林 靜，林建新，張 揚(yáng)，盧和頂，陳山虎，廖長見

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物研究所，福建省特色旱作物品種選育工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350013)

鮮食玉米與普通玉米相比具有甜、糯、嫩、香等特點(diǎn)，營養(yǎng)較高富含維生素和多種微量元素，所以鮮食玉米具有很高的經(jīng)濟(jì)和商品價(jià)值。隨著我國人民生活水平的逐步提高，市場(chǎng)對(duì)鮮食玉米的需求量也越來越大，然而我國對(duì)鮮食玉米品種的研發(fā)和供應(yīng)仍存在很大缺口，因此，提升鮮食玉米品質(zhì)，增加鮮食玉米的市場(chǎng)供應(yīng)，對(duì)保障我國國民生活水平具有重要意義。福建省地處東南山區(qū)，可用耕地面積十分匱乏，素有“八山一水一分田”之稱，開發(fā)經(jīng)濟(jì)價(jià)值相對(duì)較高的農(nóng)作物對(duì)提升當(dāng)?shù)剞r(nóng)民收入具有重要意義，因此，鮮食玉米成為福建省可選的特色經(jīng)濟(jì)作物之一。

鮮食玉米具有即食的特點(diǎn)，其保鮮期和上市期都很短。根據(jù)播種時(shí)期，鮮食玉米在福建省可分為春、秋兩季種植，而提前上市可以顯著提高入市時(shí)的銷售價(jià)格。然而對(duì)于春播的鮮食玉米，種植太早苗期遇低溫會(huì)導(dǎo)致減產(chǎn)和品質(zhì)下降，而延后種植又會(huì)導(dǎo)致入市價(jià)格不理想。玉米是一個(gè)對(duì)溫度非常敏感的作物[1]，有研究表明，玉米適宜生長的高溫在25～28 ℃，適宜的低溫在5～18 ℃，高于或低于這個(gè)區(qū)間的溫度其產(chǎn)量和品質(zhì)都會(huì)受到顯著影響[2]。例如通過設(shè)置不同播種期研究玉米生長發(fā)育進(jìn)程發(fā)現(xiàn)，玉米的生長速率與溫度密切相關(guān)，平均氣溫每升高1 ℃，出苗速率提升17%，營養(yǎng)生長速率提升5%；平均氣溫每降低0.7 ℃，玉米成熟期將延遲7 d，發(fā)生一般低溫冷害，玉米單產(chǎn)減少8%；氣溫下降1 ℃，生育期延遲10 d，發(fā)生嚴(yán)重低溫冷害，減產(chǎn)10%以上[3]，低溫脅迫還會(huì)導(dǎo)致玉米籽粒灌漿期縮短，從而導(dǎo)致空稈、禿頂及癟粒增多等現(xiàn)象[4]。此外，低溫還會(huì)影響細(xì)胞分化的速度，受低溫影響葉片大小和數(shù)目都會(huì)顯著減少，即使后期溫度回升，由于葉片面積和數(shù)量不足無法支撐苗期的快速發(fā)育，也會(huì)影響玉米產(chǎn)量和品質(zhì)[5-6]。

