張仲敏，連振清，劉麗晶，杜鋮豪，王超

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，廣西 南寧，530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 瑞康臨床醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧，530001;3. 廣西中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧，530200；4.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結(jié)合轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧，530200)

酸藤子為紫金牛科植物酸藤子Embelialaeta(L.) Mez.的干燥根，又名青龍鉆、酸藤木、挖不盡、入地龍、酸藤果，在我國東南部至西南部均有分布，全年均可采，切段、曬干入藥。廣西瑤藥有“五虎、九牛、十八鉆、七十二風(fēng)”等說法，其中酸藤子就是七十二風(fēng)之一的風(fēng)打相兼藥，其瑤藥名為酸吉風(fēng)，味酸、澀，平，歸心、脾、肝經(jīng)?！吨袊F(xiàn)代瑤藥》《中華本草》均記載了酸藤子具有清熱解毒、活血散瘀、祛風(fēng)收斂、健脾安胎的功效，主要用于口腔炎、咽喉炎、慢性腸炎、風(fēng)濕痛、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等炎癥疾病[1-2]?，F(xiàn)代研究表明，酸藤子中富含糖苷類、有機(jī)酸、黃酮類、多酚類、萜類化合物[3]，這些成分可能是酸藤子藥理作用的重要效應(yīng)成分，由于目前對酸藤子的效應(yīng)物質(zhì)研究較少，嚴(yán)重制約著酸藤子的開發(fā)利用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過系統(tǒng)生物學(xué)、基因組學(xué)、蛋白組學(xué)等多學(xué)科整合以發(fā)現(xiàn)藥物作用的靶點(diǎn)和分子機(jī)制。其整體性和系統(tǒng)性與中藥多成分、整體性的觀點(diǎn)是相似的，近年來被廣泛應(yīng)用于中藥藥效基礎(chǔ)、作用機(jī)制、中藥毒性等研究[4-7]。分子對接技術(shù)可以針對已知結(jié)構(gòu)的靶蛋白進(jìn)行分子間相互作用識別并預(yù)測受體-配體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)[5,8-9]。本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析瑤藥酸藤子活性成分抗炎的靶點(diǎn)及相關(guān)通路，并運(yùn)用分子對接技術(shù)分析核心成分與靶點(diǎn)之間的結(jié)合能力，為瑤藥酸藤子的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 收集炎癥相關(guān)靶點(diǎn)

利用Gene Cards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)，NCBI的Gene數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)，CTD數(shù)據(jù)庫(http://ctdbase.org/)分別輸入“inflammation”關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索。其中，Gene Cards數(shù)據(jù)庫和CTD數(shù)據(jù)庫選取分值靠前的5 000條數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。3個(gè)數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果取交集并用Uniprot ID 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化獲得炎癥相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2 收集活性成分相關(guān)靶點(diǎn)

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP, https://www.tcmsp-e.com/)中沒有收錄酸藤子的藥物信息，通過查閱文獻(xiàn)獲取酸藤子的活性成分[3]。在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索活性成分名稱，并利用口服利用度(OB)≥30%和藥物相似性(DL)≥0.18為條件篩選[5,9]，符合篩選條件的活性成分納入研究。將篩選到的活性成分在PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中檢索并找到對應(yīng)的SMILES編號，利用SMILES編號在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)中對活性成分的靶點(diǎn)進(jìn)行檢索，并對檢索的結(jié)果進(jìn)行去重即為酸藤子活性成分的靶點(diǎn)。

1.3 篩選活性成分與炎癥共有靶點(diǎn)

將炎癥相關(guān)靶點(diǎn)與酸藤子活性成分靶點(diǎn)取交集制作韋恩圖得到酸藤子抗炎的潛在靶點(diǎn)。用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建酸藤子活性成分-炎癥潛在靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用STRING(https://www.string-db.org/)數(shù)據(jù)庫構(gòu)建酸藤子抗炎潛在靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)圖。選擇“Multiple proteins”，然后將蛋白質(zhì)名稱錄入檢索框，物種選擇“Homo sapiens”，可信度選擇高可信度，其他參數(shù)為系統(tǒng)默認(rèn)，網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建完成之后，下載TSV文件，并用該文件在Cytoscape 3.8.2軟件中進(jìn)行可視化分析。

1.5 GO功能富集和KEGG通路富集分析

利用在線分析工具(https://www.xiantao.love/products)進(jìn)行富集分析、統(tǒng)計(jì)分析與可視化展示。

1.6 成分-靶點(diǎn)分子對接

在PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)中檢索靶點(diǎn)分子的PDB格式文件， 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中下載活性成分結(jié)構(gòu)的mol2格式文件。用Pymol 軟件去除靶點(diǎn)的配體和多聚體。用Autodock 4.2軟件利用以上文件進(jìn)行分子對接，將對接結(jié)果用Pymol 軟件可視化處理并輸出。

