陳維覺 蔣玲玉 鐘永瀧 寧中心 韓 林

(1 廣西桂平市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣西桂平市 537200；廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院2 重癥醫(yī)學(xué)科，3 胸外科，廣西南寧市 530021)

膿毒癥是急危重癥醫(yī)學(xué)的重要疾病，2017年全球約有4.89千萬病例[1]。該病病情進展迅速，病死率甚至超過25%[2-3]。謝劍鋒和邱海波團隊[4]進行了多中心調(diào)查，結(jié)果顯示，我國膿毒癥患者約占ICU收治患者的20%，且90d病死率高達35.5%。膿毒癥主要表現(xiàn)為機體對感染反應(yīng)失調(diào)所致的危及生命的器官功能障礙，盡早明確病原學(xué)后早期進行針對性的抗感染治療是治療膿毒癥的關(guān)鍵[5]，是避免“廣覆蓋、大包圍”的抗感染策略致抗生素多用、濫用的有效措施。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近年來病原菌的高通量測序檢查嶄露頭角，該技術(shù)又稱下一代測序，具有檢測陽性率較高及可同時檢測多種病原菌的優(yōu)點，為指導(dǎo)臨床制定抗感染方案提供重要信息[6]。但目前有關(guān)膿毒癥患者血培養(yǎng)及高通量測序在臨床上應(yīng)用價值的對比研究報告較少，且國內(nèi)鮮見有關(guān)評估高通量測序技術(shù)病原學(xué)檢測效果影響因素的研究報告。因此，本研究分析了高通量測序技術(shù)檢查對膿毒癥患者病原學(xué)檢測的價值，并探索影響膿毒癥患者高通量測序檢查結(jié)果的臨床因素，從而提高高通量測序的臨床診斷效率。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入2018年12月至2019年12月廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院ICU收治的59例膿毒癥患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合膿毒癥的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；(2)年齡≥18歲；(3)患者家屬同意行高通量測序檢查并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：哺乳期患者或者孕婦。其中男性39 例、女性20例，患者年齡18～87(54.73±18.09)歲；原發(fā)感染疾病為肺部感染33例、皮膚軟組織感染9例、腹部或腹腔感染6例、血流感染4例、泌尿系感染3例、顱腦和心臟感染各2例。所有患者家屬對本研究知情同意并簽署知情同意書。本研究所涉及的研究方法均符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)原則，并獲得廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 治療方法 給予所有患者膿毒癥集束化治療，包括液體復(fù)蘇、針對原發(fā)病治療、臟器功能支持、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、營養(yǎng)支持及預(yù)防應(yīng)激性潰瘍等綜合治療，根據(jù)患者循環(huán)功能、氧合指數(shù)情況給予血管活性藥物支持及呼吸機輔助呼吸治療。其中55例患者在入住我科前已行經(jīng)驗性抗感染治療，其余4例患者被確診為膿毒癥后由急診直接入住我科?；颊呷胱∥铱坪?診斷后24 h內(nèi))立即予病原學(xué)檢測，根據(jù)病原學(xué)結(jié)果調(diào)整抗感染治療方案。

1.3 檢測方法及檢測結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn) 在患者被診斷為膿毒癥24 h內(nèi)對其進行血培養(yǎng)，嚴(yán)格按照采血流程及規(guī)范，同時進行2個穿刺點抽取2套血培養(yǎng)標(biāo)本，每套標(biāo)本分別放入需氧和厭氧瓶中，每瓶8～10 mL，即“雙抽四瓶”，標(biāo)本在2 h內(nèi)運輸至微生物實驗室。同時抽取5～10 mL血液樣本放入基因檢測專用的采血管并保存于4 ℃環(huán)境，由專業(yè)人員送至華大基因、廣州賽哲生物有限公司和金匙基因公司進行高通量測序。血培養(yǎng)陽性的定義：培養(yǎng)出病原菌，且排除污染。高通量測序陽性的定義：檢測出多種病原體，只要有1種或以上病原體符合臨床表現(xiàn)，并進行相應(yīng)抗感染治療調(diào)整；高通量測序陰性定義：高通量測序雖檢測出病原體(包括病毒、背景菌等)，但與臨床癥狀不符，未根據(jù)高通量測序結(jié)果進行抗感染方案調(diào)整。由兩位副主任醫(yī)師結(jié)合臨床表現(xiàn)、感染指標(biāo)(包括最高體溫、血常規(guī)、C反應(yīng)蛋白、降鈣素原水平)、檢測結(jié)果共同判斷檢測結(jié)果是否可信，若出現(xiàn)分歧則由第3名副主任醫(yī)師再次審核決定。