植物受冷害脅迫后應(yīng)激反應(yīng)會(huì)表現(xiàn)在多種形式上，例如活性氧(ROS)升高以及一些具有保護(hù)作用小分子的合成等[7]。在分子機(jī)制上普遍認(rèn)為，冷害會(huì)顯著影響植物的光合系統(tǒng)Ⅱ(PS Ⅱ)的活性，進(jìn)一步影響植物的光合作用，而光合作用的減弱將會(huì)影響植物能量的合成和儲(chǔ)備，從而降低植物對(duì)冷害的耐受性，但不同的植物對(duì)冷害的耐受性也存在顯著差異[8]。在應(yīng)對(duì)冷害上，植物激素和MAPK兩大信號(hào)通路起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，其中鈣結(jié)合蛋白、蛋白激酶和蛋白磷酸酶等又是這2個(gè)通路中的一些關(guān)鍵因子[9-10]，但對(duì)于耐冷的遺傳調(diào)控機(jī)制研究相對(duì)較少。而相關(guān)耐冷機(jī)制的研究在鮮食玉米上也非常有限[1]。玉米的耐冷是一個(gè)復(fù)雜的性狀，生理機(jī)制上冷害脅迫會(huì)影響玉米的一些主要農(nóng)藝性狀，但調(diào)控玉米主要農(nóng)藝性狀的主效基因卻不能顯著影響玉米的耐冷特性[11]，暗示著玉米耐冷機(jī)制是需要多基因和信號(hào)通路協(xié)調(diào)作用，因此，單獨(dú)或局部研究某個(gè)基因或調(diào)控通路很難全面解析耐冷性狀的分子機(jī)制。關(guān)于玉米耐冷的多基因和網(wǎng)絡(luò)協(xié)調(diào)調(diào)控機(jī)制的研究也在逐步開展，如Sobkowiak等[12]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于冷害脅迫最先響應(yīng)的是光合系統(tǒng)，隨后細(xì)胞結(jié)構(gòu)和發(fā)育過程的調(diào)控通路也會(huì)隨之發(fā)生變化，但其具體的調(diào)控通路和關(guān)鍵調(diào)控基因仍不明確。

本研究以福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所培育的耐寒鮮食玉米品種閩甜6855為材料，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法解析受冷害脅迫后，耐寒玉米品種在轉(zhuǎn)錄水平上的基因組表達(dá)量變化，以期從宏觀的角度初步揭示玉米抗寒過程中涉及的關(guān)鍵調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和基因，為深入解析玉米抗寒的分子機(jī)制提供參考數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)中使用材料為福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所自主選育的甜玉米品種閩甜6855，在以往栽培年份中表現(xiàn)出較好的耐寒性。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 試驗(yàn)中使用的玉米材料釆用盆栽方式種植培養(yǎng)，在室外正常培養(yǎng)玉米至二葉一心時(shí)，選擇無病、健壯、生長勢(shì)均勻的幼苗置于25 ℃培養(yǎng)箱中預(yù)處理24 h，隨后置于5 ℃低溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行冷處理，每個(gè)處理20株，3 次生物學(xué)重復(fù)。以未進(jìn)行低溫處理的玉米葉片作對(duì)照，每隔24 h取樣1次，冷處理最長至72 h。每次取樣隨機(jī)選取5株，剪取相同部位的葉片置于液氮速凍，然后保存于-80 ℃冰箱待用。

1.2.2 RNA 的提取和純化 測(cè)序中使用的葉片總RNA利用Total Plant RNA Extraction kit(Karroten，Beijing，中國)進(jìn)行提取。提取后RNA 的質(zhì)量檢測(cè)方法如下：電泳檢測(cè)：用DEPC水配制1×TAE電泳緩沖液，制作2%瓊脂糖凝膠，120 V 電泳檢測(cè)，觀察RNA條帶是否降解；分光光度計(jì)檢測(cè)：取2 μL RNA溶液，用 NanoDrop 2000核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)RNA 濃度及純度，當(dāng)RNA濃度 ≥300 ng/μL、 OD260/280= 2.0～2.2、OD260/230≥1.0時(shí)，表示質(zhì)量合格，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 文庫的構(gòu)建、測(cè)序及差異分析 轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建由北京諾禾致源生物科技有限公司進(jìn)行流程化的制備，合格后在Nova-seq 6000測(cè)序儀上進(jìn)行雙末端測(cè)序。對(duì)下機(jī)的 raw reads利用 fastp[13]進(jìn)行質(zhì)控，過濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)得到。將得到的 Clean Date 使用 TopHat version 2.0.10 與玉米參考基因組B73比對(duì)，進(jìn)行基因表達(dá)量的計(jì)算。獲得基因的 FPKM 值，利用 edgeR的方法尋找差異表達(dá)基因(Differentially expressed genes，DEGs)。在篩選差異表達(dá)基因時(shí)，以P<0.05 且 Fold Change≥2 作為差異標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 主成分(PCA)和KEGG注釋分析 樣品間主成分(PCA)分析和KEGG注釋分析均在基迪奧云分析平臺(tái)(https://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/diffanalysis)進(jìn)行，分析使用的注釋文件在https://phytozome-next.jgi.doe.gov/網(wǎng)站下載。韋恩分析和表達(dá)聚類分析根據(jù)響應(yīng)基因的FPKM值，利用TBtools進(jìn)行分析繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理樣本間的主成分分析(PCA)

