宋春宏,顧文佳,葛 宇

(上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院,上海 200233)

新鮮蔬菜富含維生素、纖維素、礦物質(zhì)和其他營(yíng)養(yǎng)元素,是人們膳食中不可缺少的組成部分[1-2],人類身體所需的維生素C和維生素A大部分來自于蔬菜[3]。許多研究表明,經(jīng)常規(guī)律性地進(jìn)食蔬菜可以減少癌癥、心血管疾病和肥胖癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[4-8]。無土栽培是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中的高新技術(shù),近年來,營(yíng)養(yǎng)液栽培的蔬菜面積在我國(guó)不斷增加,利用營(yíng)養(yǎng)液代替土壤直接向植物根系提供生長(zhǎng)發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)元素的栽培方式,具有產(chǎn)量高、品質(zhì)好、病蟲害輕、不受土壤資源限制、易于工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)[9]。

營(yíng)養(yǎng)液是無土栽培中植物生長(zhǎng)的主要營(yíng)養(yǎng)來源,因此營(yíng)養(yǎng)液的日常管理是無土栽培管理的核心環(huán)節(jié)[10]。由于長(zhǎng)期循環(huán)使用,營(yíng)養(yǎng)液會(huì)滋生大量的微生物,使用壽命縮短,增加生產(chǎn)成本。目前,國(guó)內(nèi)外關(guān)于營(yíng)養(yǎng)液廢液的處理方式包括循環(huán)重復(fù)利用和不循環(huán)排出方式。營(yíng)養(yǎng)液廢液循環(huán)重復(fù)利用是指已經(jīng)使用過的營(yíng)養(yǎng)液廢液經(jīng)消毒過濾和營(yíng)養(yǎng)復(fù)配等一系列措施,重新回流到原栽培系統(tǒng)循環(huán)中再被植物吸收利用,該方式已被歐盟等發(fā)達(dá)國(guó)家廣泛應(yīng)用[11]。不循環(huán)利用是由于受到技術(shù)和成本等因素限制只能將利用一次后的廢液直接排入環(huán)境,這種方式造成了大量未被植物吸收利用的氮、磷、鉀、NO2-3和其他化學(xué)物質(zhì)的浪費(fèi),同時(shí)也會(huì)造成河流等水體的富營(yíng)養(yǎng)化問題,對(duì)地表和地下水造成污染。未經(jīng)處理的營(yíng)養(yǎng)液廢液二次利用時(shí)容易造成病蟲害在栽培體系中廣泛傳播,會(huì)造成不可估量的損失。因此,科學(xué)的營(yíng)養(yǎng)液廢液循環(huán)利用成為目前無土栽培研究中的一個(gè)熱點(diǎn)問題[12-15]。

目前,臭氧、紫外線已廣泛應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)液的殺菌消毒,具有低毒、無殘留、環(huán)保的特點(diǎn),但對(duì)其在無土栽培過程中微生物變化影響的研究較少。本試驗(yàn)在水培菠菜培育至成熟的過程中,對(duì)其營(yíng)養(yǎng)液供液端和回液端的菌落總數(shù)、大腸菌群等指示菌數(shù)據(jù)進(jìn)行跟蹤和對(duì)比,并對(duì)這一過程中營(yíng)養(yǎng)液及成熟蔬菜的菜葉和菜根所含的菌落進(jìn)行初步鑒定,以期為后續(xù)水培蔬菜微生物風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 水培菠菜

菠菜品種‘綠冠三號(hào)’由上海綠立方農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基與儀器

平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂、煌綠乳糖膽鹽肉湯、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂、李斯特菌選擇性添加劑瓊脂、李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基、改良EC肉湯培養(yǎng)基、改良山梨醇麥康凱瓊脂、大腸埃希氏菌O157顯色培養(yǎng)基、尿素瓊脂(以上培養(yǎng)基和試劑均由北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供)、緩沖蛋白胨水、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液、四硫磺酸鈉煌綠、亞硫酸鉍瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂、李氏菌增菌肉湯(以上培養(yǎng)基和試劑均由無錫賽微生物技術(shù)有限公司提供)、BP瓊脂平板(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)。

SMI12生化培養(yǎng)箱(美國(guó)Shellab公司),均質(zhì)機(jī)(法國(guó)Interscience公司),AUTOF MS2000e MALDITOF MS(鄭州安圖生物工程股份有限公司),全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏分析系統(tǒng)(法國(guó)生物梅里埃公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菠菜生長(zhǎng)過程中營(yíng)養(yǎng)液和蔬菜的微生物監(jiān)測(cè)

