鄭吉云，邵先舫，張峻峰，潘曉彥，李 崗*，夏新華*，閆 蕾

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬常德醫(yī)院，湖南 常德 415000；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610000）

由常德市第一中醫(yī)醫(yī)院名老中醫(yī)祖?zhèn)髅胤健爸蝹ⅰ备牧级鴣淼闹蝹筒紕?，由血?dú)ぁ⒒⒄?、見風(fēng)消組成，具有行血散瘀、行氣通經(jīng)、活絡(luò)止痛的功用，主要用于腰肌勞損、急慢性軟組織損傷、關(guān)節(jié)扭傷、關(guān)節(jié)炎等疾病導(dǎo)致的疼痛。

辣椒素受體（vanilloid receptor 1, VR1）是屬于非選擇性陽離子通道家族的門控性陽離子通道，打開后可以讓陽離子快速從胞外進(jìn)入胞內(nèi)，引起一系列效應(yīng)[1-3]，其中包括炎性疼痛的生理和病理變化。 現(xiàn)有研究[4-10]發(fā)現(xiàn)炎性介質(zhì)對(duì)其影響的機(jī)制有以下幾個(gè)方面：（1）通過花生四烯酸代謝物等通道激動(dòng)劑來激活VR1；（2） 增加在感覺神經(jīng)細(xì)胞膜上的VR1；（3）使VR1 磷酸化。 HELLIWELL 等[11]研究表明，在炎性疼痛過程中VR1 的介導(dǎo)發(fā)揮著重要的作用，VR1廣泛存在于大鼠背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglia,DRG）中；CATERINA 等[12]培育出對(duì)炎性疼痛反應(yīng)降低的VR1 基因敲除小鼠，但對(duì)傷害性刺激有正常反應(yīng)。 因此，在一些具有傷害性的刺激中，尤其是在傷害性熱刺激所致的痛敏中的傳遞中，VR1 起到關(guān)鍵的作用，甚至痛覺的產(chǎn)生必需依賴VR1[13]。

p38MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，是產(chǎn)生和保持疼痛的通路，其與疼痛敏感化密切相關(guān)[14]。 進(jìn)一步探究p38MAPK 在疼痛敏感化機(jī)制中的作用，為疼痛敏感化疾病提供新的治療靶點(diǎn)，是本次實(shí)驗(yàn)研究的目標(biāo)之一。 現(xiàn)有研究表明[15]，NGF、MAPK 信號(hào)通路、VR1三者與炎性疼痛形成密切相關(guān)，MAPK 信號(hào)通路參與了VR1 的表達(dá)，其作用機(jī)制與干預(yù)VR1 基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯、蛋白的合成有關(guān)。

為了探究其鎮(zhèn)痛作用和鎮(zhèn)痛機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)利用福爾馬林足底炎性疼痛大鼠模型，進(jìn)行治傷巴布劑與云南白藥膏的對(duì)比實(shí)驗(yàn)研究，并論述其鎮(zhèn)痛作用和鎮(zhèn)痛機(jī)制，探究治傷巴布劑是否通過調(diào)控NGF/p38MAPK/VR1 信號(hào)通路影響VR1 的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而影響疼痛的表達(dá)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD 大鼠共36 只，體質(zhì)量250～280 g，由湖南斯萊克景達(dá)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（SPF 級(jí)），合格證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004）。 于長沙維爾生物科技有限公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心內(nèi)飼養(yǎng)。大鼠均采用無菌顆粒飼料飼養(yǎng)，自由飲水，環(huán)境溫度穩(wěn)定在20～25 ℃，室內(nèi)通風(fēng)良好，定時(shí)更換墊料。

1.2 藥物

治傷巴布劑（湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬常德醫(yī)院藥劑科，湘藥制備號(hào)：Z20220594000）藥方組成：血?dú)?0 g、虎杖15 g、見風(fēng)消10 g；云南白藥膏（云南白藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：ZCA2126，國藥準(zhǔn)字：Z20073015）。

