孔嬌 陳園園 蔡青山 趙亞芳 喻義杭

非結核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)是指除結核分枝桿菌復合群及麻風分枝桿菌以外的分枝桿菌的總稱。隨著我國對結核病的診斷與治療逐漸完善，臨床工作中非結核分枝桿菌肺病(nontuberculous mycobacteria pulmonary disease，NTM-PD)發(fā)病率顯著上升[1]，且兩者無論在臨床表現(xiàn)上還是影像學表現(xiàn)上都極為相似[2]，臨床診治中鑒別診斷困難，極易被誤診為肺結核而耽誤診治，但兩者臨床治療方案有所不同，NTM對常規(guī)抗結核藥物存在較高的耐藥率，常規(guī)抗結核治療甚至會誘導NTM耐藥菌株的產生。因此，提高NTM-PD的臨床診斷水平非常重要。

宏基因二代測序技術(metagenomic next generation sequencing，mNGS)是近年來新興的分子生物學診斷技術，mNGS技術可對特定標本中的所有核酸序列進行無偏倚檢測[3]，且檢測結果較少受到抗菌藥物的影響，具有較高的敏感度。目前采用mNGS針對NTM檢測的相關研究較少，本研究回顧性分析本院疑似NTM-PD患者的mNGS檢測結果，以評估m(xù)NGS對NTM-PD的診斷價值。

資料和方法

一、研究對象

回顧性搜集2020年1月1日至2022年2月28日浙江大學醫(yī)學院附屬杭州市胸科醫(yī)院結核病診療中心收治的123例疑似NTM-PD患者的資料。

1.NTM-PD診斷標準[4]：具有呼吸系統(tǒng)癥狀和(或)全身性癥狀，經胸部影像學檢查發(fā)現(xiàn)空洞性陰影、多灶性支氣管擴張及多發(fā)性小結節(jié)病變等，已排除其他肺部疾病，在確保標本無外源性污染的前提下，符合以下條件之一者可診斷為NTM-PD：(1)2份分開送檢的痰標本，NTM培養(yǎng)陽性并鑒定為同一致病菌和(或)2次NTM分子生物學檢測均為同一致病菌；(2)支氣管沖洗液或支氣管肺泡灌洗液NTM培養(yǎng)陽性和(或)分子生物學檢測1次陽性；(3)經支氣管鏡或其他途徑肺活組織檢查發(fā)現(xiàn)組織病理學特征性改變(肉芽腫性炎癥或抗酸桿菌染色陽性)，并且NTM培養(yǎng)和(或)分子生物學檢測陽性；(4)經支氣管鏡或其他途徑肺活組織檢查發(fā)現(xiàn)組織病理學特征性改變(肉芽腫性炎癥或抗酸桿菌染色陽性)，并且1次及以上的痰標本、支氣管沖洗液或支氣管肺泡灌洗液中NTM培養(yǎng)和(或)分子生物學檢測陽性。

2.納入標準：(1)臨床特征疑似NTM-PD：具有呼吸道癥狀和(或)全身癥狀，影像學表現(xiàn)發(fā)現(xiàn)空洞性陰影、多灶性支氣管擴張及多發(fā)性小結節(jié)改變等。(2)獲取患者肺泡灌洗液、痰液或肺組織同時進行mNGS、PCR熒光探針法及分枝桿菌培養(yǎng)等檢測。(3)送檢標本質量合格。(4)具有完整的臨床資料，包括mNGS診斷結果、PCR熒光探針檢測結果和分枝桿菌培養(yǎng)結果。

3.排除標準：(1)患者拒絕送檢或未送檢mNGS。(2)送檢標本質量不合格。(3)臨床資料不完整。

二、研究方法

(一)分枝桿菌培養(yǎng)

分枝桿菌培養(yǎng)采用BACTEC MGIT 960分枝桿菌全自動快速液體培養(yǎng)系統(tǒng)(簡稱“液體培養(yǎng)”)。液體培養(yǎng)陽性后，吸取菌液應用MPB64抗原檢測試劑盒檢測是否為NTM。鑒定為NTM的樣本，采用基因芯片法(北京博奧晶典生物技術有限公司)進行菌種鑒定。具體操作方法參照《結核病實驗室標準化操作與網絡建設》[5]中的操作程序進行。