將菠菜小苗在基質(zhì)中培植一周后定植到栽培床上,根據(jù)外界氣候與作物特點(diǎn),通過備風(fēng)機(jī)、濕簾、天窗等環(huán)境管控設(shè)施對(duì)棚內(nèi)溫濕度及光照環(huán)境進(jìn)行控制,以維持相對(duì)穩(wěn)定的最佳生長(zhǎng)環(huán)境條件。對(duì)于營(yíng)養(yǎng)液,使用紫外強(qiáng)度100 μW∕cm2的紫外線對(duì)混入施肥機(jī)之前的水源進(jìn)行消毒(每日18:00至次日5:00每小時(shí)開啟20 min);在回液端通過濾棉先把營(yíng)養(yǎng)液里的雜質(zhì)過濾掉,再通過4—5 mg∕L的臭氧對(duì)回流到封閉水箱的營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行消毒(每日18:00至次日5:00每小時(shí)開啟20 min),之后營(yíng)養(yǎng)液循環(huán)到供液端,以維持菠菜生長(zhǎng)環(huán)境的相對(duì)潔凈。

分別于菠菜移栽到栽培床后的1—7周每周對(duì)供液端和回液端的營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行無菌采樣(用無菌袋直接接取100 mL營(yíng)養(yǎng)液,封好無菌袋,防止污染),對(duì)營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行菌落總數(shù)和大腸菌群計(jì)數(shù),并于培育的第1周和第7周對(duì)營(yíng)養(yǎng)液和水培菠菜的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、大腸埃希氏菌O157:H7∕NM等致病菌進(jìn)行檢測(cè)。菌落總數(shù)檢測(cè)按照GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[16],大腸菌群檢測(cè)按照GB 4789.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》[17],沙門氏菌檢測(cè)按照GB 4789.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》[18],金黃色葡萄球菌檢測(cè)按照GB 4789.10—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》[19],單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測(cè)按照GB 4789.30—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》[20],大腸埃希氏菌O157:H7∕NM檢測(cè)按照GB 4789.36—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸埃希氏菌O157:H7∕NM檢驗(yàn)》[21]。

1.2.2 營(yíng)養(yǎng)液和成品蔬菜中菌相鑒定

將第7周供液端營(yíng)養(yǎng)液、回液端營(yíng)養(yǎng)液稀釋至適宜濃度,涂布至平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基平板上;將成品蔬菜的菜根和菜葉分別均質(zhì)后稀釋至適宜濃度,涂布至平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基平板上。將上述涂布平板置于36℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,從供液端營(yíng)養(yǎng)液平板、回液端營(yíng)養(yǎng)液平板、菜根平板、菜葉平板上分別隨機(jī)挑取不同形態(tài)的菌落,接種于胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基上,36℃培養(yǎng)24 h。用1 μL無菌接種環(huán)蘸取少量菌落直接涂抹于飛行質(zhì)譜靶板樣本孔位上,取1 μL 70%甲酸涂敷于樣本孔位上,徹底干燥后再滴加1 μL α-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)基質(zhì)液,室溫干燥后,進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDITOF MS)鑒定[22]。對(duì)鑒定結(jié)果9.0(種水平置信)以下的菌落,輔助以全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 七周內(nèi)營(yíng)養(yǎng)液中菌落總數(shù)和大腸菌群的變化

養(yǎng)殖戶反映患病牛發(fā)病較為突然，發(fā)病初期表現(xiàn)為精神萎靡不振，鼻鏡干燥，采食量下降，隨著病情的發(fā)展，患病牛食欲廢絕，反芻減少，直至停止，從口腔中分泌出粘稠的唾液，存在明顯的酸臭味。牛會(huì)出現(xiàn)間歇性鼓氣，自主收縮能力減弱，瘤胃蠕動(dòng)能力減弱，用手觸摸瘤胃，內(nèi)部充滿粘膩感、呈粥狀的內(nèi)容物，觸診瘤胃內(nèi)容物松軟，患病牛胃部存在疼痛感，用手輕輕按壓瘤胃存在指痕。患病牛排便量逐漸減少，糞便干硬呈現(xiàn)深褐色，排出的糞便呈現(xiàn)球狀，有時(shí)在糞便表面附著大量粘液。

