張志飛 胡璨 杜永洪 楊敏

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的世界上第二大傳染病，2020年全球新發(fā)結(jié)核病患者約990萬，與結(jié)核病感染直接相關(guān)死亡患者約161.4萬［1-2］。結(jié)核病治療的特殊性和難治性主要在于MTB細胞壁含有大量脂質(zhì)，結(jié)構(gòu)致密，且感染后易形成纖維病灶并包裹形成結(jié)核球，導(dǎo)致藥物難以進入MTB菌體內(nèi)發(fā)揮有效的殺菌作用［3-4］。研究［5-6］表明，超聲輻照能提高細胞膜通透性，其所致的聲孔效應(yīng)可使細胞膜表面產(chǎn)生臨時通道，為藥物進入細胞內(nèi)創(chuàng)造了有利條件，可增強多種細菌對抗菌藥物的敏感性，從而提高殺菌效果。另一方面，納米載藥遞送系統(tǒng)通過藥物在靶組織的緩釋作用，具有提高藥物療效、減少藥物用量、降低毒副作用等優(yōu)點，在抗腫瘤、高耐藥率（如多藥耐藥細菌）和生物膜相關(guān)感染的治療中備受關(guān)注［7-8］?？ń槊纾˙acillus Calmette-Guerin，BCG）是一種減毒牛結(jié)核分枝桿菌活株，與MTB具有相似的細胞壁結(jié)構(gòu)和成分，常被用于替代MTB的基礎(chǔ)研究［9］。本實驗選擇藥物作用靶點在MTB細胞內(nèi)的抗結(jié)核藥左氧氟沙星（levofloxacin，LEV），應(yīng)用聚乳酸-羥基乙酸（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）共聚物高分子材料制備載LEV緩釋納米粒（levofloxacin nanoparticles，LEV-NPs），旨在探討超聲介導(dǎo)LEV-NPs對減毒牛結(jié)核分枝桿菌的體內(nèi)外增效殺菌作用。

材料與方法

一、主要實驗動物、材料及儀器

1.實驗動物：健康雌性SD大鼠20只，6～8周齡，體質(zhì)量約200 g，來自重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。

2.主要材料：BCG菌株凍干粉購自成都生物產(chǎn)品研究所（批號：S20013057）。聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA-COOH）購自濟南岱罡生物科技有限公司；4%聚乙烯醇、2%異丙醇、7H9肉湯培養(yǎng)基、甘油、OADC增菌液、活細菌/死細菌雙染（SYTO 9/PI）試劑盒均購自美國Sigma公司。

3.主要儀器：低頻低強度超聲治療儀（蘇州工業(yè)園區(qū)海納科技有限公司），換能器直徑45 mm，固定頻率42 kHz，輸出聲強0.15～0.60 W/cm2；馬爾文激光粒度儀（3000 HS，英國Malvern公司）；激光共聚焦顯微鏡（A1+/A1R+，日本Nikon公司）；場發(fā)射掃描電鏡（SU 8010）和透射電鏡（H-7500）均購自日本Hitachi公司；紫外可見分光光度計（Nano Drop 2000，美國Therm Scientific公司）。

二、實驗方法

1.BCG培養(yǎng)及最小抑菌濃度檢測：將BCG菌株凍干粉復(fù)蘇后，接種于7H9肉湯培養(yǎng)基中，3周后離心重懸收集菌液，調(diào)整菌液濃度為107CFU/ml備用。按照美國國家實驗室標準委員會抗菌藥物敏感性試驗操作標準檢測LEV對BCG的最小抑菌濃度。

2.LEV-NPs的制備及物理特性檢測：采用雙乳化法制備LEV-NPs。將40 mg PLGA-COOH完全溶于2.0 ml三氯甲烷形成有機相，加入0.2 ml LEV水相，采用聲震儀聲震60 s形成初乳，然后加入4%聚乙烯醇，聲震150 s形成復(fù)乳，再加入6.0 ml 2%異丙醇，室溫下磁力攪拌3～6 h后，離心、洗滌收集得到LEV-NPs。采用馬爾文激光粒度儀檢測LEV-NPs的粒徑和Zeta電位；場發(fā)射掃描電鏡和透射電鏡觀察LEV-NPs的形態(tài)和結(jié)構(gòu)；紫外可見分光光度計檢測LEV-NPs的載藥率、包封率。

