蒲 祥，張喻涵，蘭羽秋，楊勝男，胡海鵬，王廣途，王晗光，黃乾明

(四川農業(yè)大學 理學院，四川 雅安 625014)

目前，我國農業(yè)高校開設的有機化學實驗多注重于讓學生掌握基礎實驗原理與基本操作技能，有機物制備實驗內容涉及1-溴丁烷、乙酸乙酯、乙酰苯胺、1-苯乙醇等類別物質的制備[1-3]。而關于有機物制備的綜合性實驗項目較少，實驗內容設計與農業(yè)、食品、醫(yī)藥等行業(yè)的科研或生產實際結合不夠緊密，不利于農、林、動、醫(yī)等專業(yè)學生在基礎實驗課程學習期間培養(yǎng)從事行業(yè)有機化學研究的興趣[4]。因此，有必要有計劃地將有機化學實驗內容進行更新。近年來，現(xiàn)代化測試儀器和新的合成方法不斷引入基礎有機化學實驗教學，實驗類型逐步向綜合訓練型和科學研究型發(fā)展[5]。部分師范類和化工類院校相繼開發(fā)了一些綜合性有機化學實驗。例如，孫雨辰等[6]在經典重氮偶合實驗基礎上新增了硝基還原步驟，制備偶氮類化合物；蔣達洪等[7]在經典Robinson增環(huán)反應實驗基礎上增加了水相綠色氧化步驟以制備聯(lián)苯類化合物。現(xiàn)有有機化學實驗教材中未見“一鍋法”合成天然成分黃酮醇的實驗[1-3]。本實驗將羥醛縮合反應與Algar-Flynn-Oyamada(AFO)反應結合，通過實驗，既可鍛煉學生綜合實驗操作技能，讓學生熟悉AFO反應，并鞏固對羥醛縮合反應的理解，又能使學生熟悉該法在黃酮醇類天然成分合成中的應用，有效激發(fā)農林院校學生對有機化學實驗的學習興趣。

1 實驗背景

黃酮醇是一種天然活性成分，有防治心血管疾病[8]、抗氧化[9]、抗炎[10]等作用。黃酮醇的制備方法現(xiàn)有4種，即苯并呋喃酮重排法(Auwers法)[11]、Baker-Venkataraman重排環(huán)合法[12-13]、黃酮DMDO氧化法[14]和查爾酮氧化環(huán)化(AFO)法[15]。其中，AFO法操作簡便，應用更為廣泛。傳統(tǒng)的AFO法制備黃酮醇分兩步，在堿性溶液中，以苯乙酮和苯甲醛的衍生物為底物，經羥醛縮合制得羥基查爾酮，再將羥基查爾酮氧化環(huán)合生成黃酮醇。該兩步合成方法產生大量橙酮副產物，黃酮醇產率較低，僅有10%～20%。2012年，Gunduz等[16]對經典的AFO反應作了進一步改進，發(fā)展了“一鍋法” AFO環(huán)合法：在氫氧化鈉的甲醇溶液中回流反應3 h，冷卻至室溫后，再直接加入氫氧化鈉溶液、過氧化氫溶液攪拌2～3 h?！耙诲仭眱冗B續(xù)操作合成了黃酮醇及其類似物，產率可達70%以上。2020年，Xiong等[17]對“一鍋法”AFO環(huán)合法進行再次改進，在四氫吡咯催化下回流攪拌24 h合成黃酮醇，產率可達80%以上，但該方法耗時長，且四氫吡咯具有腐蝕性，在操作過程中存在一定危險性，不利于本科生進行實驗操作。因此，筆者最終選擇對Gunduz等[16]合成黃酮醇的方法進行改進優(yōu)化，將其轉化為一個綜合創(chuàng)新型實驗。改進后操作簡單安全、反應現(xiàn)象明顯、產率高，適合運用于本科實驗教學。