為了明確耐寒鮮食玉米閩甜6855在不同耐冷處理時(shí)長后轉(zhuǎn)錄組樣本間的重復(fù)性及整體變化趨勢(shì)，以12個(gè)轉(zhuǎn)錄組樣本所有注釋基因的FPKM值為參數(shù)進(jìn)行樣本間的主成分分析(PCA)，結(jié)果顯示(圖1)，橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)分別可以解釋整體樣本變化的57.5%和28.5%，可解釋總體變異率為86.0%，且樣本重復(fù)間呈現(xiàn)顯著聚集趨勢(shì)，說明樣本間重復(fù)性較好，可以用于后續(xù)差異分析。結(jié)果還顯示，CK(即0 h)時(shí)間點(diǎn)的樣本與24，48，72 h點(diǎn)樣品距離較遠(yuǎn)，而CK之外的樣品間相對(duì)距離較近，表明閩甜6855受冷害脅迫后前期響應(yīng)比較迅速，但隨著耐冷時(shí)間的變化，基因表達(dá)也存在變化，但變化趨勢(shì)逐漸減少。

圖1 低溫處理樣品表達(dá)量的PCA分析Fig.1 PCA analysis of expression levels for samples treated with low temperature

2.2 不同處理樣本間的基因表達(dá)差異分析

為了進(jìn)一步明確閩甜6855受冷害脅迫后在轉(zhuǎn)錄水平上基因表達(dá)量的變化，對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)量進(jìn)行差異分析，結(jié)果顯示(圖2)，整體上閩甜6855在低溫處理前后差異基因?yàn)? 000～7 000個(gè)，而不同時(shí)長低溫處理樣本間差異基因較少，為100～2 000個(gè)，表明低溫是引起基因差異主要因素，且對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)主要在前期。不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)比結(jié)果顯示(圖2)，與處理前CK相比，閩甜6855受冷害處理后24 h點(diǎn)分別有1 952，1 882個(gè)基因上調(diào)和下調(diào)；處理48 h后，上調(diào)和下調(diào)基因增多，分別達(dá)到3 543，3 265個(gè)；而在處理72 h后，上調(diào)基因變少，下調(diào)基因增多，分別為2 178，4 913個(gè)。但從整體上分析，隨著處理時(shí)間變長，整體差異基因呈現(xiàn)增多的趨勢(shì)。此外。處理24，48，72 h后樣品之間相比，差異基因顯著減少。尤其是處理48，72 h，上調(diào)和下調(diào)基因分別僅為10，103個(gè)。結(jié)果表明，閩甜6855的多數(shù)差異基因在冷害處理前期即具有顯著響應(yīng)，處理后期新增響應(yīng)基因數(shù)目顯著減少。而處理48，72 h后，樣品間差異基因幾乎沒有了，表明低溫是造成差異的主要因素，而低溫處理時(shí)長是次要因素，此外閩甜6855對(duì)冷害脅迫的響應(yīng)在48 h內(nèi)基本完成，暗示著快速應(yīng)對(duì)冷害脅迫可能是閩甜6855能夠耐寒的基本特性之一。

圖2 低溫處理后不同時(shí)間點(diǎn)樣品表達(dá)量差異分析Fig.2 Difference analysis of expression in samples at different time points after low temperature treatment