3.LEV-NPs藥物釋放情況：采用透析袋法檢測LEV-NPs在自然條件下及超聲輻照后下的藥物累計釋放量。稱取20 mg LEV-NPs干粉溶于2 ml PBS緩沖液中，采用聲強0.15 W/cm2的超聲輻照10 min，然后將樣品轉(zhuǎn)移到透析袋中。將透析袋放入含有25 ml PBS緩沖液的燒杯中，在37℃下以120 r/min的速度搖動燒杯，使燒杯中的溶液均勻化。在預(yù)定的時間點（0、2、4、8、10、12、24、48、60、72 h）取2 ml透析液，在燒杯中加入等量體積的PBS緩沖液。使用紫外可見分光光度計測量303 nm處LEV的吸收值，計算LEV累積釋放率，公式為：LEV累積釋放率=（PBS緩沖液中的LEV量/LEV-NPs中的LEV總量）×100%。

4.體外實驗分組及方法：將制備好的BCG菌液加入30 mm培養(yǎng)皿中，隨機分為4組：①LEV組，加入1 ml LEV，調(diào)整培養(yǎng)皿內(nèi)最終濃度為4.0 μg/ml（此濃度為LEV對BCG的最小抑菌濃度）；②超聲聯(lián)合LEV組，加入1 ml LEV，調(diào)整培養(yǎng)皿內(nèi)最終濃度為4.0 μg/ml，然后立即經(jīng)超聲輻照；③超聲聯(lián)合LEV-NPs組，加入1 ml LEV-NPs，調(diào)整培養(yǎng)皿內(nèi)藥物最終濃度為4.0 μg/ml，然后立即經(jīng)超聲輻照；④對照組，加入1 ml PBS緩沖液。超聲聯(lián)合LEV組和超聲聯(lián)合LEV-NPs組的超聲輻照方法一致，均于培養(yǎng)皿底部均勻涂抹耦合劑，平面換能器緊貼培養(yǎng)皿底部，輻照參數(shù)均為聲強0.15 W/cm2，連續(xù)輻照10 min。實驗處理24 h后，采用平板菌落培養(yǎng)計數(shù)法檢測各組活菌落數(shù)，計數(shù)結(jié)果經(jīng)Log10對數(shù)處理后進行統(tǒng)計學(xué)處理。應(yīng)用SYTO 9/PI試劑盒對各組細菌進行染色標記，其中SYTO 9可將活菌標記為綠色熒光，而PI可與死菌DNA結(jié)合顯示為紅色熒光，于激光共聚焦顯微鏡下觀察各組BCG活死菌變化情況。取各組菌液制成爬片，沿孔壁加入固定液，4℃冰箱保存，于場發(fā)射掃描電鏡下觀察BCG表面結(jié)構(gòu)。

5.體內(nèi)實驗建模、分組及方法：選取20只健康雌性SD大鼠，右側(cè)臀部常規(guī)脫毛消毒，皮下注射濃度為107CFU/ml的BCG菌液1 ml，注射14 d后觀察注射部位局部凸起情況，取組織行抗酸染色，以組織中見紅色桿狀BCG細菌即證實皮下BCG結(jié)核肉芽腫模型成功建立。將成功建模的SD大鼠隨機分為4組：①LEV組，皮下局部注射1 ml LEV（濃度為5.0 mg/ml）；②超聲聯(lián)合LEV組，皮下注射1 ml LEV（濃度為5.0 mg/ml）后立即經(jīng)超聲輻照；③超聲聯(lián)合LEV-NPs組，皮下注射1 ml LEV-NPs（藥物濃度為5.0 mg/ml）后立即經(jīng)超聲輻照；④對照組，皮下注射1 ml生理鹽水。超聲聯(lián)合LEV組和超聲聯(lián)合LEV-NPs組的超聲輻照參數(shù)一致，均為聲強0.15 W/cm2，連續(xù)輻照10 min。在治療后第3、7、14天分別測量各組大鼠皮下BCG結(jié)核肉芽腫體積，計算并比較各組治療效果。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用Graph Pad Prism 9.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、LEV-NPs的物理特性和藥物釋放情況