1.3 試劑及儀器

VR1 抗體、β-actin 抗體（美國Proteintech 公司，批號(hào)：66983-1-Ig、66009-1-Ig）；山羊抗鼠IgG（美國Proteintech 公司，批號(hào)：SA00001-1）；還原型5XSDS上樣緩沖液、1.5 mol/L Tris·HCl（pH 8.8）、1.0 mol/L Tris·HCl（pH 6.8）、10%APS、10%SDS、TEMED、PBST 緩沖液、30%Acr/Bic、電泳液緩沖液、轉(zhuǎn)膜緩沖液、10x 麗春紅染液、脫脂奶粉、RIPA 裂解液、蛋白磷酸酶抑制劑、Super ECL Plus 超敏發(fā)光液（中國Abiowell 公司，貨號(hào)：AWB0055、AWB0073、AWB0074、A WB0093、AWT0047、AWB0068、AWI0130、AWB0020、AWB0083、AWC0114、AWB0225、AWB0004、AWB0136、AWH0650、AWB0005）；蛋白酶抑制劑（北京金泰宏達(dá)生物科技有限公司，貨號(hào)：583794）；BSA（鹽城賽寶生物科技有限公司，貨號(hào)：52724）；顯影液、定影液（上海佳信科技有限公司，貨號(hào)：BW-61、BW-62）；由北京擎科生物科技有限公司合成引物。

H1650R 型臺(tái)式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；DYY-6C 型電泳儀、DYCZ-24DN型電泳槽、DYCZ-40D 型轉(zhuǎn)膜儀（北京六一生物科技有限公司）；JB-13 型磁力攪拌器、PHS-3C 型精密pH 計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；BioPrep-24 型生物樣品均質(zhì)儀（杭州奧盛儀器有限公司）；ChemiScope6100 型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物造模、分組及給藥

36 只雄性SD 大鼠，隨機(jī)分為正常組（n=9）和造模組（n=27）。抽取5%福爾馬林0.1 mL 注入造模組大鼠左側(cè)后足底皮下建立大鼠炎性疼痛模型[16]，正常組注射相應(yīng)體積的生理鹽水。將造模成功的大鼠隨機(jī)分成模型組、 治傷巴布劑組及云南白藥膏組。治傷巴布劑組以治傷巴布劑（3 cm×3 cm）外敷于大鼠左后足足底；云南白藥膏組則予以云南白藥膏（3 cm×3 cm）外敷于大鼠左后足，正常組和模型組分別于足底貼敷空白膏劑（3 cm×3 cm）各組大鼠分為3 個(gè)亞組，分別連續(xù)貼敷相應(yīng)膏藥1、3、7 d。

2.2 各組大鼠的痛行為觀察及分級(jí)評(píng)價(jià)[17]

經(jīng)造模后分別在1、5、15、30、45、60、90、120 min時(shí)間點(diǎn)觀察各組大鼠疼痛反應(yīng)，按下述標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行疼痛分級(jí)并記錄：0 分為注射福爾馬林一側(cè)后足與對(duì)側(cè)后足均接觸底面，行走自如；1 分為兩側(cè)后足均接觸底面，但注射側(cè)在行走時(shí)輕微跛行；2 分為兩側(cè)后足均接觸底面，行走時(shí)中心偏向健側(cè)，出現(xiàn)明顯跛行；3 分為注射側(cè)后足輕觸底面，不敢負(fù)重，行走時(shí)抬起；4 分為注射側(cè)后足抬起，懸空狀態(tài)；5 分為大鼠出現(xiàn)舔、咬、抖動(dòng)注射側(cè)后足。

2.3 各組大鼠組織標(biāo)本的取材與處理

造模成功后對(duì)各組大鼠分別在3 個(gè)時(shí)相點(diǎn)（1、3、7 d）進(jìn)行標(biāo)本取材，在各時(shí)相點(diǎn)分別取3 只。 用4%的PA 固定，取出大鼠左后足底肌肉組織和L3～L6 節(jié)段DRG；凍存樣分兩份，L4 用于Western blot 檢測(cè)、L5 用于RT-PCR 檢測(cè)[18-19]。