進(jìn)一步分析差異基因在不同處理樣本間的變化，對(duì)不同樣本間的差異基因進(jìn)行韋恩分析，結(jié)果顯示(圖3)，處理24 h的上調(diào)和下調(diào)的基因與處理48，72 h的差異基因相比具有顯著差異，其中24 h樣本中上調(diào)和下調(diào)的1 952，1 882個(gè)差異基因中，分別有1 925，1 851個(gè)為特異表達(dá)，僅在24 h樣品中上調(diào)和下調(diào)表達(dá)，僅有27，31個(gè)基因也在其他時(shí)間點(diǎn)樣本中上調(diào)表達(dá)和下調(diào)表達(dá)；與此不同，48，72 h樣本中，共同上調(diào)和下調(diào)的基因分別為2 827，1 882個(gè)，占各自樣本差異基因總數(shù)的50%以上，甚至90%左右。結(jié)果表明，閩甜6855在受冷害脅迫后不同階段的響應(yīng)基因存在著顯著不同，尤其前期響應(yīng)比較特異，后期響應(yīng)存在一定共性。

圖3 低溫處理后不同時(shí)間點(diǎn)樣品表達(dá)量差異Veen圖Fig.3 Veen plot of differences in expression levels of samples at different time points after low temperature treatment

2.3 參與抗寒脅迫基因KEGG通路分析

為了深入探究閩甜6855中參與抗寒脅迫的調(diào)控通路，對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)響應(yīng)進(jìn)行KEGG通路注釋分析，結(jié)果顯示(圖4)，在冷害處理24，48 h后，絕大多數(shù)的差異基因參與了代謝途徑(Metabolic pathways)和次生代謝產(chǎn)物的合成途徑(Biosynthesis of secondary metabolites)，處理24(48)h分別有483(798)，268(442)個(gè)差異基因參與了2種途徑。但在處理72 h后，參與2種代謝通路的響應(yīng)基因幾乎消失。表明閩甜6855中抗寒需要的一些代謝物主要在72 h之前完成合成，并且不需要持續(xù)合成。植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Plant hormone signal transduction)和MAPK是與抗病蟲及抗逆脅迫緊密相關(guān)的2個(gè)信號(hào)通路，本結(jié)果還顯示，在冷害處理的不同時(shí)間點(diǎn)分別有40，66和67個(gè)差異基因參與了MAPK信號(hào)調(diào)控途徑；分別有55，91，102個(gè)差異基因參與了植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)調(diào)控途徑，差異基因有增多的趨勢(shì)，表明抗寒脅迫過程中這2個(gè)信號(hào)通路積極響應(yīng)。此外，結(jié)果還顯示，在低溫處理后24，48 h，分別有54，74個(gè)基因參與了植物病原菌互作(Plant-pathogen interaction)調(diào)控通路，推測(cè)除MAPK和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控途徑外，在抗病蟲和抗逆境脅迫的通路上也存在著重疊或共有調(diào)控途徑。

A、B、C分別代表低溫處理24，48，72 h的樣品差異基因的KEGG分析；q value即q值，是對(duì)p值的校正。A, B, and C. The KEGG analysis of differential genes in samples treated with low temperature for 24, 48, and 72 h, respectively; q value is the correction of the p value.

2.4 參與抗寒脅迫MAPK信號(hào)通路的變化分析

為了深入了解閩甜6855的耐寒分子機(jī)制 ，對(duì)MAPK信號(hào)通路上的調(diào)控基因進(jìn)行進(jìn)一步分析，結(jié)果顯示(圖5)，受冷害處理后MAPK信號(hào)通路上的大部分基因發(fā)生了顯著的變化。在處理24，48，72 h后，MAPK信號(hào)通路上分別有10，23，44個(gè)基因下調(diào)，分別有30，43，33個(gè)基因上調(diào)。從不同時(shí)間點(diǎn)上分析，冷害處理24，48 h后，在MAPK信號(hào)通路的多數(shù)節(jié)點(diǎn)上均出現(xiàn)了顯著上調(diào)，結(jié)果表明，閩甜6855在受冷害48 h內(nèi)即出現(xiàn)顯著響應(yīng)，隨后開始逐漸降低。此外，從數(shù)量上分析，處理72 h比24 h上調(diào)基因數(shù)目要多，分別為33，30個(gè)，但上調(diào)基因的類型要顯著少于24 h，表明24 h對(duì)冷害的響應(yīng)更為廣泛。試驗(yàn)結(jié)果還顯示，在與冷害直接相關(guān)的途徑上，MKK1、MKK2和MKK4/6家族一些差異基因在受冷害處理后均出現(xiàn)了顯著上調(diào)或下調(diào)，說明這些基因在應(yīng)對(duì)冷害脅迫中均起到了積極的響應(yīng)。