(二)PCR熒光探針法檢測

采用博奧晶芯分枝桿菌核酸檢測試劑盒，核酸提取參照說明書步驟進行，PCR儀選擇擴增程序，同時選擇FAM和HEX(或VIX)通道，熒光采集點選擇60 ℃，持續(xù)30 s，放入待擴增樣本中，按照分枝桿菌核酸檢測PCR擴增程序進行PCR擴增。樣品所在反應管內熒光信號達到設定閾值時所經歷的PCR循環(huán)數(shù)(Ct值)參考值為40，樣本擴增曲線呈S型，Ct值小于40判斷為陽性；擴增曲線不呈S型或Ct值為40(或無任何值)，判斷為陰性。若FAM、HEX均為陽性，可判斷為結核分枝桿菌；若FAM通道為陽性、HEX通道為陰性，可判斷為結核分枝桿菌；若FAM通道為陰性、HEX通道為陽性，可判斷為NTM。

(三)mNGS檢測

1.樣本采集：留取呼吸道標本3～5 ml，將樣本與玻璃珠混合振蕩，按照TIANampmirco DNA 試劑盒(DP315，北京天根生化科技有限公司)操作說明書提取DNA。

2.構建文庫：采用Agilent 2100生物分析儀，經過片段化處理和PCR等獲取質控DNA文庫濃度，經環(huán)化形成單鏈環(huán)結構，經滾環(huán)復制形成DNB納米球(DNA namoball)備用。

3.測序：將所得DNB納米球用Illumina NextSeq CN500測序平臺進行高通量測序，結合權威的微生物數(shù)據(jù)庫進行生物信息分析。將測序結果按照病毒、細菌、真菌和寄生蟲進行分類排列。

四、統(tǒng)計學處理

結 果

一、一般資料

本研究共納入123例疑似NTM-PD患者，最終診斷為NTM-PD者74例(NTM-PD組)，非NTM-PD者49例(非NTM-PD組；包括肺結核19例，支氣管擴張伴感染10例，慢性阻塞性肺疾病10例，社區(qū)獲得性肺炎6例，間質性肺病4例)。納入患者中，男性69例(56.1%)，女性54例(43.9%)，平均年齡(58.16±14.02)歲。送檢標本中支氣管肺泡灌洗液樣本106份(86.2%)，痰樣本10份(8.1%)，肺穿刺組織樣本6份(4.9%)，胸腔積液樣本1份(0.8%)。123例患者中，合并支氣管擴張29例(23.6%)，合并慢性阻塞性肺疾病20例(16.3%)，有肺結核病史24例(19.5%)，合并實體腫瘤8例(6.5%)，合并自身免疫性疾病7例(5.7%)。見表1。

表1 兩組患者一般資料及臨床特征的比較

二、mNGS、常規(guī)培養(yǎng)和NTM DNA檢測對NTM-PD的診斷效能

以臨床診斷(包括確診及臨床診斷)結果為標準，mNGS、液體培養(yǎng)及PCR熒光探針法對NTM-PD診斷的敏感度分別為83.8%、78.4%、67.6%，特異度分別為65.3%、91.8%、87.8%，診斷一致率分別為76.4%、83.7%、75.6%。mNGS、液體培養(yǎng)及PCR熒光探針法與臨床診斷結果一致性一般，Kappa值分別為0.524、0.647、0.521。見表2。

表2 以臨床診斷結果為標準研究3種檢測方法診斷NTM-PD的效能

以液體培養(yǎng)結果為參照標準，mNGS檢測的敏感度及特異度分別87.1%和59.0%。PCR熒光探針法檢測的敏感度及特異度分別為75.8%和85.2%，診斷一致率分別為73.2%和80.5%。mNGS及PCR熒光探針法與液體培養(yǎng)檢測一致性一般，Kappa值分別為0.462和0.587。見表3。