2.4 RT-PCR 檢測(cè)大鼠DRG 中VR1 的mRNA 表達(dá)水平

取0.02 g 組織裂解，離心取上層液在260 nm與280 nm 處測(cè)其吸光度值，并計(jì)算其濃度和純度，并將取得的總mRNA 為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA。本實(shí)驗(yàn)選用GAPDH 為內(nèi)參，數(shù)據(jù)處理：采用2-ΔΔCt法，計(jì)算mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。 各基因引物序列詳見表1。

表1 各基因引物序列表

2.5 Western blot 檢測(cè)大鼠DRG 中VR1 的蛋白表達(dá)水平

取0.025 g 組織裂解離心后取200 μL 蛋白上清，加入50 μL 5×loading buffer 混勻，將樣品上樣電泳后與經(jīng)一抗（VR1：TRPV1 Monoclonal antibody（1∶2000）；β-actin：Beta Actin Monoclonal antibody（1∶5000）孵育的NC 膜放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，后將NC 膜與1∶5000 稀釋后的HRP goat anti-mouse IgG 室溫孵育90 min。 顯色曝光后用quantity one專業(yè)灰度分析軟件進(jìn)行分析。

2.6 免疫組化法檢測(cè)大鼠足底肌肉中NGF 以及DRG 中p-p38MAPK 蛋白的表達(dá)水平

包埋處理大鼠肌肉組織及DRG，將組織切成4～6 μm 的薄片，脫蠟、熱修復(fù)抗原及滅活內(nèi)源性酶后分別滴加經(jīng)1∶200 稀釋的重組Anti-NGF、Anti-pp38MAPK 抗體，4 ℃過夜后滴加50～100 μL 抗-兔-IgG 抗體-HRP 多聚體，37 ℃孵育30 min。 滴加適當(dāng)顯色劑及染色液后樹膠封片，于40×10 倍顯微鏡下采集圖片。采集的圖片經(jīng)Image J 軟件分析后得出平均IOD，將所得數(shù)據(jù)錄入SPSS 數(shù)據(jù)分析軟件處理。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0 進(jìn)行分析，計(jì)量資料以“±s”表示，采用方差分析。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊者，使用單因素方差分析，兩兩比較采用ANOVA分析；方差不齊則用秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠疼痛行為學(xué)表現(xiàn)比較

模型組、治傷巴布劑組和云南白藥膏組大鼠出現(xiàn)躁動(dòng)尖叫并撕咬左后足等典型的雙相傷害性行為反應(yīng)，提示造模成功。 疼痛反應(yīng)呈典型的雙相變化，即注射后即刻開始，持續(xù)3～5 min 的急性疼痛時(shí)相（第一時(shí)相），5～10 min 的靜息期，和隨后出現(xiàn)的可持續(xù)40～60 min 的繼發(fā)性疼痛時(shí)相（第二時(shí)相）。 正常組無上述行為，疼痛反應(yīng)積分為0。 詳見圖1。

圖1 注射福爾馬林后不同時(shí)間各組大鼠疼痛評(píng)分折線圖

3.2 各組大鼠DRG 中VR1 mRNA 水平

與正常組比較，模型組大鼠在3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)DRG中VR1 mRNA 水平增加（P＜0.05）；與模型組比較，治傷巴布劑組和云南白藥膏組大鼠在3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)DRG 中VR1 mRNA 水平降低（P＜0.05）；與云南白藥膏組比較，治傷巴布劑組大鼠DRG 中VR1 mRNA水平1、3、7 d 降低。 詳見表2。

表2 4 組大鼠DRG 中VR1 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平的比較（±s，n=9）

表2 4 組大鼠DRG 中VR1 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平的比較（±s，n=9）

注：與正常組相比，**P＜0.05；與模型組相比，##P＜0.05；與云南白藥膏組相比，△△P＜0.05。

組別正常組模型組治傷巴布劑組云南白藥膏組F 值P 值1 d 1.19±0.25 4.62±0.43**3.67±0.55**##△△3.70±0.26**##124.343 0.000 3 d 0.96±0.15 3.27±0.45**2.50±0.40**##△△2.94±0.22**##87.085 0.000 7 d 1.11±0.19 4.03±0.48**2.62±0.22**##△△3.22±0.30**##136.374 0.000