1.4 觀察指標(biāo) 觀察指標(biāo)包括患者的一般信息(性別、年齡、最高體溫)、病原體檢測情況，診斷為膿毒癥后24 h內(nèi)的序貫器官衰竭評估(Sequential Organ Failure Assessment,SOFA)評分、急性生理與慢性健康評估(Acute Physiology and Chronic Health Evaluation,APACHE)Ⅱ評分及血常規(guī)、降鈣素原、C反應(yīng)蛋白水平，以及檢測前抗感染治療情況(包括是否接受抗感染治療、抗感染治療的天數(shù))、臟器功能支持情況。其中，臟器功能支持情況包括使用機械通氣、血管活性藥物、連續(xù)性腎臟替代治療(continuous renal replacement therapy，CRRT)的情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗,非正態(tài)分布資料以M(Q)表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率檢驗。采用Logistic回歸模型分析評估高通量測序檢測效果的影響因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 59例膿毒癥患者的病原學(xué)檢測結(jié)果 經(jīng)高通量測序檢測，所有患者的標(biāo)本均檢出病原菌，其中檢出病毒的病例數(shù)最多(40例)，細(xì)菌次之(27例)，真菌病例數(shù)最少(14例)；高通量測序檢出的病原學(xué)種類高達30種，其中細(xì)菌14種、病毒9種、真菌5種、非典型病原體2種(衣原體和恙蟲病東方體)；檢測到的細(xì)菌種類以不動桿菌屬、肺炎克雷伯桿菌及腸球菌、銅綠假單胞菌和腸桿菌為主，真菌則以耶氏肺孢子蟲為主，曲霉、念珠菌次之。見圖1。僅8例患者的血培養(yǎng)檢出病原菌，僅檢測出4種細(xì)菌(分別為銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、大腸桿菌及屎腸球菌)和2種真菌(念珠菌和曲霉)。

圖1 59例膿毒癥患者高通量測序檢測到的各病原菌例數(shù)

2.2 兩種方法檢測結(jié)果的比較 在所有膿毒癥患者中，34例患者血培養(yǎng)或/和高通量測序陽性，25例患者血培養(yǎng)和高通量測序均為陰性。其中血培養(yǎng)和高通量測序同時陽性僅4例。高通量測序檢出陽性率為50.8%(30/59)高于血培養(yǎng)的 13.6%(8/59)(χ2=18.787，P<0.001)。見表1。

表1 59例膿毒癥患者的高通量測序和血培養(yǎng)檢出陽性率的比較[n(%)]

2.3 不同高通量測序結(jié)果的膿毒癥患者的臨床資料比較 與高通量測序陰性的患者相比，高通量測序陽性的患者中女性比例更高，使用血管活性藥物的例數(shù)更少(均P<0.05)。兩者在年齡、APACHEⅡ評分、SOFA評分、最高體溫、白細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞比例、降鈣素原水平、C反應(yīng)蛋白水平、檢測前抗感染治療情況、檢測前抗感染治療的天數(shù)、使用CRRT和機械通氣使用情況的比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 不同高通量測序結(jié)果的膿毒癥患者的臨床資料比較

2.4 膿毒癥患者高通量測序結(jié)果的影響因素 以高通量測序是否陽性為因變量(陰性=0，陽性=1)，以年齡、最高體溫、白細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞比例、C反應(yīng)蛋白、降鈣素原、APACHEⅡ評分、SOFA評分、檢測前接受抗感染治療情況作為自變量(抗感染情況：是=1、否=2，其他變量均為連續(xù)變量)，進行多因素Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，白細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞比例是血高通量測序陽性的影響因素(P<0.05)，其中中性粒細(xì)胞比例升高時血高通量測序陽性的概率增加，而白細(xì)胞計數(shù)的結(jié)果與臨床實際相反，考慮可能存在多重共線性，因此不進一步分析。見表3。

表3 膿毒癥患者高通量測序結(jié)果影響因素的Logistic回歸分析

3 討 論

膿毒癥患者的病情危重且病死率高，抗感染治療是重中之重，而檢測到致病菌以啟動針對性治療是確?？垢腥局委熜Ч闹匾Ｕ?，同時致病菌的類型決定了抗感染治療方案的選擇。本研究中，血高通量測序可檢測到30種病原體，檢出最多的是病毒，其次是細(xì)菌和真菌；此外，還有3例患者檢測出2種非典型病原體。已有較多研究證實高通量測序可檢測到病毒[8-9]。本研究中，有10例患者的病毒基因序列數(shù)大于50條，其中2例患者人皰疹病毒5型基因序列數(shù)分別為3 420條和666條，1例膿毒癥患者僅檢測出人腺病毒基因，其序列數(shù)達1 158條。同時有研究顯示，在93%的社區(qū)獲得性膿毒癥患者中發(fā)現(xiàn)屬于21個科共47種病毒的相關(guān)序列[10]?？梢?，病毒亦是膿毒癥的致病菌之一，但病毒如何影響膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展，有待進一步研究。而在膿毒癥患者中，檢測到的細(xì)菌種類以不動桿菌、肺炎克雷伯桿菌、腸球菌、銅綠假單胞菌等為主，真菌則以耶氏肺孢子蟲為主，念珠菌、曲霉次之。這與Long等[11]在膿毒癥患者中發(fā)現(xiàn)的病原菌種類相似，但主要致病菌有一定差異，可能與納入的膿毒癥患者存在的基礎(chǔ)疾病及不同ICU常見致病菌不同有關(guān)?？傊咄繙y序在檢測病原體種類上明顯優(yōu)于血培養(yǎng)，而且彌補了血培養(yǎng)不能檢出病毒和非典型病原體的局限性。