表3 以培養(yǎng)結果為標準研究2種方法診斷NTM-PD的效能

三、檢測方法所需時間比較

在NTM的檢測中，mNGS、PCR熒光探針法及液體培養(yǎng)法平均檢測時間分別為2.00(2.00，3.00) d、2.00(1.75，3.00) d及27.00(23.75，35.00) d。mNGS方法檢測NTM所需時間明顯短于液體培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計學意義(Z=6.848，P=0.000)。

四、NTM-PD組采用兩種檢測方法進行菌種鑒定分析

74例NTM-PD組患者，經mNGS及液體培養(yǎng)+基因芯片法檢測NTM菌株，均為陽性者共52例，mNGS陽性、液體培養(yǎng)+基因芯片法陰性者12例，液體培養(yǎng)+基因芯片法陽性、mNGS陰性者6例，兩種方法均陰性者4例。液體培養(yǎng)+基因芯片法共鑒定出5種NTM，其中，胞內分枝桿菌38例、鳥分枝桿菌9例、堪薩斯分枝桿菌6例、龜-膿腫分枝桿菌4例、戈登分枝桿菌1例。mNGS共鑒定出7種NTM，其中，胞內分枝桿菌25例、鳥分枝桿菌18例、堪薩斯分枝桿菌5例、龜-膿腫分枝桿菌10例、副胞內分枝桿菌4例、馬薩分枝桿菌1例、蟾蜍分枝桿菌1例。以液體培養(yǎng)+基因芯片法為菌種鑒定標準，mNGS檢測的準確率為63.8%(37/58)。見表4。

表4 兩種方法對非結核分枝桿菌菌株的檢測結果

2種檢測方法不一致菌株共33例，其中12例經mNGS鑒定為胞內分枝桿菌6例，龜分枝桿菌1例，膿腫分枝桿菌2例，鳥分枝桿菌2例，蟾蜍分枝桿菌1例，但液體培養(yǎng)+基因芯片法檢測結果為陰性；6例經液體培養(yǎng)+基因芯片法鑒定為鳥分枝桿菌3例，胞內分枝桿菌3例，但mNGS結果為陰性；11例液體培養(yǎng)+基因芯片法鑒定為胞內分枝桿菌，而mNGS鑒定為鳥分枝桿菌5例，膿腫分枝桿菌3例，副胞內分枝桿菌2例，堪薩斯分枝桿菌1例；2例經液體培養(yǎng)+基因芯片法鑒定為堪薩斯分枝桿菌，mNGS分別鑒定為副胞內分枝桿菌及鳥分枝桿菌；2例經基因芯片法鑒定為偶然分枝桿菌及鳥分枝桿菌，mNGS分別鑒定為副胞內分枝桿菌及馬薩分枝桿菌。

討 論

NTM廣泛分布于環(huán)境中，土壤甚至必要的生活用水均是其重要的傳播途徑，且人類是其感染宿主，可對人體全身各個組織器官致病，其中NTM-PD占NTM感染性疾病的絕大多數(shù)，是最常見的NTM病[6]。既往認為，與結核分枝桿菌不同，NTM不會在人與人之間進行傳播，但Bryant等[7]證實在肺囊性纖維化患者之間，膿腫分枝桿菌存在人與人之間的傳播。目前，國內外多項研究表明，NTM病發(fā)病率逐漸升高，但因為它在臨床工作中并非法定上報疾病，真正準確的流行病學數(shù)據(jù)有限。NTM-PD臨床表現(xiàn)與肺結核相似，同為痰抗酸桿菌染色陽性，極易誤診，一直困擾著臨床工作者。以往NTM病診斷需分枝桿菌培養(yǎng)陽性后方能進一步鑒定明確，但因培養(yǎng)所需時間長，易導致診斷延誤。隨著分子生物學技術的發(fā)展，PCR熒光檢測及mNGS也應用到了NTM的檢測中，本研究即對3種技術的診斷效能進行了評估。

