張明煥 毛文

湖北省武漢市第三醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430071

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種慢性疾病，其病理特征是關(guān)節(jié)軟骨退變和損傷；確定軟骨細(xì)胞在OA中的作用不僅可揭示該疾病發(fā)病機(jī)制，還可推動(dòng)針對(duì)特異治療靶點(diǎn)的新藥的開發(fā)[1-2]。研究[3-4]表明miRNA、circRNA參與OA的各種病理過程，在骨關(guān)節(jié)炎中具有治療潛力。研究[5]報(bào)道circ_SEC24A(hsa_circ_0005105)在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中上調(diào)，干擾circ_0005105消除了IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡、外基質(zhì)降解以及增殖抑制的作用。然而circ_0005105對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥因子分泌的影響及機(jī)制尚未完全清楚。Circular RNA Interactome在線軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)circ_0005105與miR-508-3p有結(jié)合位點(diǎn)。研究[6]報(bào)道lncRNA PCAT-1通過miR-508-3p/ZEB1軸促進(jìn)骨肉瘤的進(jìn)展。而miR-508-3p對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷的影響尚未有研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在研究circ_0005105是否通過調(diào)控miR-508-3p影響IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑

人正常軟骨細(xì)胞C28/I2(深圳市豪地華拓生物科技有限公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；Trizol試劑、熒光定量PCR試劑盒(日本Takara)；CCK-8試劑盒、凋亡檢測(cè)試劑盒(日本同仁研究所)；蛋白提取試劑盒、TNF-α、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(艾美捷科技有限公司)；白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)(上海廣銳生物科技有限公司)；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(美國(guó)AAT Bioquest)；Bax、Bcl-2抗體(美國(guó)Abcam)；Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3抗體(武漢艾美捷)。

1.2 細(xì)胞處理與分組

人正常軟骨細(xì)胞C28/I2用RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，用5 μg/L的IL-1β處理24 h，作為IL-1β組，正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為NC組；將si-NC、si-hsa_circ_0005105、miR-NC、miR-508-3p轉(zhuǎn)染至軟骨細(xì)胞后用5 μg/L的IL-1β處理24 h，記為IL-1β+si-NC組、IL-1β+si-hsa_circ_0005105組、IL-1β+miR-NC組、IL-1β+miR-508-3p組；將si-hsa_circ_0005105分別與anti-miR-NC、anti-miR-508-3p共轉(zhuǎn)染至軟骨細(xì)胞后用5 μg/L的IL-1β處理24 h，記為IL-1β+si-hsa_circ_0005105+anti-miR-NC組、IL-1β+si-hsa_circ_0005105+anti-miR-508-3p組。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)hsa_circ_0005105和miR-508-3p的表達(dá)水平

提取各組軟骨細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按試劑盒說明以GAPDH和U6為內(nèi)參進(jìn)行PCR，相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)

提取各組細(xì)胞總蛋白，取適量蛋白樣品進(jìn)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，再分別加入抗體(1∶800)，4 ℃孵育過夜，洗膜后加山羊抗兔IgG-HRP(1∶2 000)室溫孵育1 h，暗室中曝光顯影、定影，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

各組細(xì)胞，按試劑盒說明分別加Annexin V-FITC和PI，避光孵育，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞。

1.6 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性

各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h，按試劑盒說明加10 μL CCK-8試劑，孵育2 h后檢測(cè)吸光度值(A)。

1.7 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

用6孔板按照每孔500個(gè)細(xì)胞接種細(xì)胞，培養(yǎng)至出現(xiàn)肉眼可見細(xì)胞克隆團(tuán)，棄培養(yǎng)基，加預(yù)冷PBS洗滌，用甲醇固定細(xì)胞，其用量為500 μL/孔，固定時(shí)間為20 min(-20 ℃)，用1 %結(jié)晶紫染色液染色細(xì)胞15 min，反應(yīng)條件為37 ℃，用量為400 μL/孔，蒸餾水洗滌后晾干，拍照并觀察細(xì)胞克隆形成數(shù)。

1.8 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)TNF-α、IL-6水平

各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，按試劑盒說明操作，檢測(cè)TNF-α、IL-6水平。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