2 結(jié)果

2.1 炎癥靶點(diǎn)的收集

在Gene數(shù)據(jù)庫中檢索到2 099條炎癥相關(guān)基因。將3個(gè)數(shù)據(jù)庫檢索到的基因數(shù)據(jù)取交集并用Uniprot ID 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，得到炎癥靶點(diǎn)1 193個(gè)。

2.2 活性成分及作用靶點(diǎn)的確定

通過文獻(xiàn)報(bào)道，根據(jù)OB和DL值篩選出酸藤子的活性成分有7個(gè)(表1)。通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，去重之后獲取267個(gè)靶點(diǎn)。

表1 酸藤子7個(gè)活性成分

2.3 活性成分與炎癥共有靶點(diǎn)的篩選

將炎癥靶點(diǎn)與活性成分靶點(diǎn)取交集制作韋恩圖(圖1)，獲得123個(gè)酸藤子活性成分與炎癥共有的靶點(diǎn)。

圖1 酸藤子活性成分靶點(diǎn)與炎癥靶點(diǎn)的韋恩圖Fig.1 Venn diagram of active component targets of Embelia laeta and inflammation targets

2.4 活性成分-炎癥潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

如圖2所示，利用 Cytoscape 3.8.2軟件將7個(gè)活性成分與123個(gè)潛在靶點(diǎn)構(gòu)建酸藤子活性成分-炎癥潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。該圖有130個(gè)節(jié)點(diǎn)，280條邊。Degree值的大小反應(yīng)節(jié)點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)個(gè)數(shù)，圖中活性成分圓圈由小到大表示degree值由低到高。排名前3位的活性成分分別為蒽貝素(MOL005235)、金圣草黃素(MOL003044)和槲皮素(MOL000098)。

圖2 酸藤子干預(yù)炎癥的“成分-炎癥潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)Fig.2 “Components-potential targets of inflammation” network of Embelia laeta in the intervention of inflammation

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將酸藤子活性成分與炎癥共有的123個(gè)靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并通過Cytoscape進(jìn)行可視化，結(jié)果見圖3。該網(wǎng)絡(luò)涉及111個(gè)節(jié)點(diǎn)，442條邊。節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)，邊表示靶點(diǎn)之間相互作用關(guān)系。節(jié)點(diǎn)的大小和顏色深淺與degree值相關(guān)。節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深，degree值就越大。Degree值評分前10位的靶點(diǎn)基因分別是IL6、HSP90AA1、AKT1、SRC、MAPK3、PIK3CA、EGFR、ESR1、PTGS2、MMP9。

圖3 酸藤子干預(yù)炎癥相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network of targets of Embelia laeta in intervention of inflammation

2.6 GO和KEGG富集分析

將酸藤子干預(yù)炎癥的123個(gè)靶標(biāo)基因利用生物信息在線分析工具進(jìn)行富集分析。利用P.adjust<0.05進(jìn)行篩選。富集結(jié)果顯示,GO中生物過程有1 820個(gè)；細(xì)胞組分有55個(gè)；分子功能有142個(gè)。KEGG有114條。GO 3個(gè)類別按照P值評分前5條見表2。酸藤子干預(yù)炎癥的靶基因主要涉及氧化應(yīng)激反應(yīng)、類固醇激素反應(yīng)、對活性氧反應(yīng)等生物過程；包含膜閥、膜區(qū)、囊腔等細(xì)胞組分；參與核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體等分子功能。根據(jù)P.adjust排序，KEGG排名前20條通路制作氣泡圖(圖4)。酸藤子干預(yù)炎癥的靶基因主要涉及PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、腫瘤中的microRNAs(microRNAs in cancer )、腫瘤中的蛋白多糖(proteoglycans in cancer)等信號通路。

表2 酸藤子干預(yù)炎癥靶點(diǎn)的GO富集過程分析

圖4 酸藤子干預(yù)炎癥靶點(diǎn)的KEGG代謝通路富集分析Fig.4 Enriched KEGG pathways of targets from Embelia laeta intervention in inflammation

2.7 活性成分與靶蛋白的分子對接

選取在活性成分-炎癥潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中degree值排名前3的活性成分(蒽貝素、金圣草黃素和槲皮素)以及PPI網(wǎng)絡(luò)圖中degree值排名前3的基因分別進(jìn)行分子對接。對接結(jié)果見表3。結(jié)合能<0，表示在自然狀態(tài)下可以結(jié)合，結(jié)合能越低，提示結(jié)合活性越好。分子對接結(jié)果可視化見圖5。結(jié)果顯示，酸藤子的3種活性成分蒽貝素、金圣草黃素和槲皮素與IL-6、HSP90AA1和AKT1均能夠有效結(jié)合，最低結(jié)合能均<-4.5 kcal/mol。其中金圣草黃素與3個(gè)靶蛋白的結(jié)合能均為最小值。