2 實驗目的

通過黃酮醇的“一鍋法”合成，掌握羥醛縮合、氧化成環(huán)等反應的實驗操作，鞏固羥醛縮合機理，熟悉AFO人名反應涉及的環(huán)氧化-氧化機理及提高黃酮醇產率的方法；鞏固重結晶的純化原理和實驗操作；熟悉黃酮醇的制備，啟發(fā)學生探究不同黃酮醇衍生物的合成；熟悉反應進程監(jiān)測、黃酮醇定性鑒別、產品純度判斷，以及運用熔點儀、IR和NMR等對黃酮醇進行結構表征。

3 實驗原理

該反應是在堿性條件下，苯甲醛、鄰羥基苯乙酮、過氧化氫之間發(fā)生的連續(xù)羥醛縮合與氧化成環(huán)反應。反應過程為苯甲醛與鄰羥基苯乙酮先在堿性條件下，先經羥醛縮合反應形成查爾酮中間體。查爾酮中間體不經分離，直接加入過氧化氫及氫氧化鈉溶液進行氧化成環(huán)反應，終反應液調節(jié)pH至6～7。再加入冰水使黃酮醇充分析出，減壓抽濾、蒸餾水洗滌4～5次，所得固體充分干燥后用乙醇重結晶即得黃酮醇。合成路線如圖1所示。

4 試劑與儀器

苯甲醛(AR)、鄰羥基苯乙酮(99%)、黃酮醇(>98%)標品，購于上海阿拉丁股份有限公司。石油醚(AR)、甲醇(AR)、乙醇(AR)、30%過氧化氫(AR)、乙酸乙酯(AR)、氫氧化鈉(片狀，AR)，購于成都科隆化學品有限公司。薄層色譜硅膠板GF254，購于青島海洋化工。

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器)、FA2004C電子天平(上海佑科儀器儀表)、SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水真空泵(鞏義市予華儀器)、ZF-1型三用紫外分析儀(江蘇海門市其林貝爾儀器制造)、F80A斯科茨曼制冰機(斯科茨曼制冰系統(tǒng)(上海)有限公司)、DHG-9101電熱恒溫鼓風干燥箱(上海三發(fā)科學儀器)、SGWR X-4B 顯微熔點儀(上海儀電物理光學儀器)、8400S傅里葉變換紅外光譜儀(日本島津)、AscendTM 600 MHz核磁共振儀(德國Bruker)、Agilent Infinity Lab液質聯(lián)用儀(美國安捷倫)。

5 實驗操作步驟

5.1 羥醛縮合制備查爾酮

將 0.8 g 氫氧化鈉固體、60 mL 甲醇、1.2 mL 鄰羥基苯乙酮、1.5 mL 苯甲醛，依次加入 250 mL 圓底燒瓶，混合均勻得淡黃色液體。放入磁力攪拌子，將圓底燒瓶置于磁力攪拌器中，75 ℃ 攪拌回流至溶液顏色變?yōu)轷r紅色，可用薄層色譜法(TLC)監(jiān)測反應進程(約 3.5 h)。

5.2 AFO反應合成黃酮醇

將5.1得到的反應液冷卻至室溫后加入 1 mol/L 氫氧化鈉溶液 60 mL，再加入30%過氧化氫 4.8 mL，10 ℃ 下攪拌反應約 2.5 h。用TLC法監(jiān)測反應進程，反應完成即得鮮黃色反應液，隨后向瓶內滴加鹽酸溶液(1.2 mol/L)調節(jié)終反應液的pH至6～7。向調好pH的反應液中倒入 30 mL 冰水，攪拌均勻，使黃酮醇充分析出；減壓抽濾，并用蒸餾水洗滌4～5次，充分除鹽，得黃色固體，并置于烘箱中 40 ℃ 干燥，得黃酮醇粗品 1.7674 g，產率為74%。

