安飛飛，羅秀芹，薛晶晶，陳松筆，蔡 杰

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部木薯種質(zhì)資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571101）

【研究意義】木薯作為世界上近十億人的口糧，其塊根富含淀粉但缺乏類胡蘿卜素、蛋白質(zhì)和微量元素鐵、鋅等，因此選育營(yíng)養(yǎng)加強(qiáng)型木薯品種是育種家追求的重要目標(biāo)之一。木薯塊根薯肉顏色在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中形成了不同顏色，包括白色、橙黃色、黃色、粉紅色等[1]，但我國(guó)缺乏粉紅心木薯資源，大多為白心木薯資源，黃心木薯資源比例不高。目前白心木薯和黃心木薯薯肉代謝物組成及其含量仍不清楚，因此開展兩種顏色木薯薯肉中代謝物質(zhì)的研究對(duì)木薯薯肉營(yíng)養(yǎng)成分的遺傳改良具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】由于木薯在世界糧食安全中的重要作用，對(duì)人體有益的代謝物質(zhì)被鑒定，同時(shí)具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的生物強(qiáng)化品種也得到開發(fā)[2]。黃心木薯塊根含有類胡蘿卜素，而白心木薯塊根類胡蘿卜素含量極低[3]。黃心木薯經(jīng)不同方式的蒸煮，總類胡蘿卜素含量范圍在2.64～14.15 μg/g，其中β-胡蘿卜素占總類胡蘿卜素的75%左右[4]。自然界中存在塊根維生素B1 和類胡蘿卜素含量的變異品種[3,5]，研究[6-7]顯示增加維生素原A 含量可提高木薯塊根中的胡蘿卜素含量。Sánchez 等[8]對(duì)高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的3 000 多份木薯樣品進(jìn)行分析，挖掘高β-胡蘿卜素的木薯資源。中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所[9]于2005 年選育出塊根薯肉富含β-胡蘿卜素的蛋黃木薯，同時(shí)構(gòu)建蛋黃木薯自然雜交群體用于關(guān)聯(lián)分析，挖掘與類胡蘿卜素代謝的關(guān)鍵基因[10]。代謝組學(xué)研究生物體由于基因修飾或外界環(huán)境改變引起的代謝物變化，是目前組學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[11]。靶向代謝組學(xué)和非靶向代謝組學(xué)手段已被廣泛應(yīng)用于不同作物及不同器官的代謝物分析[12-13]。木薯中已建立了初級(jí)和次級(jí)代謝物的篩選方法，并用于農(nóng)藝性狀相關(guān)生物標(biāo)記代謝物的鑒定[4]。采用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)在木薯葉片中鑒定到184 種代謝物[14]，同時(shí)分析不同品種木薯葉片差異代謝產(chǎn)物和代謝通路[15]，靶向代謝組學(xué)方法也應(yīng)用于研究木薯塊根采后生理變質(zhì)（PPD）過程中類胡蘿卜素、類黃酮、花青素和酚類物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化[16-17]。研究[18]發(fā)現(xiàn)，木薯各器官中代謝成分存在顯著差異，其中根營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最豐富?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】盡管學(xué)者們開展了黃心木薯的雜交利用和遺傳改良，同時(shí)利用代謝組學(xué)分析木薯組織的代謝物及PPD 過程中代謝物的變化，但有關(guān)白心木薯與黃心木薯薯肉代謝物比較分析卻鮮有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為明確兩者薯肉中代謝物差異及相關(guān)基因表達(dá)情況，本研究擬選用父母本相同、遺傳背景一致，但薯肉顏色差異明顯的白心糖木薯2-17 與黃心糖木薯2-27 為試驗(yàn)材料，采用LC-MS 技術(shù)，結(jié)合qRT-PCR，分析兩者薯肉代謝物差異，為木薯薯肉代謝物鑒定及品質(zhì)遺傳改良提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所選用的材料為白色薯肉木薯2-17和黃色薯肉木薯2-27，兩者均來自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所國(guó)家木薯種質(zhì)資源圃的糖木薯雜交F1代群體，其中2-17為對(duì)照。試驗(yàn)材料于2019 年3 月種植，2020 年1 月收獲，收獲后立即取塊根薯肉頭、中、尾3 個(gè)部分，切碎混勻后置于液氮速凍，后保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 UPLC測(cè)定薯肉β-胡蘿卜素含量

