顧浩天,王冬生,張?zhí)熹?滕海媛,袁永達

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境保護研究所,上海 201403)

蚯蚓體壁和腸道空間的體腔液中包含多種抗菌和凝血作用的生物活性分子[1]。胞溶素(Lysenin,LYS)最初從蚯蚓體腔液體中被提取克隆,是具有生物活性的穿孔毒素蛋白[2],可誘導(dǎo)小鼠血管平滑肌收縮。胞溶素及其相關(guān)蛋白(LYS-related proteins)目前僅在愛勝蚓屬(Eisenia andrei、Eisenia fetida)及兩者雜交體中被發(fā)現(xiàn),而在其他正蚓科如Dendrobaena veneta、Lumbricus terrestris、Lumbricus rubellus、Aporrectodea caliginosa等中未被發(fā)現(xiàn)[3]。胞溶素蛋白分子量約為33 Ku,含有297個氨基酸,由1 600個堿基編碼[4]。目前在愛勝蚓屬中已分離出三種胞溶素相關(guān)蛋白,它們高度同源且與LYS共同組成LYS多蛋白家族[5]。Ohta等[6]證明LYS基因(mRNA)主要在盲道(Typhlosole)的黃色細胞中(Chloragocyctes)表達,而其蛋白只在體腔液中懸浮油細胞中表達[7]。

動物細胞膜磷脂(Sphingomyelin,SM)是胞溶素的膜靶標[8]。胞溶素以SM依賴性的方式結(jié)合到細胞膜表面形成寡聚物,造成寄主細胞膜表面穿孔,從而引發(fā)溶血反應(yīng)、抗菌活性、平滑肌收縮活性及細胞毒性[3,7,9-10]。蚯蚓體內(nèi)沒有SM且具有成孔毒素的抑制機制[11],因此胞溶素對蚯蚓無自毒活性,相反在其免疫防御中起作用[5]。例如,在Eudrilus eugeniae中胞溶素蛋白具有抗菌、溶血、蛋白質(zhì)水解等活性[1]。本文從胞溶素的理化分子結(jié)構(gòu)出發(fā),總結(jié)探討其生物學(xué)功能、作用機制及應(yīng)用價值,并對其發(fā)展前景進行展望,以期為下一步胞溶素蛋白研究提供參考和依據(jù)。

1 胞溶素的理化分子結(jié)構(gòu)

研究表明,胞溶素多蛋白家族包含四個亞型,即Lysenin(NCBI登錄號,BAA21518)、Lysenin-related protein 1(O18424)、Lysenin-related protein 2∕fetidin(O18425)、Lysenin-related protein 3(Q3LX99),幾種蛋白氨基酸序列相似度高達76%—89%[5,12]。在E.fetida中其亞型主要為Lysenin、LRP-1、LRP-2(Fetidin);在E.andrei中其亞型則主要為Lysenin、LRP-3、LRP-2(Fetidin)[3]。其中LRP-2與Fetidin的氨基酸序列相似度為100%,核苷酸序列相似度為99%,暗示兩者為同一蛋白[9]。

LYS的結(jié)構(gòu)特點影響其生物學(xué)功能。Lysenin序列C端(161—297 aa)是與SM結(jié)合的活性部位,而N端(1—160 aa)參 與 細胞膜孔道的 形 成[13]。Lassèues等[14]在Fetidin中發(fā)現(xiàn)保守模體序列(ETKTLTASHSI)與其過氧化物酶活性相關(guān),在抗菌功能中有重要作用[15]。在Lysenin及LRP-1中也發(fā)現(xiàn)該保守模體,但兩者是否有過氧化物酶活性不清楚[9]。序列分析表明,在LYS蛋白家族中保守的210位苯丙氨酸及色氨酸殘基(W20、W187、W245、W291)與SM結(jié)合相關(guān),且色氨酸殘基還參與SM識別、寡聚物形成及溶血反應(yīng)[10]。Lysenin和LRP-2蛋白序列中210位為苯丙氨酸,因此可以特異地與SM結(jié)合發(fā)生溶血反應(yīng);LRP-1蛋白序列中210位為異亮氨酸,與SM結(jié)合能力及溶血活性大幅減弱[9]。而LRP-3目前功能未知。X射線晶體學(xué)顯示,Lysenin屬于氣溶素(Aerolysin)毒素家族,每個Lysenin單體含有受體結(jié)合域及孔道形成模塊(圖1)[16]。