鏡下見制備好的LEV-NPs呈球形，大小均一，分散性良好，LEV成功包載入納米粒內(nèi)部。見圖1。LEV-NPs粒 徑 為（282.42±3.55）nm，Zeta電 位 為-（20.40±0.63）mV，載藥率、包封率分別為6.21%、65.30%。LEV-NPs在24、48、72 h自然條件下LEV累計釋放率分別為31.2%、45.7%、46.9%；超聲輻照后24、48、72 h時LEV累計釋放率增加，分別為42.7%、65.0%、67.7%。見圖2。

二、體外實驗各組BCG細菌活性及其表面結(jié)構(gòu)

1.各組細菌活性檢測結(jié)果見圖3。對照組、LEV組、超聲聯(lián)合LEV組、超聲聯(lián)合LEV-NPs組活菌落數(shù)分別為：（7.50±0.34）Log10CFU/ml、（5.98±0.08）Log10CFU/ml、（4.58±0.36）Log10CFU/ml、（1.96±0.03）Log10CFU/ml；其中超聲聯(lián)合LEV-NPs組細菌活性下降最明顯，菌落存活率約26%，低于LEV組及超聲聯(lián)合LEV組（80%、61%），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。

2.各組活死菌變化情況見圖4。對照組及LEV組中以綠色熒光為主，提示活菌落更多；超聲聯(lián)合LEV組中菌落分散，死菌明顯增多；超聲聯(lián)合LEV-NPs組可見視野下呈明亮的紅色熒光，以死菌為主，僅見少量活菌落。

3.各組細菌表面結(jié)構(gòu)變化見圖5。對照組中細菌呈桿狀，形態(tài)完整，聚集分布；LEV組細菌聚集性降低，少量菌體結(jié)構(gòu)不完整，提示細菌受到一定損傷；超聲聯(lián)合LEV組細菌分散，菌體結(jié)構(gòu)破壞嚴重，視野下可見較多斷裂菌體；超聲聯(lián)合LEV-NPs組細菌數(shù)量明顯減少，菌體伸展、斷裂，細菌損傷情況最嚴重。

三、體內(nèi)實驗各組皮下BCG結(jié)核肉芽腫體積變化

各組大鼠治療后皮下BCG結(jié)核肉芽腫體積變化見圖6，7。肉眼觀可見超聲聯(lián)合LEV-NPs組治療后結(jié)核肉芽腫體積較其他各組明顯減小。連續(xù)測量各組治療后結(jié)核肉芽腫體積，結(jié)果顯示：對照組結(jié)核肉芽腫體積在第14天較治療前增加約2倍；LEV組結(jié)核肉芽腫體積在第14天未見明顯減?。怀暵?lián)合LEV組結(jié)核肉芽腫體積呈下降趨勢，在第14天較治療前減小約18%；超聲聯(lián)合LEV-NPs組結(jié)核肉芽腫體積減小最明顯，在第14天體積約79 mm3，較對照組減小約80%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

討 論

結(jié)核病防治是世界性重大公共衛(wèi)生問題，特別是多重耐藥結(jié)核病和廣泛耐藥結(jié)核病使臨床治療面臨嚴峻挑戰(zhàn)［10］。研究［4］發(fā)現(xiàn)有兩種機制被認為與天然耐藥有關(guān)，即MTB細胞壁通透性屏障和活性多藥外排泵基因表達。隨著對MTB生物學(xué)認識的深入，改變致密細胞壁結(jié)構(gòu)、增強藥物滲透性是抑制日益增加的結(jié)核耐藥的關(guān)鍵［11］。