3.3 各組大鼠DRG 中VR1 蛋白表達(dá)比較

與正常組比較，模型組大鼠在3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)DRG中VR1 蛋白表達(dá)水平增加（P＜0.05）；與模型組比較，治傷巴布劑組和云南白藥膏組大鼠在3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)DRG 中VR1 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與云南白藥膏組相比，治傷巴布劑組大鼠DRG 中VR1蛋白表達(dá)水平在1、3、7 d 降低（P＜0.05）。 詳見表3、圖2。

圖2 各組大鼠DRG 中VR1 蛋白表達(dá)電泳圖

表3 4 組大鼠DRG 中VR1 條帶灰度分析結(jié)果（±s，n=9）

表3 4 組大鼠DRG 中VR1 條帶灰度分析結(jié)果（±s，n=9）

注：與正常組相比，**P＜0.05；與模型組相比，##P＜0.05；與云南白藥膏組相比，△△P＜0.05。

組別正常組模型組治傷巴布劑組云南白藥膏組F 值P 值1 d 0.13±0.20 0.59±0.15**0.27±0.08**##△△0.28±0.10**##11.366 0.003 3 d 0.16±0.06 0.55±0.08**0.29±0.09**##△△0.33±0.10**##11.734 0.003 7 d 0.13±0.03 0.57±0.08**0.24±0.06**##△△0.27±0.05**##31.353 0.000

3.4 各組大鼠足底肌肉中NGF 及DRG 中p-p38MAPK相對(duì)表達(dá)量比較

與正常組比較，模型組大鼠足底肌肉中NGF 及DRG 中p-p38MAPK 在3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)相對(duì)表達(dá)量增加（P＜0.05）；與模型組比較，治傷巴布劑組和云南白藥膏組中大鼠足底肌肉中NGF 及DRG 中p-p38MAPK在3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）；與云南白藥膏組相比，治傷巴布劑組大鼠足底肌肉中NGF 相對(duì)表達(dá)量在3、7 d 降低，1 d 增加 （P＜0.05），DRG 中pp38MAPK 相對(duì)表達(dá)量在3 d 降低，1、7 d 增加（P＜0.05）。詳見表4、表5 和圖3、圖4。

圖3 各組大鼠足底肌肉中NGF 相對(duì)表達(dá)病理圖片（光鏡，×400）

圖4 各組大鼠DRG 中p-p38MAPK 的相對(duì)表達(dá)病理圖片（光鏡，×400）

表4 4 組大鼠足底肌肉中NGF 相對(duì)表達(dá)量比較（±s，n=9）

表4 4 組大鼠足底肌肉中NGF 相對(duì)表達(dá)量比較（±s，n=9）

注：與正常組相比，**P＜0.05；與模型組相比，##P＜0.05；與云南白藥膏組相比，△△P＜0.05。

組別正常組模型組治傷巴布劑組云南白藥膏組F 值P 值1 d 1.92±0.81 48.4±7.67**6.14±1.6**##△△5.18±3.51**##78.681 0.000 3 d 3.83±0.82 38.82±16.04**7.11±2.12**##△△12.83±2.14**##11.340 0.003 7 d 2.46±0.16 47.50±4.33**7.37±1.59**##△△7.85±2.98**##174.149 0.000

表5 4 組大鼠DRG 中p-p38MAPK 相對(duì)表達(dá)量比較（±s，n=9）

表5 4 組大鼠DRG 中p-p38MAPK 相對(duì)表達(dá)量比較（±s，n=9）

注：與正常組相比，**P＜0.05；與模型組相比，##P＜0.05；與云南白藥膏組相比，△△P＜0.05。

組別正常組模型組治傷巴布劑組云南白藥膏組F 值P 值1 d 3.22±0.75 5.50±0.61**4.62±1.10**##△△4.06±1.51**##1.896 0.209 3 d 3.73±1.94 6.93±0.93**4.09±2.75**##△△5.17±2.72**##1.264 0.350 7 d 2.24±0.74 5.79±0.75**4.76±2.16**##△△1.58±0.66**##7.764 0.009