圖1 LYS結(jié)構(gòu)的X射線圖[16]Fig.1 Lysenin water-soluble monomeric X-ray structure[16]

2 胞溶素的生物學(xué)功能

2.1 結(jié)合鞘磷脂

SM主要存在于大多數(shù)脊椎動物細胞膜外葉,且和膽固醇共同組成細胞膜脂質(zhì)筏[9,17]。研究表明,LYS與SM具有較高親和性(Kd=5.3×10-9M)[18],在細胞膜表面僅與SM特異性結(jié)合,且一個LYS分子與五個SM分子結(jié)合[19]。SM中的鞘氨醇、磷酰膽堿、脂肪酸基團及SM分子的親水頭部和疏水尾部共同促進了SM與LYS的互作結(jié)合[8,18]。此外,SM濃度、密度、分布也影響其與LYS的結(jié)合[20-21]。

2.2 誘導(dǎo)細胞溶血

LYS誘導(dǎo)細胞發(fā)生溶血反應(yīng)的過程主要分為三階段[9]:(1)與靶細胞膜表面的SM結(jié)合;(2)LYS-SM復(fù)合物形成寡聚物,增加細胞膜通透性;(3)寡聚物插入形成孔道,發(fā)生溶血反應(yīng)(圖2)。細胞膜表面膽固醇促進LYS寡聚物的形成,而較高SM∕LYS比值減少了寡聚化[22],SM中的脂肪酸組成也會影響LYS的寡聚化[21]。

圖2 細胞膜溶血反應(yīng)圖示[12]Fig.2 The schematic sketch of membrane hemolysis[12]

LYS-SM結(jié)合及寡聚化過程在4℃環(huán)境中也能發(fā)生,不依賴環(huán)境溫度[8]。而孔道形成只能在37℃發(fā)生[12]。LYS形成的孔道直徑約3 nm且呈蜂窩狀正六邊形結(jié)構(gòu)(圖3)[8,23]。去除N端的LYS(Non-toxic-Lysenin,NT-Lys,161—297)可抑制寡聚化過程,因此無細胞毒性[24]。

圖3 LYS插入形成蜂窩狀正六邊形孔道[8]Fig.3 TEM image of LYS channels inserted in a lipid membrane[8]

LYS可誘導(dǎo)脊椎動物細胞發(fā)生溶血反應(yīng),且該反應(yīng)發(fā)生依賴于溫度和劑量[8,18]。僅5 ng∕mL LYS即可誘導(dǎo)綿羊體內(nèi)50%紅細胞發(fā)生溶血反應(yīng)[18,21]。靜脈注射60 mg∕kg LYS后,小鼠紅細胞凝集、血小板被破壞,形成血栓而導(dǎo)致其呼吸困難甚至死亡[9]。此外,LYS還誘導(dǎo)大多數(shù)脊椎動物的精細胞死亡、兩棲動物表皮剝落,而只對極少數(shù)無脊椎動物細胞產(chǎn)生溶血反應(yīng)[9,25]。這可能由于無脊椎動物細胞膜含有較高濃度SM,易與LYS結(jié)合發(fā)生功能反應(yīng),而大量無脊椎動物體內(nèi)無SM;也可能是無脊椎動物細胞膜表面SM被糖脂、糖蛋白等物質(zhì)包被,而無法被LYS識別結(jié)合[9,26]。

2.3 形成離子通道

離子通道對生命系統(tǒng)維持基礎(chǔ)的生理及生物學(xué)過程至關(guān)重要。研究表明,成孔毒素蛋白通過結(jié)合寄主細胞膜SM,組裝成較長的β折疊(9—11 nm)及較寬的孔洞(2.5 nm),呈現(xiàn)離子選擇性。LYS因其高運輸速率、由配體及電壓調(diào)節(jié)而具有離子通道特點,從而可調(diào)節(jié)細胞的跨膜電壓,且對陽離子有更高的選擇性[27-28]。

在負電壓下LYS通道處于開放狀態(tài),當(dāng)電解質(zhì)濃度及pH變化較大時,仍保持穩(wěn)定[27]。由于LYS通道可允許大分子穿梭轉(zhuǎn)移,而被用于鑒定和表征單肽分子的納米傳感器。LYS形成的離子通道被廣泛應(yīng)用于開發(fā)新藥、治療策略、合成生物學(xué)等領(lǐng)域[29-30]。