圖5 冷害脅迫后MAPK信號(hào)通路上基因表達(dá)變化Fig.5 Expression variation of MAPK signaling pathway in cold stress treatment

2.5 參與抗寒脅迫植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)通路的變化分析

為了探究植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)通路參與抗寒脅迫的關(guān)鍵基因，對(duì)3個(gè)時(shí)間點(diǎn)該信號(hào)通路上的基因變化趨勢(shì)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示(圖6)，在處理24，48，72 h后，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)通路上分別有20，34，69個(gè)基因下調(diào)，分別有35，57，33個(gè)基因上調(diào)。與MAPK信號(hào)通路變化相比，不同時(shí)間點(diǎn)間的基因表達(dá)變化差異相對(duì)較少，一些關(guān)鍵調(diào)控基因例如ARF、A-ARR、JAZ及PP2C在不同時(shí)間點(diǎn)均有顯著上調(diào)表達(dá)，這類基因主要參與植物細(xì)胞增大、細(xì)胞分化、莖的生長或脅迫響應(yīng)等過程，表明這類基因可能隨著溫度的降低持續(xù)表達(dá)，以維持植物在低溫下的正常生長和發(fā)育。

圖6 冷害脅迫后植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)通路上基因表達(dá)變化Fig.6 Expression variation of plant hormone signal transduction signaling pathway in cold stress treatment

2.6 冷害脅迫對(duì)晝夜節(jié)律信號(hào)通路(Circadian rhythm-plant)基因的影響

為了進(jìn)一步明確冷害脅迫的廣泛影響，對(duì)受脅迫后調(diào)控晝夜節(jié)律信號(hào)通路上的差異基因進(jìn)行分析，結(jié)果顯示(圖7)，該信號(hào)通路上共有37個(gè)基因發(fā)生了顯著變化。從初始表達(dá)總量上分析，3個(gè)家族的4個(gè)差異基因GI(Zm00001d008826和Zm00001d039589)，CRY1(Zm00001d003477)和PRR7(Zm00001d047761)在冷脅迫處理前初始表達(dá)量相對(duì)較高，F(xiàn)PKM值在78.42～243.32，但受脅迫后4個(gè)基因均出現(xiàn)了顯著降低，F(xiàn)PKM值下降到16.83～117.40；與此相反，6個(gè)家族的7個(gè)差異基因PRR5(Zm00001d021291)、CHS(Zm00001d052673)、HY5(Zm00001d015743和Zm00001d039658)、LHY(Zm00001d049543)、PIF3(Zm00001d024783)和TOC1(Zm00001d017241)在冷害處理后前初始表達(dá)量相對(duì)較低，F(xiàn)PKM值在1.69～24.92，受冷害脅迫后基因表達(dá)量顯著上調(diào)，F(xiàn)PKM值最高值均超過了50。結(jié)果暗示著11個(gè)基因在植物受脅迫后調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律信號(hào)通路變化中起主要作用。除此之外，還有9個(gè)基因冷害處理前初始表達(dá)量FPKM值在18.85～33.19，冷害脅迫72 h后出現(xiàn)顯著降低，表達(dá)量FPKM值在1.79～9.05，說明這些基因在調(diào)控晝夜節(jié)律信號(hào)通路變化中也起著重要的作用。

圖7 晝夜節(jié)律信號(hào)通路基因的差異分析Fig.7 Differential analysis of genes in circadian rhythm-plant signaling pathway