超聲作為一種微無創(chuàng)技術(shù)已在多種疾病診療中得到廣泛應(yīng)用。其中低頻低強度超聲已被證實對皮膚、實體腫瘤等宏觀組織及細胞膜、細胞壁等微觀結(jié)構(gòu)具有明顯的促滲作用［12］。此外，其安全性亦不可忽視，本課題組前期通過交叉試驗篩選出聲強0.15 W/cm2的超聲波連續(xù)輻照10 min對皮膚無明顯病理結(jié)構(gòu)損傷，同時具有良好的促滲作用［13］。由于超聲可以改善載藥納米粒在特定位置的釋放潛力，載藥納米粒獲得適當(dāng)?shù)某暡芰亢笃渌幬镝尫拍芰︼@著提高［14］。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，制備的LEV-NPs物理特性穩(wěn)定，載藥率、包封率分別為6.21%、65.30%。自然條件下LEV-NPs在24、48、72 h的LEV累計釋放率分別為31.2%、45.7%、46.9%，表明LEV-NPs具有明顯的藥物緩釋特性。超聲輻照后24、48、72 h時LEV累計釋放率增加，分別為42.7%、65.0%、67.7%，表明超聲輻照可促進納米粒中藥物的釋放，提高緩釋效率，有效增加局部感染區(qū)的藥物含量。另一方面，納米粒是有效的外源性空化核，在超聲促發(fā)納米粒爆破的過程中，更多的空泡膨脹坍塌所產(chǎn)生的激波和微射流是產(chǎn)生“聲孔”促進藥物滲入的根本原因［15］。本實驗中超聲聯(lián)合LEV-NPs組利用超聲促進緩釋型載藥納米粒加速釋藥，并通過聲孔效應(yīng)促進藥物滲入，在體內(nèi)外實驗中表現(xiàn)出的抗菌效果均顯著高于其余各組，表明二者具有協(xié)同增效殺菌作用。

本實驗探討了超聲介導(dǎo)LEV-NPs對減毒牛結(jié)核分枝桿菌的體內(nèi)外增效殺菌作用，體外實驗結(jié)果顯示超聲聯(lián)合LEV-NPs組細菌分散、菌體結(jié)構(gòu)破壞，細菌活性下降最明顯，菌落存活率僅26%。同時使用激光共聚焦顯微鏡觀察各組活死菌含量結(jié)果可知，超聲聯(lián)合LEV-NPs組殺菌效果也優(yōu)于其余各組，證實了低頻低強度超聲可有效提高LEV-NPs抗菌療效，具有顯著的協(xié)同藥物增效作用。另外，在治療大鼠皮下BCG結(jié)核肉芽腫實驗中，超聲聯(lián)合LEV-NPs組結(jié)核肉芽腫體積減小最明顯，較對照組體積減小約80%，表明超聲聯(lián)合LEV-NPs可明顯抑制結(jié)核肉芽腫生長。

前期研究［16］結(jié)果證實，超聲增強納米粒修飾的藥物傳遞是一個復(fù)雜的過程，受各種物理參數(shù)的影響，其動力學(xué)過程復(fù)雜且激烈。在超聲輻射力和聲流的作用下納米粒產(chǎn)生瞬態(tài)空化，提高了細胞壁通透性，從而增加藥物進入MTB菌體內(nèi)的濃度［17-18］，由此推測超聲瞬態(tài)空化產(chǎn)生的臨時“遞藥通道”為藥物遞送提供了快速途徑。實際上這種瞬態(tài)空化是指在聲波的負壓半周期內(nèi)空化核（微小氣泡）迅速膨脹，隨后又在聲波正半周期內(nèi)氣泡被壓縮以至崩潰。而納米粒的存在更降低了這種超聲瞬態(tài)空化的閾值。由此可見，超聲增強載藥納米粒在促進藥物進入菌體方面顯示出巨大的潛力，同時利用納米粒的藥物緩釋特性，可以實現(xiàn)抗結(jié)核藥物靶向運載、持續(xù)治療，降低游離藥物毒副作用，有望縮短結(jié)核病治療療程，提高耐藥結(jié)核病的藥物治療效果，為結(jié)核病治療帶來新的突破。

綜上所述，本實驗成功制備了LEV-NPs，并驗證了超聲介導(dǎo)LEV-NPs可顯著提高對體內(nèi)外BCG的殺菌效果，二者具有協(xié)同增效作用，為臨床耐藥結(jié)核病的治療提供新的思路。