4 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為疼痛產(chǎn)生的原因分為“不通則痛”?！安煌▌t痛”指當(dāng)正氣虛弱或?qū)嵭白铚?，?dǎo)致人體的氣血在經(jīng)絡(luò)中運(yùn)行受阻，此時(shí)應(yīng)行氣活血來散淤通經(jīng)、活絡(luò)止痛，炎性疼痛則屬于“不通則痛”。 治傷巴布劑屬于外敷中藥制劑，主要由血?dú)?、虎杖、見風(fēng)消組成，臨床將其用于治療急慢性腰肌損傷和其他軟組織損傷、關(guān)節(jié)扭傷、關(guān)節(jié)炎等疾病導(dǎo)致的疼痛，以發(fā)揮其通絡(luò)止痛的治療作用。

本研究通過治傷巴布劑外敷干預(yù)炎性疼痛大鼠模型，在1、3、7 d 取材，檢測(cè)大鼠VR1 蛋白和mRNA 表達(dá)水平以及NGF 和p-p38MAPK 蛋白的表達(dá)量；以往的研究[20]表明p-p38MAPK蛋白的表達(dá)量與VR1 蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)。 本研究表明，與模型組比較， 治傷巴布劑組和云南白藥膏組大鼠DRG 中VR1的蛋白和mRNA 表達(dá)水平在1、3、7 d 降低（P＜0.05）；與云南白藥膏組比較，治傷巴布劑組大鼠DRG 中VR1 的蛋白和mRNA 表達(dá)水平在1、3、7 d 降低（P＜0.05）。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠足底肌肉中NGF 及DRG 中p-p38MAPK 相對(duì)表達(dá)量在1、3、7 d 增加（P＜0.05）；與模型組比較，治傷巴布劑組和云南白藥膏組中大鼠足底肌肉中NGF 及DRG 中p-p38MAPK 相對(duì)表達(dá)量在1、3、7 d降低（P＜0.05），與云南白藥組相比，治傷巴布劑組大鼠足底肌肉中NGF 相對(duì)表達(dá)量在3、7 d 降低，1 d增加（P＜0.05），DRG 中p-p38MAPK 相對(duì)表達(dá)量在3 d 降低，1、7 d 增加（P＜0.05）。

根據(jù)以上結(jié)果，我們可以得出以下結(jié)論：（1）治傷巴布劑鎮(zhèn)痛作用是通過NGF/p38MAPK/VR1 信號(hào)通路調(diào)控VR1 蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的；（2）云南白藥膏組的VR1 的蛋白和mRNA 表達(dá)水平出現(xiàn)不匹配現(xiàn)象，可能存在其他通路影響VR1 的翻譯，但從結(jié)果來看，治傷巴布劑對(duì)于VR1 轉(zhuǎn)錄與翻譯的抑制作用均強(qiáng)于云南白藥膏組；（3）治傷巴布劑對(duì)于NGF 的釋放具有抑制作用；（4）根據(jù)大鼠DRG 中p-p38MAPK相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果，與治傷巴布劑比較，云南白藥膏與p38MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)性更強(qiáng)。 本研究以炎癥反應(yīng)為出發(fā)點(diǎn)，揭示了治傷巴布劑對(duì)于炎性疼痛鎮(zhèn)痛的作用機(jī)制可能是通過調(diào)控NGF/p38MAPK/VR1 信號(hào)通路影響VR1 的轉(zhuǎn)錄和翻譯，為指導(dǎo)臨床用藥及中醫(yī)中藥的應(yīng)用提供新思路。

本實(shí)驗(yàn)還有許多不足：（1）本研究有待大樣本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；（2）炎性疼痛反應(yīng)還受存在相互聯(lián)系的JAK/STAT、mTOR 及多條重要信號(hào)通路的調(diào)控[21-22]，治傷巴布劑是否通過這些途徑發(fā)揮了作用，本研究未能明確，這需要我們?cè)诮窈蟮难芯恐欣^續(xù)探索與研究。