將保存好的塊根薯肉置于液氮研磨成粉末，后稱取0.5 g 薯肉粉末，加入5.0 mLV（三氯乙烷）∶V（無水乙醇）＝1∶1，50 ℃水浴60 min。取上清液3 mL，加入0.6 mL 20%的氫氧化鉀-甲醇，50 ℃水浴60 min，取0.2 mL 上層液復(fù)溶過濾后備用。色譜柱Agilent HC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：異丙醇。洗脫程序：0～10 min，100%A，10～15 min，20%A，15～30 min，100%A，流速：1 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：450 nm。

1.3 GC-MS測(cè)定薯肉糖含量

稱取0.2 g 薯肉，加2.0 mL 80%乙醇提取，離心后取上清，量取0.5 mL 上清液氮吹干。后加入30 μL 20 mg/mL 甲氧基胺基鹽酸鹽吡啶溶液，37 ℃，650 r/min，搖晃1.0 h。隨后加入70 μL N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺，70 ℃，650 r/min 振蕩1 h，室溫放置30 min，離心取上清液備用。安捷倫毛細(xì)管柱為HP-5，30 m×0.25 mm，0.25 μm；質(zhì)譜為5975C四級(jí)桿質(zhì)譜儀；氣化室溫度：280 ℃；升溫程序：80 ℃，1 min；6 ℃/min升溫至240 ℃，保持15 min；載氣：氦氣，載氣流量：1 mL/min；分流比為20∶1；進(jìn)樣量1 μL。

1.4 氯化鈣-旋光法分析薯肉淀粉含量

將收獲后的新鮮木薯塊根薯肉置于55 ℃烘箱中烘至恒重，后用小型粉碎機(jī)將其粉碎，粉體過325目篩子得到木薯干粉。稱取0.1 g木薯干粉，參照氯化鈣-旋光法（GB/T 5514—2008）測(cè)定各樣品的旋光度，按公式計(jì)算樣品的淀粉含量。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)

利用Primer 5.0設(shè)計(jì)合成淀粉及β-胡蘿卜素代謝途徑中的關(guān)鍵基因的qRT-PCR引物（表1），包括蔗糖磷酸合酶（SPS）、ADP葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）、可溶性淀粉合成酶（SSS）、β-淀粉酶（β-amylase）、八氫番茄紅素合成酶（PSY）、八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）、六氫番茄紅素脫氫酶（ZDS）和番茄紅素β-環(huán)化酶（LCYB）。參照植物總RNA 提取試劑盒提取薯肉總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈。將合成的cDNA 稀釋5倍作為模板，采用qRT-PCR 檢測(cè)各基因的表達(dá)情況，以actin基因?yàn)閮?nèi)參。反應(yīng)體系為10.0 μL，以2-17為對(duì)照，采用2-ΔΔCt計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 木薯淀粉代謝相關(guān)基因的qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR primers sequence for starch and β-carotene metabolism related genes

1.6 LC-MS分析薯肉代謝物

樣品送至上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行代謝組學(xué)分析，每個(gè)樣本設(shè)6個(gè)重復(fù)。稱取80 mg薯肉，加入內(nèi)標(biāo)（0.3 mg/mL的L-2-氯苯丙氨酸，0.01 mg/mL的Lyso PC 17:0）各20 μL和1 mL的70%甲醇，-20 ℃放置2 min，60 Hz，研磨2 min后超聲提取30 min，-20 ℃靜置20 min，4 ℃，離心半徑4 cm，13 000 r/min，離心10 min。取300 μL上清液揮干，后用400 μL 20%甲醇復(fù)溶，渦旋30 s，超聲2 min。4 ℃，離心半徑4 cm，13 000 r/min，離心10 min，吸取150 μL的上清液過濾后備用。質(zhì)控樣本（QC）由所有樣本的提取液等體積混合制備而成，每個(gè)QC體積與樣本相同。試驗(yàn)分析儀器為ACQUITY UPLC 超高效液相串聯(lián)AB Triple TOF 5600高分辨質(zhì)譜儀組成的液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)。色譜條件：色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：45 ℃；流動(dòng)相：A，水（含0.1%甲酸），B，V（乙腈）∶V（甲醇）＝2∶3（含0.1%甲酸）；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL。質(zhì)譜條件：離子源：ESI，正負(fù)離子電離模式。