將hsa_circ_0005105野生型和突變型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒分別與miR-NC和miR-508-3p共轉(zhuǎn)染至軟骨細(xì)胞，按照試劑盒說明操作，檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性。

將si-NC、si-hsa_circ_0005105、pcDNA、pcDNA-hsa_circ_0005105轉(zhuǎn)染至軟骨細(xì)胞，按1.3中方法檢測(cè)hsa_circ_0005105和miR-508-3p表達(dá)水平。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷中hsa_circ_0005105和miR-508-3p的表達(dá)情況

與NC組比較，IL-1β組hsa_circ_0005105表達(dá)水平升高(1.00±0.10 vs 2.73±0.19)(t=24.172，P<0.05)，miR-508-3p表達(dá)水平降低(1.00±0.11 vs 0.45±0.04)(t=14.097，P<0.05)。

2.2 低表達(dá)hsa_circ_0005105抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷和炎癥因子分泌

與NC組比較，IL-1β組hsa_circ_0005105表達(dá)水平升高，Bax、Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3相對(duì)表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞活性和Bcl-2蛋白水平降低，細(xì)胞克隆形成數(shù)減少，TNF-α和IL-6水平升高(P<0.05)；與IL-1β+si-NC組比較，IL-1β+si-hsa_circ_0005105組hsa_circ_0005105表達(dá)水平降低，Bax、Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3相對(duì)表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率降低，細(xì)胞活性和Bcl-2蛋白水平升高，細(xì)胞克隆形成數(shù)增多，TNF-α和IL-6水平降低(P<0.05)，見圖1，表1。

注：A：低表達(dá)hsa_circ_0005105后軟骨細(xì)胞凋亡流式圖；B：低表達(dá)hsa_circ_0005105后軟骨細(xì)胞克隆形成圖；C：低表達(dá)hsa_circ_0005105后Bax、Cleaved-caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)。1：NC；2：IL-1β；3：IL-1β+si-NC；4：IL-1β+si-hsa_circ_0005105。

表1 低表達(dá)hsa_circ_0005105抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷和炎癥因子分泌Table 1 Low expression of hsa_circ_0005105 inhibits IL-1β-induced chondrocyte injury and inflammatory factor

2.3 過表達(dá)miR-508-3p抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷及炎癥因子分泌

與IL-1β+miR-NC組比較，IL-1β+miR-508-3p組miR-508-3p表達(dá)水平、細(xì)胞活性、Bcl-2蛋白水平升高，Bax、Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3相對(duì)表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率降低，細(xì)胞克隆形成數(shù)增多，TNF-α和IL-6水平降低(P<0.05)，見圖2，表2。

表2 過表達(dá)miR-508-3p抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷及炎癥因子分泌Table 2 Overexpression of miR-508-3p inhibits IL-1β-induced chondrocyte injury and inflammatory factor

注：A：過表達(dá)miR-508-3p后軟骨細(xì)胞凋亡流式圖；B：過表達(dá)miR-508-3p后軟骨細(xì)胞克隆形成圖；C：過表達(dá)miR-508-3p后Bax、Cleaved-caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)。1：IL-1β+miR-NC；2：IL-1β+miR-508-3p。

2.4 hsa_circ_0005105靶向miR-508-3p

Circular RNA Interactome預(yù)測(cè)顯示hsa_circ_0005105和miR-508-3p存在結(jié)合位點(diǎn)(圖3)。miR-508-3p與hsa_circ_0005105熒光素酶活性降低(1.00±0.10 vs 0.41±0.04)(t=16.434，P<0.05)。與si-NC組比較，si-hsa_circ_0005105組hsa_circ_0005105表達(dá)水平降低(1.00±0.10 vs 0.35±0.04)，miR-508-3p表達(dá)水平升高(1.00±0.10 vs 2.24±0.17)(P<0.05)；與pcDNA組比較，pcDNA-hsa_circ_0005105組hsa_circ_0005105表達(dá)水平升高(1.02±0.09 vs 2.18±0.18)，miR-508-3p表達(dá)水平降低(1.02±0.11 vs 0.44±0.04)(P<0.05)。