5.3 黃酮醇的精制

將黃酮醇粗品轉移至潔凈的 250 mL 錐形瓶中，逐次向瓶中加入 10 mL 無水乙醇， 80 ℃ 水浴加熱，并充分振搖。若乙醇加熱至沸騰仍有未溶物時，繼續(xù)加入 10 mL 無水乙醇并加熱充分振搖溶解。如此重復上述操作，待圓底燒瓶中黃酮醇完全溶解后，補加約 15 mL 無水乙醇(無水乙醇總用量約 75 mL)。趁熱過濾除去不溶雜質，將濾液趁熱轉移至潔凈的 250 mL 錐形瓶中，冰浴冷卻，待晶體析出完全后減壓抽濾；用少量冷乙醇洗滌，所得黃酮醇置 40 ℃ 恒溫烘箱中干燥至恒重，即得精制黃酮醇 1.2018 g，收率為68%。實驗流程與典型實驗現(xiàn)象如圖2所示。

6 結果與討論

6.1 黃酮醇合成過程分析

6.1.1 羥醛縮合反應試劑用量的確定

第一步反應中，原料苯甲醛沒有α-H，在濃堿條件下，易發(fā)生Cannizzaro副反應(如圖3)。因此為提高查爾酮的產率，在第一步的反應試劑用量上應考慮兩方面：一是苯甲醛的用量，二是氫氧化鈉的用量。由于苯甲醛會發(fā)生Cannizzaro副反應導致原料損失。為盡量減少鄰羥基苯乙酮的自身縮合，使鄰羥基苯乙酮與苯甲醛充分反應，應適當增加苯甲醛的用量；同時為盡量減少Cannizzaro副反應的發(fā)生，還應控制氫氧化鈉的用量，避免反應體系pH過高，產生大量苯甲酸鈉、苯甲醇等副產物。針對氫氧化鈉固體的用量，設計了第一步羥醛縮合反應的底物與堿的三組用量比，分別為：n(苯甲醛)∶n(鄰羥基苯乙酮)∶n(氫氧化鈉)=1.5∶1∶3、1.5∶1∶2、1.5∶1∶1(對應的初始pH分別為 13～14、12～13、11～12)，隨后進行條件實驗。通過TLC法比較所得查爾酮的產量與純度。最終確定苯甲醛、鄰羥基苯乙酮和氫氧化鈉最佳物質的量比為1.5∶1∶2(pH為12～13)。

6.1.2 AFO反應溫度的確定

根據AFO反應的環(huán)氧化-氧化機理(如圖4)，反應溫度過高可能會導致橙酮等副產物的生成[18]，應將AFO反應的溫度控制在室溫(25 ℃)以下。綜合考慮實驗成本及可操作性，選擇了0、10、15、20、25 ℃ 5個溫度進行第二步AFO反應的溫度條件實驗。比較所得黃酮醇的產量、利用TLC法比較黃酮醇的純度，探究AFO反應的最佳反應溫度。最終確定第二步AFO反應的最佳反應溫度為 10 ℃。

6.1.3 AFO反應過氧化氫用量的確定

第二步AFO反應中過氧化氫的用量十分關鍵，若過氧化氫用量過少，則導致氧化不充分，出現(xiàn)二氫黃酮醇等副產物；用量過多則導致氧化過度，也會增加副產物，影響最終所得黃酮醇的產率和純度。在AFO反應 10 ℃ 的最佳反應溫度下，設計了30%過氧化氫的3組用量，分別為 4.8 mL(0.047 mol)、5.4 mL(0.053 mol)、6.0 mL(0.059 mol)，隨后進行條件實驗。比較所得黃酮醇的產量、利用TLC法比較產品的純度，探究第二步反應過氧化氫的最佳用量。最終確定第二步AFO反應過氧化氫(30%過氧化氫)的最佳用量為 4.8 mL。