mNGS作為新興分子生物學檢測方法中最重要的一員，已被廣泛應用于細菌、真菌、病毒等多種感染性疾病的診斷[8]，在分枝桿菌的診斷中具有舉足輕重的地位。2020年NTM-PD診斷與治療指南首次將分子生物學診斷寫入診斷標準中[4]。但是，前期研究表明，mNGS對于結核病及NTM的檢出率較低，診斷并不具有明顯優(yōu)勢[9-10]。本研究以此為基礎，采用mNGS、液體培養(yǎng)及PCR熒光探針3種方法對樣本同時進行檢測，結果提示mNGS檢測NTM敏感度高，具有一定的臨床檢測價值。mNGS檢測NTM的特異度明顯低于液體培養(yǎng)法，這可能與mNGS可無偏倚將送檢標本中所有病原體檢測出來，即使是微量的外部污染也可以出現(xiàn)在測序數(shù)據(jù)中有關，這勢必會降低其特異度。

本研究結果提示的mNGS檢測呼吸道樣本NTM的低特異度值得臨床醫(yī)師警惕，這是由于部分NTM可在呼吸道定植，同時樣本有污染的可能。基于mNGS檢測NTM的低特異度，本研究對2020版NTM-PD診斷標準第二條提出質疑，筆者認為1次支氣管肺泡灌洗液分子生物學檢測(mNGS、PCR熒光檢測、基因芯片法等)陽性，仍然需要結合患者臨床表現(xiàn)、影像學檢查及后續(xù)培養(yǎng)結果等多方面進行病情評估，排除環(huán)境污染和NTM定植，方能作出準確的臨床診斷。其次，本研究發(fā)現(xiàn)，mNGS在鳥-胞內分枝桿菌病原學診斷方面存在一定的局限性，這同樣值得臨床醫(yī)師關注，二者雖同屬鳥分枝桿菌復合群(Mycobacteriumaviumcomplex，MAC)，但治療方案存在一定差異。因此，進一步提高對MAC的菌種鑒定能力，是mNGS更好地應用于NTM病診斷的重點。此外，mNGS檢測成本較高仍然是大規(guī)模臨床應用的障礙所在。

本研究結果表明，液體培養(yǎng)具有較高的敏感度，這與既往研究不相符，可能是因為本研究納入病例樣本以肺泡灌洗液為主，且與我院為結核病?？漆t(yī)院，液體培養(yǎng)檢驗手段熟練及經驗豐富有關。本研究進一步證實mNGS具有較快的診斷速率，一般48 h 內便可獲得診斷結果，而無論是液體培養(yǎng)或羅氏培養(yǎng)，均需1～2個月不等，后續(xù)菌種鑒定需要消耗更長時間，這與繆青等[11]研究結果一致。同時，mNGS可直接鑒定NTM至菌種水平，本文通過比較mNGS及基因芯片法兩種不同菌種鑒定結果，以液體培養(yǎng)+基因芯片法為最終菌種鑒定標準，mNGS檢測的準確率為63.8%，菌種鑒定以胞內分枝桿菌及鳥分枝桿菌為主，這與既往研究結果一致[12-13]。而由于不同菌種細菌毒力和長期治療方案存在差異，快速正確識別NTM菌種至關重要，mNGS可明顯縮短診斷時間，且可以直接鑒定至菌種水平，使診斷更加迅速準確。

綜上所述，mNGS在NTM-PD診斷中具有較高的敏感度，診斷所需時間明顯短于分枝桿菌培養(yǎng)，并可直接鑒定至菌種水平，可以在臨床工作中起到前哨作用，為盡早識別病原微生物，及早診斷及治療提供方向。但如何在保證診斷敏感度的同時提高特異度仍是mNGS的研究重點及難點。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻孔嬌：醞釀和設計實驗、實施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)；陳園園：對文章的知識性內容作批評性審閱、獲取研究經費、行政/技術或材料支持、指導、支持性貢獻；蔡青山：對文章的知識性內容作批評性審閱、行政/技術或材料支持、指導、支持性貢獻；趙亞芳和喻義杭：統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)