圖3 Circular RNA Interactome對(duì)hsa_circ_0005105和miR-508-3p結(jié)合進(jìn)行預(yù)測(cè)示意圖Fig.3 Schematic diagram of the prediction of the binding of hsa_circ_0005105 and miR-508-3p by circular RNA Interactome

2.5 低表達(dá)miR-508-3p可以逆轉(zhuǎn)hsa_circ_0005105低表達(dá)對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷的影響

與IL-1β+si-hsa_circ_0005105+anti-miR-NC組比較，IL-1β+si-hsa_circ_0005105 +anti-miR-508-3p組miR-508-3p表達(dá)水平降低，Bax、Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3相對(duì)表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞活性和Bcl-2蛋白水平降低，細(xì)胞克隆形成數(shù)減少，TNF-α和IL-6水平升高(P<0.05)，見圖4，表3。

表3 低表達(dá)miR-508-3p可以逆轉(zhuǎn)hsa_circ_0005105低表達(dá)對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷的影響

注：A：低表達(dá)miR-508-3p和hsa_circ_0005105后軟骨細(xì)胞凋亡情況；B：低表達(dá)miR-508-3p和hsa_circ_0005105后軟骨細(xì)胞而克隆形成情況；C：低表達(dá)miR-508-3p和hsa_circ_0005105后Bax、Cleaved-caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)。1：IL-1β+si-hsa_circ_0005105+anti-miR-NC；2：IL-1β+si-hsa_circ_0005105+anti-miR-508-3p。

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎是常發(fā)生于中老年人群的骨科疾病，基因治療是骨關(guān)節(jié)炎的一種新興治療方式；尋找相關(guān)的生物標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)之一[7-8]。研究[9-10]表明circRNA是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生，發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，能夠作為診斷標(biāo)志物和生物治療靶點(diǎn)，深入的了解circRNA在骨關(guān)節(jié)炎中的作用機(jī)制，以期為骨關(guān)節(jié)炎的治療提供理論基礎(chǔ)及新的靶點(diǎn)和新的治療方法。研究[11]報(bào)道IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞中hsa_circ_0005105 表達(dá)顯著上調(diào)，hsa_circ_0005105通過海綿miR-26a上調(diào)NAMPT表達(dá)并促進(jìn)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解。此外，circ_0005105在胰腺導(dǎo)管癌組織和細(xì)胞系中均上調(diào)表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[12]。IL-1β被認(rèn)為是骨關(guān)節(jié)炎的主要誘因，本研究用IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞建立骨模型，IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中hsa_circ_0005105表達(dá)水平也升高，與前人研究結(jié)果一致[11]。本研究低表達(dá)hsa_circ_0005105后，IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中Bax、Cleaved-caspase-3相對(duì)表達(dá)水平降低，細(xì)胞凋亡率降低，細(xì)胞活性升高；表明低表達(dá)hsa_circ_0005105可抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。炎癥在骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展中起重要作用，加強(qiáng)對(duì)炎癥細(xì)胞因子的研究可能會(huì)提高骨關(guān)節(jié)炎的治療潛力[13-14]。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)hsa_circ_0005105后，炎癥因子TNF-α和IL-6水平降低，表明低表達(dá)hsa_circ_0005105還可抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中炎癥因子的分泌。

研究[15-17]報(bào)道m(xù)iR-508-3p可參與調(diào)控卵巢癌、透明細(xì)胞腎細(xì)胞、胃癌等多種腫瘤的進(jìn)展。然而miR-508-3p對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的影響尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中miR-508-3p表達(dá)水平降低，過表達(dá)miR-508-3p后IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中Bax、Cleaved-caspase-3相對(duì)表達(dá)水平降低，細(xì)胞凋亡率降低，細(xì)胞活性升高，TNF-α和IL-6水平降低；提示過表達(dá)miR-508-3p可抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡和炎癥因子釋放，促進(jìn)細(xì)胞增殖。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0005105靶向調(diào)控miR-508-3p；低表達(dá)miR-508-3p可以逆轉(zhuǎn)hsa_circ_0005105低表達(dá)對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷及炎癥因子分泌的影響。

綜上所述，hsa_circ_0005105通過靶向上調(diào)miR-508-3p減輕IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡及炎癥因子分泌，促進(jìn)細(xì)胞增殖。