表3 活性成分與靶點(diǎn)分子對接結(jié)合能

圖5 活性成分與靶點(diǎn)的分子對接模式圖Fig.5 Molecular docking patterns of active components to target molecules

3 討論

酸藤子在中國南方地區(qū)資源豐富，作為瑤族的傳統(tǒng)應(yīng)用藥物，在口腔潰瘍、咽喉腫痛、腸炎、風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、皮炎等方面顯示出良好的療效[10]，酸藤子具有豐富的化學(xué)成分，但是目前還沒有進(jìn)行全面的系統(tǒng)性研究[3,11-12]，尤其是關(guān)于酸藤子效應(yīng)物質(zhì)及相關(guān)的藥理作用研究仍然不足。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)篩選出7種酸藤子的活性成分，分別是蒽貝素、槲皮素、金圣草黃素、β-谷甾醇、豆甾醇、豆甾-4-烯-3,6-二酮、山柰酚，以及123個(gè)炎癥相關(guān)的靶標(biāo)，并構(gòu)建了活性成分-炎癥潛在靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖；酸藤子干預(yù)炎癥相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選到評分前10位的靶點(diǎn)基因分別是IL6、HSP90AA1、AKT1、SRC、MAPK3、PIK3CA、EGFR、ESR1、PTGS2、MMP9，顯示出酸藤子干預(yù)炎癥具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。預(yù)測該10個(gè)靶點(diǎn)在酸藤子抗炎過程中處于核心地位。本研究繼續(xù)選擇評分前3位的活性成分，即蒽貝素、金圣草黃素、槲皮素與3個(gè)炎癥靶點(diǎn)，即IL6、HSP90AA1、AKT1分別進(jìn)行分子對接，結(jié)果也顯示這些活性成分與3個(gè)靶蛋白均能有效結(jié)合。

已有研究發(fā)現(xiàn)，蒽貝素、槲皮素和金圣草黃素3種成分能夠干預(yù)多種疾病，有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等重要活性。例如余納等[13]研究發(fā)現(xiàn)蒽貝素能夠降低血清中的IL-6和 IL-17A炎癥因子，緩解關(guān)節(jié)炎癥狀，有抗炎作用。KUMAR等[14]研究發(fā)現(xiàn)蒽貝素能夠降低炎癥因子，減輕炎癥損傷。張佳鳳等[15]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可以通過抑制Akt/mTOR通路干預(yù)疾病。而且槲皮素本身就可以作為膳食補(bǔ)充劑，對多種疾病有預(yù)防和治療作用，表現(xiàn)出抗氧化、抗炎、提高免疫力等活性[16]。金圣草黃素是一種黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、化學(xué)預(yù)防和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)特性。YOON等[17]研究發(fā)現(xiàn)金圣草黃素可以通過NF-κB、AP-1、PI3K/Akt、MAPK信號通路改善TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。WU等[18]發(fā)現(xiàn)金圣草黃素可以通過抑制JAK2/STAT3和IκB/p65 NF-κB信號通路而起到抗炎作用。以上這些研究也提示蒽貝素、槲皮素和金圣草黃素以及相關(guān)靶蛋白可能為酸藤子抗炎的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制。

進(jìn)一步對123個(gè)炎癥靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析。GO分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酸藤子參與抗炎的靶標(biāo)涉及多種生物過程、細(xì)胞組分和分子功能，主要涉及氧化應(yīng)激反應(yīng)、類固醇激素和活性氧反應(yīng)，包括核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性，類固醇激素受體、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性等。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)酸藤子抗炎的靶基因主要涉及PI3K-Akt信號通路、腫瘤中的microRNA、腫瘤中的蛋白多糖等信號通路、花生四烯酸代謝、IL-17信號通路等。結(jié)合PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建圖，評分前10位的靶點(diǎn)基因均參與以上代謝途徑。本研究蒽貝素、槲皮素和金圣草黃素3種活性成分參與的信號通路的結(jié)果與GO與KEGG富集通路的分析結(jié)果[13-18]也是一致的。以上結(jié)果進(jìn)一步提示，酸藤子干預(yù)炎癥是多途徑、多通路的方式。其中包含IL6、HSP90AA1、AKT1在內(nèi)評分前10位的靶標(biāo)參與的PI3K-Akt信號通路、腫瘤中的microRNA途徑、腫瘤中的蛋白多糖等信號通路等途徑可能是酸藤子干預(yù)炎癥的潛在作用機(jī)制。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對瑤藥酸藤子抗炎的活性成分、主要靶點(diǎn)、信號通路進(jìn)行了分析，并結(jié)合分子對接技術(shù)探討了活性成分與靶標(biāo)結(jié)合的可能性，為下一步實(shí)驗(yàn)研究酸藤子抗炎的機(jī)制提供了理論依據(jù)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)有一定的局限性，以上結(jié)果仍需要通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。