 為今后抗性品種的發(fā)掘與培育指明了方向。Islam 等通過生物測定和表達分析，鑒定了甜瓜基因組中6 個可能的抗BFB 候選R 基因。經(jīng)進一步功能驗證后，這些基因可以通過育種和生物技術手段靶向操縱以提高甜瓜BFB 抗性。從491 個分離的F甜瓜個體中確定了BFB 抗性的遺傳模式，這些個體由BFB抗病（PI 353814）和感?。≒I 614596）親本雜交，F(xiàn)代均產(chǎn)生抗性，F(xiàn)代抗病和感病表型分離比例為3∶1。結果表明，BFB 抗性由1 個單基因顯性基因控制。在對57 個瓜類抗病相關基因的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，只有在抗病和感病親本之間顯示多態(tài)性的基因（編碼TIR-NBS-LRR 結構域）被認為是進一步研究的良好候選基因，該基因上顯示出多個InDels和SNPs，基于感病材料的一個插入InDel 標記設計的MB157-2，能夠在491 個F代和22 個地方品種/自交系材料中區(qū)分抗病和感病材料，檢測準確率分別為98.17%和100%。這一基于PCR 的新型共顯性InDel 標記為分子輔助育種提供了一種實用工具，旨在開發(fā)抗BFB 的甜瓜品種。Assun??o 等鑒定了在不同物候期對細菌性果斑病具有遺傳抗性的甜瓜材料，其中材料I-136 和A-43 表現(xiàn)出高水平的抗性，其果實沒有出現(xiàn)果斑病癥狀，.的種子傳播率僅為0.6%（I-136）和2.5%（A-43），可以作為果斑病抗性基因的親本供體。

4.5 綜合防治

Azman 等綜述了近年來瓜類細菌性果斑病在診斷與防治方面的研究結果，可更好地了解這種病害，提出了種子處理-清除病原-抗性品種-種子健康測定-化學防治（Seed treatment-Pathogen exclusion-Resistant cultivar-Seed health testing-Chemical control）五位一體的防控模式，為制定最有效和可持續(xù)的BFB 控制策略提供指導。Shirakawa 團隊報道了該病害在日本的首次發(fā)生，并對其防控相關技術進行了研究和開發(fā)，基于已有的研究結合日本及中國瓜類的實際種植情況提出了從引種到田間栽培期間的一系列果斑病的防控措施。

5 展 望

近年來，瓜類細菌性果斑病在病原菌檢測、致病機制以及防治等方面的研究取得了很大進展。目前，國外多名學者在進行針對關鍵致病因子Ⅲ型分泌系統(tǒng)（Type Ⅲsecretion system，T3SS）的研究。相當長一段時間內(nèi)，T3SS 的機制研究都受限于寄主西瓜遺傳操作體系的不成熟，但隨著美國弗吉尼亞理工大學Traore 等證明模式植物煙草可作為西瓜噬酸菌的寄主并用于研究西瓜噬酸菌T3SS 在寄主中的作用機制，Ⅲ型效應蛋白的鑒定工作方面的瓶頸正逐漸被突破，越來越多的Ⅲ型效應蛋白陸續(xù)被報道，使得后續(xù)Ⅲ型效應蛋白在寄主中的靶標及相關互作研究成為可能。這也是今后西瓜噬酸菌致病機制研究的重要內(nèi)容。以色列希伯來大學的Burdman 教授團隊，基于調(diào)節(jié)因子HrpX 對西瓜噬酸菌I組菌株M6 中的T3Es 進行了大量的分析與預測，并在后續(xù)研究中對預測到的T3Es 進行了鑒定等工作。美國佐治亞大學的Walcott 教授團隊在西瓜噬酸菌的不同組的分型與鑒定方面有較多成果，包括不同組的寄主偏好、遺傳特性和分組方法等，為國內(nèi)外的其他研究者提供了大量參考。其他一些國家例如日本和韓國的學者對各類型致病因子的研究也使得西瓜噬酸菌的致病相關調(diào)控網(wǎng)絡更加明晰，其他一些致病相關基因也豐富了人們對其致病機制的理解。國內(nèi)與國外各研究團隊對果斑病與西瓜噬酸菌的研究各有側重，但同時也有可以互相借鑒之處，綜合各團隊對果斑病的研究進展，可以對果斑病有更全面的了解。雖然對西瓜噬酸菌與瓜類細菌性果斑病的研究相對于其他植物病原細菌仍比較滯后，但在現(xiàn)有的研究基礎上通過不懈的努力，將能夠解開更多關于西瓜噬酸菌的謎題，并對瓜類細菌性果斑病有更全面的認知。

由于西瓜噬酸菌以種子攜帶形式，通過種子運輸?shù)确绞竭M行短距離與長距離傳播，因此，對種子的檢疫工作非常艱巨且十分重要，已開發(fā)的多種檢測技術能為種子檢測提供技術支持。在病害防治方面，瓜類細菌性果斑病應用較多的仍是化學防治，使用藥劑對種子進行處理是目前應用較廣且行之有效的防治方法之一，針對該病害發(fā)生的現(xiàn)狀，篩選出更多安全有效的藥劑，將對今后藥劑的輪換使用有指導意義。植物抗病性的利用和生物防治手段的開發(fā)是更安全的防治果斑病的手段，成為了近年來研究的熱點，目前，雖然已經(jīng)挖掘了部分針對西瓜噬酸菌的抗性材料與生防菌株，具有一定的應用前景，但從試驗到應用仍有很長的路要走。為實現(xiàn)瓜類細菌性果斑病在生產(chǎn)上的高效防治，對果斑病菌致病機制的揭示、商品化抗性品種的篩選以及生物防治的機制等研究仍需繼續(xù)探索。