血培養(yǎng)檢測較容易獲得標(biāo)本以及時送檢，是臨床最常用的檢測方法之一，但是耗時久，臨床檢出陽性率偏低，因此有可能會延誤患者最佳診治時機。本研究59例膿毒癥患者中，血培養(yǎng)陽性率僅為13.6%，而高通量測序陽性率高達50.8%，這與Grumaz等[12]的研究結(jié)果相似。但在Grumaz等[12]的研究中血培養(yǎng)陽性率達30%，略高于本研究，可能是因為在該研究中有60%的血培養(yǎng)陽性菌屬于表皮菌群。高通量測序檢測2～3 d即可得結(jié)果，在本研究中，我們根據(jù)血高通量測序結(jié)果調(diào)整了30例膿毒癥患者的抗感染治療方案，從而提高了早期臨床針對性抗感染治療的比例，使近一半的患者避免長期使用廣譜抗感染治療。我們還發(fā)現(xiàn)，本研究中有25例(42.4%)膿毒癥患者兩種病原學(xué)方法檢測的結(jié)果均為陰性，提示對于部分膿毒癥患者即使同時使用這兩種病原學(xué)方法檢測，也可能無法獲得令人滿意的結(jié)果。因此，臨床醫(yī)師需對具體感染部位進行病原學(xué)檢測以提高陽性檢出率。

高通量測序結(jié)果受到多種因素影響，如樣本采集運輸過程、不同的樣本前期處理等[13]。但由于檢測方法特殊，在對用于高通量測序的樣本進行數(shù)據(jù)分析時，均須對疑似背景菌和可能污染的病原菌基因及序列進行分析，同時，所檢測的病原微生物低于檢測下限時，可能難以檢出待定微生物。為此，本研究對可疑背景微生物亦進行了綜合分析和排除，最終共30例患者的血高通量測序結(jié)果為陽性。有研究顯示，患者的臨床特征可影響培養(yǎng)結(jié)果，例如患者年齡、白細(xì)胞計數(shù)、采血時患者體溫[14]，以及高血壓、抗感染治療情況等[15]。因此，我們根據(jù)臨床經(jīng)驗并結(jié)合相關(guān)研究結(jié)果，對可能影響血高通量測序結(jié)果的患者臨床因素進行了分析。Logistic回歸分析結(jié)果顯示，中性粒細(xì)胞比例是血高通量測序陽性的影響因素(P<0.05)，表明機體對感染反應(yīng)越強，血高通量測序檢測陽性率越高。本研究結(jié)果還提示，SOFA評分和APACHEⅡ評分的高低、抗感染治療情況均對血高通量測序結(jié)果無明顯影響(均P>0.05)；檢測前接受抗感染治療的55例患者中，28例患者血高通量測序檢測陽性，陽性率超過50%，與Blauwkamp等[16]的研究結(jié)果相近。因此，無論疾病狀態(tài)如何，檢測前是否接受過抗感染治療，高通量測序技術(shù)均是臨床檢測膿毒癥病原菌的有效手段。另外，女性患者的血高通量測序陽性率較男性患者更高(P<0.05)，但目前原因不明；血高通量測序陽性患者中使用血管活性藥物的例數(shù)較少(P<0.05)，這間接表明循環(huán)功能穩(wěn)定、組織灌注較好的患者，其機體中的致病菌基因序列更易釋放入血并利于檢出陽性結(jié)果。

總之，相比于傳統(tǒng)血培養(yǎng)，高通量測序是一種新興的診斷工具，有助于早期有效識別膿毒癥患者的致病菌，進而指導(dǎo)臨床制定抗感染方案，其將可能成為對ICU患者實施精準(zhǔn)治療時必不可少的評估工具。當(dāng)患者機體對感染存在一定反應(yīng)、循環(huán)功能穩(wěn)定或組織灌注較好時，更利于檢出陽性結(jié)果，因此建議在條件允許的情況下，盡早對膿毒癥患者進行高通量測序檢查以明確病原學(xué)，當(dāng)循環(huán)功能衰竭嚴(yán)重時再進行檢測其檢測結(jié)果可能會受到一定的影響。但本研究仍存在一定缺陷，如高通量測序分析缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，不能確定檢測的細(xì)菌是否已經(jīng)死亡，檢測特異性較差；測序結(jié)果與疾病之間的關(guān)系需根據(jù)臨床經(jīng)驗進行判斷，存在著人為的不確定性；此外，本研究樣本量較小，有待進一步開展大樣本研究以驗證所得結(jié)論。今后隨著相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定，檢測技術(shù)的進一步發(fā)展，這些不足將會得到改善，高通量測序在重癥感染患者診斷和治療方案的制定中將發(fā)揮更大的作用。