2.4 參與免疫防御

蚯蚓進化形成了應(yīng)對細菌及病毒侵染的獨特機制,將細菌Pseudomonas aeruginosa、Bacillus subtilis注射蚯蚓體腔后,LYS大量分泌[1],推測LYS是蚯蚓體液免疫的重要成分[31]。蚯蚓體腔細胞暴露于革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中,誘導(dǎo)了LYS的分泌和表達增加[7]。大腸桿菌(Escherichia coli)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)均刺激LYS家族的基因和蛋白表達[32-33]?；趇TRAQ的蛋白組分析表明,E.fetida受大腸桿菌(E.coliO157:H7)脅迫7 d后,LYS蛋白表達顯著上調(diào)[34]。這些研究均表明LYS蛋白家族對多種真菌、細菌、小型無脊椎寄生蟲等有抗菌活性[35]。鑒于LYS要與SM結(jié)合后發(fā)揮功能,而這些生物體的膜表面無SM,因此Bruhn等[5]推測LYS可能與這些生物體內(nèi)的其他受體結(jié)合,通過不依賴于SM的作用方式產(chǎn)生抗菌活性,如調(diào)理素特性[36]、過氧化物酶活性等[15]。此外,Hirigoyenberry等[37]發(fā)現(xiàn)蚯蚓體內(nèi)溶菌酶和LYS共同作用抵御外源病原菌感染,溶菌酶作為快速響應(yīng)物質(zhì),LYS作為長效抗菌分子。

蚯蚓為避免被鳥類、鼠類等高營養(yǎng)級捕食,排出具有抗菌活性、細胞毒性、溶血活性的體腔液(圖4),因此LYS參與組成蚯蚓防御捕食者的適應(yīng)性策略[3]。LYS還能誘導(dǎo)體腔細胞的吞噬作用。如在體外試驗中,LYS可以與銀納米材料結(jié)合,形成“protein corona”促進體腔細胞對其的吞噬活性[36,38]。LYS可能作為“find-me∕eat-me”信號介導(dǎo)蚯蚓體內(nèi)巨噬細胞的胞吞作用[39]。

圖4 蚯蚓排出體腔液抵御捕食者[40]Fig.4 The ejection of coelomic fluid from earthworms against predators[40]

綜上,LYS通過依賴于SM及不依賴SM的兩種互補作用方式,參與蚯蚓響應(yīng)生物因子和非生物因子脅迫的免疫防御。因此LYS可作為動物免疫反應(yīng)的潛在誘導(dǎo)劑,具有廣闊應(yīng)用前景。

2.5 激活細胞凋亡信號

SM與膽固醇共同組成的脂質(zhì)筏上含有如G蛋白、GPI錨定蛋白、酰化蛋白等大量信號分子,在信號傳導(dǎo)中有重要作用[41]。因此,SM不僅是細胞膜的結(jié)構(gòu)成分,同時介導(dǎo)細胞信號通路,其多種代謝產(chǎn)物作為第二信使參與調(diào)節(jié)細胞生長、分化、凋亡[42-43]。LYS主要以兩種形式調(diào)控細胞凋亡:(1)參與調(diào)控依賴半胱氨酸蛋白酶(Caspase)的細胞凋亡信號[33];(2)與SM結(jié)合在膜表面形成穿孔,使得SM在脂質(zhì)筏的空間結(jié)構(gòu)改變[44],增加細胞質(zhì)的鈣離子濃度同時降低鉀離子濃度[45-46],進而誘導(dǎo)激活細胞凋亡信號。

3 胞溶素的潛在應(yīng)用

3.1 生物膜脂質(zhì)標記

添加熒光基團(Alexa Fluor)或結(jié)合熒光蛋白(mCherry)及其他分子標記(125I,麥芽糖結(jié)合蛋白等)的LYS可用于檢測鞘磷脂SM[47]。NT-lysenin具有SM結(jié)合特異性而無細胞毒性[24]。利用改造的NTlysenin添加熒光標簽[26,48]或LYS蛋白抗體[9],可實時檢測、監(jiān)測、定位SM在生物膜及細胞內(nèi)的動態(tài)變化[23]。如Yoshida等[49]利用LYS抗體探針評估SM在小鼠表皮發(fā)育過程中的細胞動態(tài)分布。此外,Hanada等[50]利用LYS篩選中國倉鼠體內(nèi)不能合成SM的突變卵巢細胞。綜上,LYS可以作為標記SM或研究膜生理學(xué)的生物傳感器[21]。