使用線性回歸法對(duì)營(yíng)養(yǎng)液中菌落總數(shù)和大腸菌群的變化進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,觀察其變化是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分別將菌落總數(shù)(logCFU∕mL)∕大腸菌群(logCFU∕mL)與各個(gè)時(shí)間點(diǎn)擬合直線,進(jìn)行線性回歸分析,通過t檢驗(yàn)法進(jìn)行判斷。

1.3.2 供液端和回液端中菌落總數(shù)和大腸菌群的變化

采用獨(dú)立樣本studentt檢驗(yàn)比較每個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩組間菌落總數(shù)∕大腸菌群數(shù)的差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 菠菜生長(zhǎng)過程中營(yíng)養(yǎng)液菌落總數(shù)、大腸菌群的動(dòng)態(tài)變化

由圖1可以看出,無論是供液端還是回液端,其營(yíng)養(yǎng)液在菠菜成熟的7周過程中菌落總數(shù)始終保持穩(wěn)定(P=0.862,P=0.802);從圖2可以看出,大腸菌群數(shù)值第1周到第7周的下降趨勢(shì)經(jīng)t檢驗(yàn)分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002,P=0.01)。隨著菠菜生長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng),營(yíng)養(yǎng)液經(jīng)反復(fù)循環(huán)殺菌后,菌落總數(shù)沒有顯著增長(zhǎng),大腸菌群的數(shù)量反而下降,說明在菠菜生長(zhǎng)過程中營(yíng)養(yǎng)液的微生物增殖情況得到了有效控制。

圖1 1—7周營(yíng)養(yǎng)液的菌落總數(shù)Fig.1 Total number of colonies of nutrient solution in 1—7 weeks

圖2 1—7周營(yíng)養(yǎng)液的大腸菌群數(shù)量Fig.2 Number of coliforms of nutrient solution in 1—7 weeks

營(yíng)養(yǎng)液殺菌消毒前后各個(gè)時(shí)間段供液端和回液端的菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)量均出現(xiàn)顯著性下降(P＜0.05),說明使用臭氧殺菌的方法對(duì)減少營(yíng)養(yǎng)液中菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)量有效果,避免了微生物在蔬菜生長(zhǎng)過程中的大量繁殖,減少了后續(xù)成品蔬菜微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)。

2.2 菠菜生長(zhǎng)過程中營(yíng)養(yǎng)液和蔬菜的致病菌檢測(cè)

在培育過程中的第1周和第7周,分別對(duì)營(yíng)養(yǎng)液(供液端、回液端)和水培菠菜進(jìn)行沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、大腸埃希氏菌O157:H7∕NM等致病菌的檢測(cè),結(jié)果均未檢出。

2.3 菌種鑒定

從供液端營(yíng)養(yǎng)液平板、回液端營(yíng)養(yǎng)液平板、菜根平板、菜葉平板上分別隨機(jī)挑取有不同菌落形態(tài)的菌落79株、85株、100株、80株,經(jīng)MALDI-TOF MS鑒定,輔助以全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏分析系統(tǒng),結(jié)果見表1—4。

表1 營(yíng)養(yǎng)液回液端菌株鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of bacterial strains at the return end of nutrient solution

從表1和表2可以看出,回液端的營(yíng)養(yǎng)液經(jīng)4—5 mg∕L的臭氧殺菌后,其所含的微生物種類有明顯減少;其中占比最大的食酸菌屬病原細(xì)菌是一種主要危害葫蘆科植物的細(xì)菌[23],經(jīng)殺菌后,占比并未減少,說明此種殺菌方法對(duì)該菌屬的殺滅效果不明顯;而易引起蔬菜腐爛變質(zhì)的假單胞菌屬的細(xì)菌數(shù)量由占比31.9%大幅降低至17.7%,殺菌效果明顯;葡萄球菌等革蘭氏陽性菌經(jīng)臭氧殺菌后在供液端未檢出。以上結(jié)果說明,該濃度的臭氧對(duì)營(yíng)養(yǎng)液中部分有害細(xì)菌起到了明顯的殺滅作用,可降低微生物污染風(fēng)險(xiǎn)。

表2 營(yíng)養(yǎng)液供液端菌株鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of bacterial strains at the supply end of nutrient solution