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用UNIFI 1.8.1 軟件采集原始數(shù)據(jù)，原始數(shù)據(jù)經(jīng)Progenesis QI v2.3 軟件進(jìn)行基線過濾、峰識(shí)別、積分、保留時(shí)間校正、峰對(duì)齊和歸一化。化合物的鑒定基于精確質(zhì)量數(shù)、二級(jí)碎片以及同位素分布，使用The Human Metabolome Database（HMDB）和Lipidmaps（v2.3）以及METLIN 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行定性。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行無監(jiān)督的主成分分析（PCA），偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）以及正交偏最小二乘法判別分析（OPLSDA）。變量權(quán)重值（VIP）大于1 的變量被認(rèn)為是差異代謝物，OPLS-DA 和t-檢驗(yàn)相結(jié)合，篩選兩組試驗(yàn)材料中的差異代謝物（VIP＞1，P＜0.05），根據(jù)Log2 FC 值篩選TOP20 差異代謝物。利用差異代謝物的KEGG ID 進(jìn)行通路富集分析，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)背景相比，在顯著性差異表達(dá)代謝物中顯著富集的pathway條目。

用Excel 2013和DPS v7.05統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)生理數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)采用新復(fù)極差法（Duncan）。

2 結(jié)果與分析

2.1 白心與黃心糖木薯薯肉β-胡蘿卜素含量分析

糖木薯雜交F1代株系2-17和2-27薯肉顏色存在顯著差異（圖1A，圖1B），2-17 塊根薯肉為白色，2-27 塊根薯肉呈黃色。進(jìn)一步分析其薯肉中β-胡蘿卜素含量發(fā)現(xiàn)兩者存在極顯著差異（圖1C），2-27 塊根薯肉中β-胡蘿卜素含量為9.60 μg/mL，而2-17 塊根薯肉中β-胡蘿卜素含量?jī)H0.83 μg/mL。

圖1 2-17和2-27薯肉顏色及β-胡蘿卜素含量比較Fig.1 Comparison of flesh color and β-carotene content between 2-17 and 2-27

2.2 白心與黃心糖木薯薯肉糖及淀粉含量分析

經(jīng)測(cè)定2-17 和2-27 塊根薯肉中蔗糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、海藻糖及淀粉含量，得到表2 所示的結(jié)果。黃心木薯2-27 薯肉中淀粉、半乳糖、果糖含量較白心木薯2-17 顯著升高，其中半乳糖含量升高最顯著，達(dá)到3.21 g/kg。2-27 薯肉蔗糖含量和海藻糖含量顯著下降，海藻糖含量下降極顯著，僅為2.29 g/kg，然而兩者薯肉葡萄糖含量無顯著差異。

表2 2-17和2-27塊根薯肉淀粉及糖含量Tab.2 Starch content and sugar content in cassava flesh of 2-17 and 2-27

2.3 白心與黃心糖木薯薯肉代謝組學(xué)的主成分分析

為鑒定兩組樣品間的差異，首先采用無監(jiān)督的PCA方法觀察樣品間的總體分別趨勢(shì)，共得到2 個(gè)主成分，兩組木薯薯肉樣品均處于置信區(qū)間內(nèi)。兩組點(diǎn)分別單獨(dú)在第2象限（t[1]＜0，t[2]＞0）、第3象限（t[1]＜0，t[2]＜0）以及第1象限（t[1]＞0，t[2]＞0）、第4象限（t[1]＞0，t[2]＜0），表明兩種顏色木薯薯肉中代謝物間有顯著差異。OPLS-DA 可最大化地凸顯組別間的差異，如圖2-B 所示，該結(jié)果與PCA 結(jié)果大體一致，兩組6 個(gè)生物學(xué)重復(fù)數(shù)據(jù)點(diǎn)能很好地集中在一起并分成兩組，說明兩組樣品的代謝物在種類、含量等方面存在差異。

圖2 2-17和2-27薯肉代謝物PCA散點(diǎn)圖（A）與OPLS-DA散點(diǎn)圖（B）Fig.2 PCA（A）and OPLS-DA（B）scatter plots of 2-17 and 2-27