3 結(jié)論與討論

3.1 耐冷鮮食玉米閩甜6855的推廣前景

福建省地處東南山區(qū)，可用耕地面積少，機(jī)械化程度低，人工成本高，因此適宜開展一些高附加值的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)。隨著人們對(duì)鮮食玉米需求的逐漸增加，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值越來越高，然而我國鮮食玉米整個(gè)種業(yè)現(xiàn)狀有待進(jìn)一步發(fā)展，主要不足有兩點(diǎn)：良種推廣滯后和配套的產(chǎn)業(yè)化程度不高[14]。目前，顯示玉米產(chǎn)業(yè)主要集中在南方，以春玉米為主。但由于鮮食玉米上市期非常短，容易形成扎堆上市，從而導(dǎo)致貨豐價(jià)廉的現(xiàn)象[15]。春播鮮食玉米面臨一大問題即苗期低溫脅迫，尤其是倒春寒引起的大降溫容易導(dǎo)致鮮食玉米的大面積減產(chǎn)或品質(zhì)下降，因此，農(nóng)民在種植過程中為了避免類似災(zāi)害發(fā)生，多數(shù)農(nóng)民會(huì)選擇在清明天氣維穩(wěn)后開始播種。閩甜6855是福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所培育的甜玉米品種，于2016年5月通過福建省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定(品種審定號(hào)：閩審玉2016003)。在前期福建和廣西等田間試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，閩甜6855播種期可提前至3月中下旬，且苗期如果遭遇一般年份的凍害不會(huì)造成顯著的減產(chǎn)或品質(zhì)下降，呈現(xiàn)較好的抗寒特性。因此，在推廣應(yīng)用的過程中可以適當(dāng)強(qiáng)調(diào)其抗寒特性，推薦提前播種達(dá)到提前收獲提前上市的目的，避開上市高峰期，提高入市價(jià)格。但在推廣的過程中也應(yīng)繼續(xù)關(guān)注其耐冷的生物學(xué)特性，研發(fā)配套的栽培技術(shù)?？傊购贩N閩甜6855的推廣有利于完善鮮食玉米的產(chǎn)業(yè)化結(jié)構(gòu)，提升整個(gè)產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。

3.2 耐寒研究采樣時(shí)期和處理溫度的選擇

本研究采用的主要技術(shù)手段是轉(zhuǎn)錄組分析，而對(duì)于轉(zhuǎn)錄組研究來說，正確處理對(duì)試驗(yàn)至關(guān)重要。發(fā)育時(shí)期、處理溫度、處理時(shí)間等均是本研究中考慮的重點(diǎn)。低溫是影響鮮食玉米的重要?dú)夂驐l件，春玉米苗期又非常容易遭受驟冷降溫的脅迫，從而嚴(yán)重影響發(fā)芽率和后期長勢(shì)，而鮮食玉米與普通玉米相比受影響更大[16]。玉米受冷害脅迫后首先表現(xiàn)在膜上，膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)被破壞后，細(xì)胞質(zhì)膜透性增強(qiáng)，電解質(zhì)外滲，葉片就會(huì)出現(xiàn)萎蔫等不可逆的脅迫癥狀[17]。基于以上研究背景，本試驗(yàn)選擇玉米苗期進(jìn)行后續(xù)研究分析。此外，在選擇溫度和處理時(shí)長上，在前期通過設(shè)置不同溫度的梯度對(duì)閩甜6855及其親本進(jìn)行冷害處理，當(dāng)溫度降低至5 ℃，處理到72 h后，閩甜6855表現(xiàn)出比雙親優(yōu)良的抗寒性，雙親均出現(xiàn)了不同程度的萎蔫，說明冷害處理72 h后，其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞。相比之下，閩甜6855則無顯著影響。因此，本研究的轉(zhuǎn)錄組選擇時(shí)期主要是苗期，溫度設(shè)置為5 ℃，處理最長時(shí)間為72 h，以此來保證獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)能夠真實(shí)反映冷害脅迫后轉(zhuǎn)錄層面的變化趨勢(shì)。