菠菜在移栽入栽培床時(shí)會(huì)將部分基質(zhì)、土壤一并帶入,這可能成為細(xì)菌生長(zhǎng)的溫床,并可能污染成品菜的葉片。從表3和表4可以看出,菠菜的根部分離出泡囊短波單胞菌、洛菲不動(dòng)桿菌、惡臭假單胞菌等致病菌,但在菜葉中上述幾種菌并未檢出,且分離出的菌落種類從28種減少為19種,提示菠菜成熟后及時(shí)去除根部能有效減少致病性微生物交叉污染的風(fēng)險(xiǎn),降低病害發(fā)生的可能性。在去根之后的菜葉細(xì)菌鑒定結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn),假單胞菌屬的比例占50%以上,該菌屬的細(xì)菌具有很強(qiáng)的產(chǎn)生氨等腐敗產(chǎn)物的能力,且增殖速度極快,極易造成蔬菜腐敗,這也是葉菜相對(duì)不易存放的一個(gè)重要因素。

表3 菜根菌株鑒定結(jié)果Table 3 Identification results of bacterial strains in vegetable roots

表4 菜葉菌株鑒定結(jié)果Table 4 Identification results of bacterial strains in vegetable leaves

3 結(jié)論與討論

蔬菜的微生物污染是食源性疾病的主要風(fēng)險(xiǎn)來源,國(guó)外已發(fā)生多起食用生鮮蔬果引起的食源性疫情。如2011年美國(guó)18個(gè)州因食用被單增李斯特菌污染的哈密瓜暴發(fā)食源性疫情,導(dǎo)致146人患病,30人死亡;2016年美國(guó)因黃瓜暴發(fā)沙門氏菌疫情,導(dǎo)致至少907人感染,其中,204人住院,6人死亡;2018年美國(guó)32個(gè)州因生菜污染大腸桿菌O157:H7暴發(fā)疫情,導(dǎo)致172人食物中毒[24-25]。微生物污染可以發(fā)生在蔬菜供應(yīng)鏈的不同環(huán)節(jié),其中種植和加工是污染風(fēng)險(xiǎn)最大的環(huán)節(jié)[26]。無土栽培相對(duì)土壤種植能夠更有效地控制微生物污染。研究發(fā)現(xiàn),不同基質(zhì)栽培的櫻桃、番茄根際微生物菌落總數(shù)在土壤、稻殼、營(yíng)養(yǎng)液栽培中依次減少;在用不同基質(zhì)栽培甜瓜的研究中也發(fā)現(xiàn),微生物數(shù)量表現(xiàn)為土壤＞碳化稻殼＞稻殼＞珍珠巖＞營(yíng)養(yǎng)液[27],這些研究都說明水培方式相對(duì)于其他栽培方式更加安全可控。臭氧是一種非常強(qiáng)的氧化劑,具有很強(qiáng)的氧化力,如果有足夠的曝氣時(shí)間和濃度,可以殺死水中的所有生物,因此可以用來對(duì)營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行消毒[28]。本研究顯示,在菠菜生長(zhǎng)第1周至第7周成熟過程中,使用臭氧對(duì)營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行殺菌,營(yíng)養(yǎng)液中微生物菌落總數(shù)始終保持相對(duì)穩(wěn)定,大腸菌群數(shù)量有明顯下降趨勢(shì),常見致病菌的檢測(cè)均未檢出;回液端的營(yíng)養(yǎng)液經(jīng)臭氧殺菌后,細(xì)菌種類明顯減少,腐敗菌占比明顯下降,以上均說明水培蔬菜可以通過臭氧殺菌環(huán)節(jié)殺滅部分有害細(xì)菌,較好地控制種植環(huán)境,降低成品蔬菜的微生物污染風(fēng)險(xiǎn)。蔬菜成熟后及時(shí)去根加工,能夠有效減少葉片中致病性微生物種類增長(zhǎng)的風(fēng)險(xiǎn),在一定程度上預(yù)防了交叉污染的可能性。建議企業(yè)在運(yùn)輸、貯存、加工蔬菜之前及時(shí)去根,以降低成品蔬菜的微生物污染風(fēng)險(xiǎn)。

本試驗(yàn)從水培蔬菜的營(yíng)養(yǎng)液種植環(huán)境控制和成品菜去根加工兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)對(duì)微生物污染風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了研究分析,為水培蔬菜微生物污染風(fēng)險(xiǎn)的后續(xù)研究提供了參考數(shù)據(jù)。