2.4 白心與黃心糖木薯薯肉中差異代謝物分析

在2-17和2-27木薯薯肉中共檢測(cè)到2 719種代謝物。結(jié)合VIP大于1及T檢驗(yàn)，共篩選到存在顯著差異的代謝物267個(gè)，其中上調(diào)代謝物163個(gè)，下調(diào)代謝物104個(gè)。將TOP20的差異代謝物進(jìn)行分析（圖3），可更直觀地看出它們?cè)趦山M間的表達(dá)差異。其中3-O-阿魏基奎寧酸上調(diào)倍數(shù)最大，為26.40 倍。差異代謝物主要涉及能量代謝（蘋果酸、琥鉑酸、異檸檬酸）、脂肪酸代謝（亞麻酸、亞油酸、膽固醇）、氨基酸代謝（亮氨酸、異亮氨酸、L-谷氨酸、色氨酸）、苯丙烷生物合成（東莨菪素）、淀粉和糖代謝（蔗糖、果聚糖、半乳糖、6-磷酸葡萄糖）以及類黃酮代謝（咖啡?？鼘幩幔?。

圖3 2-27薯肉代謝物中上調(diào)和下調(diào)差異倍數(shù)分別排在前10位的代謝物Fig.3 Top ten differential metabolites（up or down regulated）between 2-17 and 2-27

應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出在顯著性差異表達(dá)代謝物中顯著富集的pathway條目（圖4）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)267種差異代謝物被注釋到74個(gè)代謝通路中，其中18個(gè)代謝通路發(fā)生顯著或極顯著變化。前10位發(fā)生極顯著改變的代謝通路分別是亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、丙酮酸代謝、氨酰tRNA生物合成、氧化磷酸化、碳代謝、乙醛酸和二羧酸代謝和TCA循環(huán)。

圖4 2-27組/2-17組前20位代謝通路氣泡圖Fig.4 The bubble charts of top 20 metabolic pathways in 2-27 and 2-17

2.5 白心與黃心糖木薯與淀粉及胡蘿卜素代謝相關(guān)基因表達(dá)分析

淀粉代謝相關(guān)基因表達(dá)見圖5A，與2-17 相比，MeSPS2和Meβ-amylase基因的表達(dá)量均顯著下調(diào)，SPS 和β-amylase 參與淀粉的分解代謝，這表明2-27 塊根中淀粉的分解能力較2-17 弱。而MeAGPase和MeSSS1的相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)，由于AGPase 和SSS 參與淀粉的合成代謝，表明2-27 塊根中淀粉的合成能力較2-17 強(qiáng)。β-胡蘿卜素代謝相關(guān)基因表達(dá)見圖5B，與2-17 相比，MePSY2、MePSY2、MeZDS和MeLCYB基因的表達(dá)量均顯著上升，由于這些基因均是β-胡蘿卜素合成的關(guān)鍵基因，因此可以看出2-27塊根中β-胡蘿卜素代謝較強(qiáng)。

圖5 2-17和2-27薯肉中淀粉及胡蘿卜素代謝相關(guān)基因表達(dá)Fig.5 The expression profile of starch and carotene metabolism related genes in fleshes of 2-17 and 2-27

3 討論與結(jié)論

代謝組學(xué)是測(cè)定植物代謝物組分的一種有效手段，在木薯葉片、塊根等不同組織代謝物分析中有廣泛應(yīng)用[14,19]。木薯塊根薯肉中代謝物含量及其變化可直接影響木薯塊根營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，為進(jìn)一步挖掘木薯薯肉中的代謝組分，本研究采用非靶向代謝組手段測(cè)定木薯薯肉中的代謝物，在黃心糖木薯與白心糖木薯薯肉共鑒定出267 種差異代謝物，研究所得差異代謝物數(shù)量明顯高于前人關(guān)于塊根中代謝物數(shù)量的報(bào)道[20]，這可能由木薯品種差異造成。木薯塊根富含淀粉，但蛋白質(zhì)、微量元素和氨基酸含量較少。本研究結(jié)果表明白心糖木薯塊根中亮氨酸、異亮氨酸、L-谷氨酸、色氨酸含量高于黃心糖木薯。有報(bào)道稱氨基酸的組成和含量會(huì)影響果實(shí)品質(zhì)[18]，其中亮氨酸、異亮氨酸對(duì)葡萄的苦味有貢獻(xiàn)[21]，本試驗(yàn)材料中白心糖木薯2-17 比黃心糖木薯2-27 苦，可能是由于白心糖木薯薯肉中亮氨酸及異亮氨酸含量較高導(dǎo)致，這些氨基酸后續(xù)可作為木薯塊根品質(zhì)篩選的代謝標(biāo)記物。代謝組數(shù)據(jù)顯示黃心糖木薯薯肉中淀粉和蔗糖、果聚糖、半乳糖、6-磷酸葡萄糖較白心木薯高，這與試驗(yàn)結(jié)果中氯化鈣-旋光法測(cè)定的淀粉含量及GC-MS 分析得到的糖含量結(jié)果一致，同樣基因表達(dá)分析結(jié)果也顯示2-27 淀粉合成能力較高，淀粉降解能力較弱。也再次證實(shí)了代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的可靠性。