3.2 疾病診斷治療

LYS對人類肺癌細胞、結(jié)腸癌細胞、乳腺癌細胞、表皮癌細胞及小鼠白血病細胞均有毒性作用[9,51]。因此,可利用LYS的細胞溶血毒性進行腫瘤等疾病治療。Yamaji等[18]提出利用LYS與SM特異性結(jié)合的特點診斷神經(jīng)磷脂貯積病,如尼曼匹克病類型A(NPA)等。此外,Hayashi等[36]發(fā)現(xiàn)LYS的抗菌調(diào)理素活性可促進蚯蚓切斷組織再生修復(fù),表明LYS在傷口愈合、抗菌消炎等方面具有有益作用[52]。最新研究發(fā)現(xiàn),E.fetida可以有效免疫新型冠狀病毒(COVID-19),當(dāng)向人體細胞注射無毒NT-Lys后可消除新冠病毒感染。其具體機制可能為:胞溶素蛋白與新冠病毒包膜上的鞘磷脂結(jié)合,形成穿孔并破壞其結(jié)構(gòu),使病毒無法與宿主細胞膜結(jié)合,從而阻斷其感染過程。因此具有抗病毒活性的胞溶素蛋白家族可用于治療新冠病毒及其他病毒疾病[53]。

3.3 響應(yīng)脅迫的生物標記

胞溶素相關(guān)蛋白2(LRP-2)可以清除線粒體內(nèi)具有潛在毒性的超氧自由基[54]。E.fetida暴露于多種重金屬污染的土壤中,LYS表達顯著上調(diào)[55];重金屬鎘(Cd)和溫度雙重脅迫誘導(dǎo)下,E.andrei中LYS表達顯著下調(diào)[56];E.andrei、E.fetida及兩者的雜交體受Cd脅迫后,體內(nèi)LYS均顯著下調(diào)[57];Wu等[58]研究表明,蚯蚓受菲污染脅迫后,LYS家族蛋白表達均顯著下調(diào)。綜上,LYS對不同污染物有不同的響應(yīng),可作為蚯蚓響應(yīng)環(huán)境脅迫的生物標記。

3.4 生物源農(nóng)藥

盡管無脊椎動物細胞膜表面SM含量極低,或不含SM[59],LYS仍可對少數(shù)昆蟲的精細胞及血淋巴細胞產(chǎn)生毒性[9,25]。最近研究表明,在無脊椎動物中SM的類似物為神經(jīng)酰胺磷酸乙醇胺(CPE)[60]。Panevska等[61]發(fā)現(xiàn)來源于Aegerolysins家族的成孔毒素與含MACPF(Membrane-attack-complex∕perforin)的伴侶蛋白形成復(fù)合物,可與玉米根葉甲及馬鈴薯甲蟲的中腸細胞膜CPE結(jié)合,產(chǎn)生殺蟲活性且不易形成突變抗性。來源于氣溶素(Aerolysin)家族的LYS是否也能產(chǎn)生殺蟲活性,能否作為生物源農(nóng)藥進行應(yīng)用開發(fā),需要進一步研究。

4 小結(jié)與展望

本文分析了胞溶素家族蛋白的分子理化結(jié)構(gòu),探討了LYS的細胞溶血毒性、免疫防御、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能,同時指出其在分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用價值。為更好開發(fā)利用LYS的特性及功能,建議未來研究重點關(guān)注以下幾個方面:(1)探索LYS誘導(dǎo)細胞溶血毒性、參與細胞凋亡信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、產(chǎn)生抗菌活性的內(nèi)在分子機理,為研發(fā)新型生物源農(nóng)藥、抗癌和抗菌類藥物等奠定理論基礎(chǔ)。(2)比較分析LYS蛋白家族不同亞型間的作用機制,研究LRP-3在蚯蚓體內(nèi)、體外的功能活性。(3)利用基因工程技術(shù)重組改造LYS蛋白分子,挖掘其衍生物,解決其溶血毒性風(fēng)險[12],以便開發(fā)脂質(zhì)標記探針、生物傳感器識別定位SM,研究膜成孔機理。(4)基于蚯蚓成孔毒素的抗病毒機制,研制無細胞毒性的胞溶素蛋白疫苗,用于治療新冠病毒(COVID-19)以及其他病毒。