6.1.4 黃酮醇的重結晶

終反應液經pH調節(jié)、產物析出、減壓抽濾、蒸餾水洗滌后所得的黃酮醇粗品中可能存在的雜質有副產物2’-羥基查爾酮、二氫黃酮醇、橙酮等。根據極性由大到小的順序選擇了6種常見溶劑(見表1)。分別將上述6種溶劑作為 0.1 g 粗產品(均來自于同一次制備的黃酮醇粗產品)的重結晶溶劑。觀察粗產品在6種溶劑中的溶解情況、冷卻后的析晶情況，并利用TLC法進行黃酮醇重結晶產品及其純度的鑒定，最后計算黃酮醇收率。實驗表明，乙醇是黃酮醇的最佳重結晶試劑，見表1。重結晶溶劑的用量也對產品的收率和純度起著重要作用。經反復實驗，確定在粗產品與乙醇的質量體積比為1 g∶45 mL，且同時進行 80 ℃ 水浴加熱和攪拌操作時，粗產品能較好地溶解，冷卻后析出的晶體最多，純度較高。

6.2 黃酮醇結構分析和表征

6.2.1 熔點、TLC及LC-MS

本實驗制備黃酮醇樣品的熔點為169～170 ℃(文獻值：170～171 ℃)。當使用石油醚-乙酸乙酯(體積比6∶1)進行TLC時，其與黃酮醇標準品的TLC對比結果如圖5。黃酮醇樣品與標準品Rf值相同，且無雜質點。LC-MS分析結果顯示，樣品質荷比為[M+H]+m/z=239.1、[M+Na]+m/z=261.1(如圖5b)，與標準品(如圖5a)一致。以上結果均表明在上述實驗條件下成功制備了黃酮醇。

6.2.2 FT-IR

本實驗制備的黃酮醇的IR光譜如圖6所示。其中，3300～3100 cm-1處為黃酮醇C環(huán)3位羥基的νO-H吸收峰，1608 cm-1處為黃酮醇C環(huán)上的νC=O吸收峰，758 cm-1、688 cm-1處為單取代及鄰位雙取代苯環(huán)(B、A環(huán))上的δC-H吸收峰，1560 cm-1、1479 cm-1為苯環(huán)νC=C吸收峰，1130 cm-1、897 cm-1處為黃酮醇C環(huán)1位的νasC-O-C、νsC-O-C吸收峰，1211 cm-1處為黃酮醇C環(huán)3位的νC-O吸收峰。

6.2.3 NMR

本實驗制備所得的黃酮醇核磁共振結果如圖7所示。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：8.46(m，3H，a、e、i)，7.91(ddd，1H，c)，7.80(dd，1H，d)，7.78～7.71(m，2H，f、h)，7.71～7.65(m，1H，g)，7.62(ddd，1H，b)。13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：173.64(c)，155.58(h)，145.04(a)，138.61(b)，133.79(f)，131.22(j)，130.34(m)，128.75(n、l)，127.90(k、o)，125.62(d)，124.67(e)，120.78(i)，118.44(g)。結果表明，本法成功制備了純度理想的黃酮醇。

7 結語

本實驗將羥醛縮合反應與AFO氧化環(huán)化反應結合，不經中間體分離，直接“一鍋法”合成天然活性成分黃酮醇，實驗耗時7～8 h，黃酮醇平均產率可達74%。該實驗既讓學生鞏固了有機化學基本實驗操作技能，加深其對羥醛縮合與氧化環(huán)化反應機理的認識，并熟悉該法在天然活性成分黃酮醇制備過程中的實際運用；本實驗的原料苯甲醛、鄰羥基苯乙酮，重結晶溶劑乙醇等都是本科實驗常用的原料，低毒易得，價格便宜；本實驗還具有操作簡便，變色現(xiàn)象明顯，產率較高等的優(yōu)點，易于激發(fā)學生實驗興趣。該實驗設計教學學時8學時，適于將其開設為農林院校有機化學實驗的綜合創(chuàng)新實驗。此外，還可以基于本實驗的反應原理進行底物拓展，引導學生設計并制備新型黃酮醇衍生物，提升學生的綜合實驗能力。