3.3 冷害脅迫與植物-病原互作通路變化

植物抗逆境脅迫是一個(gè)復(fù)雜的過程，其中逆境脅迫又可以分為生物和非生物逆境脅迫。生物逆境脅迫又包含病毒、細(xì)菌和真菌等脅迫，非生物主要包括干旱、鹽、冷、高溫等環(huán)境脅迫。在應(yīng)對(duì)逆境脅迫的過程中MAKP和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)通路起著重要的作用，在本研究中也發(fā)現(xiàn)，冷害脅迫后，這2個(gè)信號(hào)通路均富集了大量差異基因。但在植物-病原互作通路上也富集了相對(duì)較多的差異基因。通過分析參與這3種信號(hào)通路的差異基因發(fā)現(xiàn)，存在著相同的調(diào)控基因。例如，鈣調(diào)蛋白磷酸酶(Caldneurin)是依賴Ca2+/鈣調(diào)素調(diào)節(jié)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，在MAKP和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起關(guān)鍵調(diào)控作用。而在植物-病原互作通路中也存在此類基因的參與，而本研究中的植物-病原互作通路上也發(fā)現(xiàn)了此類結(jié)構(gòu)基因顯著富集。除此之外，類似WRKY、PR1等基因在3種信號(hào)調(diào)控通路中也廣泛存在并顯著富集，暗示著植物在抗生物和非生物脅迫過程中，存在著相似或相通的調(diào)控通路，這對(duì)植物應(yīng)對(duì)外界環(huán)境脅迫具有重要的意義。

3.4 冷害脅迫與植物晝夜節(jié)律變化

玉米是典型的積溫作物，溫度能夠顯著影響玉米的生長發(fā)育進(jìn)程[18]。晝夜節(jié)律是調(diào)節(jié)植物發(fā)育的一個(gè)重要信號(hào)通路，晝夜節(jié)律控制植物多種生命活動(dòng)，如胚軸伸長、葉片發(fā)育及開花期等[19]。植物響應(yīng)低溫途徑的核心是CBF蛋白，CBF蛋白通過轉(zhuǎn)錄激活COR基因，從而促進(jìn)初級(jí)和次級(jí)代謝產(chǎn)物積累，增加與抗凍相關(guān)蛋白的合成來提高植物的低溫耐受力[20]，研究發(fā)現(xiàn)，CBF同時(shí)受低溫誘導(dǎo)和生物鐘控制，它在白天被誘導(dǎo)表達(dá)，夜晚則幾乎沒有表達(dá)，暗示著生物鐘對(duì)植物寒冷脅迫應(yīng)答至關(guān)重要[19，21]。其中一些生物鐘基因也被證實(shí)與CBF存在調(diào)控作用。例如，CCA1/LHY可以直接和CBF啟動(dòng)子結(jié)合，正調(diào)控該基因的表達(dá)[22]，PRR5/7/9是CBF的負(fù)調(diào)控因子[23]，TOC1和EC復(fù)合物同樣通過和啟動(dòng)子結(jié)合來抑制CBF3表達(dá)，這一調(diào)控也影響CBF1和CBF2的表達(dá)[24]。本研究結(jié)果也顯示，晝夜節(jié)律通路上的基因發(fā)生了顯著變化，包括已明確與冷害脅迫相關(guān)的LHY、PRR及TOC等家族的基因，這些結(jié)果暗示著閩甜6855在應(yīng)對(duì)冷害脅迫的過程中可能是通過晝夜節(jié)律通路調(diào)控抗寒信號(hào)CBF蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)一些與抗寒相關(guān)的蛋白合成。而結(jié)果還顯示，在冷害處理24，48 h后，代謝途徑和次生代謝產(chǎn)物的合成途徑富集了大量差異基因，這可能與CBF核心蛋白的調(diào)控相關(guān)，并且這種蛋白合成在非常短的時(shí)間(72 h內(nèi))內(nèi)完成，因此可以快速使其適應(yīng)低溫的環(huán)境。

本研究利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)對(duì)耐寒鮮食玉米品種閩甜6855在受低溫脅迫后轉(zhuǎn)錄水平的變化進(jìn)行分析，結(jié)果表明，閩甜6855受冷害脅迫后前期響應(yīng)比較迅速，基本在48 h內(nèi)即可完成轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。受冷害脅迫后，主要抗性信號(hào)通路植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、MAPK和植物病原互作等通路都會(huì)積極響應(yīng)，此外，晝夜節(jié)律也出現(xiàn)了積極響應(yīng)，表明晝夜節(jié)律對(duì)甜玉米抗寒具有重要作用。