東莨菪素和β-胡蘿卜素在木薯塊根應(yīng)對(duì)采后生理變質(zhì)過程中起重要作用，可作為一種潛在的耐采后生理腐爛（postharvest physiological deterioration，PPD）生物標(biāo)志物[20,22]。本研究中黃心糖木薯薯肉中東莨菪素含量顯著高于白心木薯，推測(cè)黃心糖木薯比白心糖木薯更耐PPD，這與Morante 等[23]、Sánchez 等[24]的研究結(jié)果一致。相關(guān)研究[24]表明β-胡蘿卜素是一種優(yōu)良抗氧化劑，其含量與木薯塊根的耐貯性呈顯著正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)黃心糖木薯中β-胡蘿卜素含量顯著高于白心糖木薯，且與β-胡蘿卜素合成相關(guān)的基因表達(dá)均上調(diào)，這也可能是黃心糖木薯更耐PPD 的原因。但在本研究的差異代謝物中未找到類胡蘿卜素代謝途徑中的相關(guān)代謝物，推測(cè)前期樣本處理時(shí)并未針對(duì)類胡蘿卜素類物質(zhì)提取，且代謝組為非靶向代謝手段，在進(jìn)行數(shù)據(jù)庫匹配時(shí)，無類胡蘿卜素相關(guān)數(shù)據(jù)庫，因此質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)未檢測(cè)到。本文也針對(duì)類胡蘿卜素中的β-胡蘿卜素含量進(jìn)行定量分析，后期將針對(duì)其它類胡蘿卜素種類和含量進(jìn)行靶向分析。

脂肪酸在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中起基礎(chǔ)作用，為植物的生長(zhǎng)過程提供能量[25]。研究[26]結(jié)果表明黃心糖木薯中脂肪酸主要包括亞麻酸、亞油酸、膽固醇等，且其含量高于白心糖木薯。脂肪酸可以轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，而乙酰輔酶A在碳水化合物代謝和氨基酸代謝過程中起著至關(guān)重要的作用[27-28]，因此在黃心糖木薯中脂肪酸代謝的增強(qiáng)促進(jìn)了淀粉及半乳糖代謝。乙酰輔酶A也可參與類固醇的生物合成[29]，本研究中也發(fā)現(xiàn)甾體和油菜素甾體生物合成在黃心糖木薯中較為活躍。

木薯基因組高度雜合，且塊根中的營(yíng)養(yǎng)成分受基因和環(huán)境的綜合影響[30-31]，塊根營(yíng)養(yǎng)是由多基因位點(diǎn)控制的復(fù)雜性狀[32-33]，而代謝組學(xué)用于發(fā)掘木薯營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的研究較少，且相關(guān)數(shù)據(jù)庫也有待完善。目前，木薯中僅闡明了部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如淀粉、類胡蘿卜素積累的生物合成途徑，但其內(nèi)在的遺傳規(guī)律及其調(diào)控機(jī)制尚未清晰。因此有必要結(jié)合其他組學(xué)數(shù)據(jù)，以快速、準(zhǔn)確地了解木薯中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的表達(dá)信息，并把這些數(shù)據(jù)作為準(zhǔn)確的分子性狀衡量指標(biāo)，結(jié)合分子生物學(xué)手段，應(yīng)用于關(guān)鍵基因挖掘、功能解析乃至木薯新品種培育過程中。

本研究表明，黃心糖木薯與白心糖木薯薯肉共鑒定出267種差異代謝物（其中上調(diào)163個(gè)，下調(diào)104個(gè)），其中59種差異代謝物顯著或極顯著影響了18個(gè)代謝通路，主要涉及脂肪代謝、糖代謝、氨基酸代謝和能量代謝等。黃心糖木薯薯肉β-胡蘿卜素、淀粉、半乳糖和果糖含量高，而白心糖木薯薯肉中蔗糖和海藻糖含量高。黃心糖木薯脂肪酸代謝、淀粉及半乳糖代謝、苯丙烷生物合成及類黃酮代謝更活躍，而白心糖木薯氨基酸代謝和能量代謝更活躍。黃心糖木薯中淀粉合成相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，淀粉降解相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，β-胡蘿卜素合成相關(guān)基因上調(diào)。