李 瑩，張春戩，楊 磊，劉曉艷，尚 靖，鄭佳新

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036)

慢性腎小球腎炎(chronic glomerulonephritis,CGN)以雙側(cè)腎小球不同程度的炎性病變?yōu)橹饕±碜兓?，以蛋白尿、血尿、水腫、高血壓為主要臨床表現(xiàn)，其病程長(zhǎng)、易復(fù)發(fā)[1-2]。CGN患者若得不到及時(shí)有效的治療，長(zhǎng)期存在的蛋白尿可通過(guò)介導(dǎo)炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子等對(duì)腎小球和腎小管造成持續(xù)性損害，引起不同程度的腎功能減退甚至腎臟纖維化，最終導(dǎo)致終末期腎衰竭[3-5]。CGN的全球發(fā)病率約為13.4%，而我國(guó)的患病率約為10.8%，且隨著高血壓、糖尿病、肥胖及代謝綜合征等疾病發(fā)病率的升高，CGN的發(fā)病率逐年增高[6]。相關(guān)統(tǒng)計(jì)顯示，CGN已經(jīng)成為引起慢性腎衰竭的首要疾病，其導(dǎo)致的慢性腎衰竭約占其總數(shù)的64.1%[1，7]。益氣利濕湯是治療腎病的臨床經(jīng)驗(yàn)方，臨床研究證實(shí)其可以明顯改善慢性腎炎患者的血尿、蛋白尿及臨床癥狀[8]，實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)其可通過(guò)影響血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A(VEGF-A)/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2(VEGFR-2)信號(hào)通路起到減輕阿霉素腎病大鼠蛋白尿的作用[9]，但其具體作用機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)基于p38MAPK信號(hào)通路，旨在進(jìn)一步探討益氣利濕湯治療CGN的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠50只，體重(200±20)g，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK(遼)2020-0002。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(22±2)℃，濕度(50±10)%，照明時(shí)間12 h/d。本實(shí)驗(yàn)相關(guān)操作經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行(SY3R-2022028)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 益氣利濕湯，組方：黃芪20 g、黨參20 g、芡實(shí)20 g、車前子15 g、黃芩15 g、半枝蓮20 g、魚(yú)腥草20 g、白花蛇舌草20 g、柴胡15 g、地骨皮15 g、麥冬15 g、茯苓15 g、僵蠶20 g，購(gòu)自黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院。藥物加5倍量水煎煮2次，濾過(guò)，合并煎煮藥液，濃縮至每1 mL含生藥3.5 g的濃縮液備用。雷公藤多苷片，浙江得恩德制藥股份有限公司，批號(hào)：1905121B；阿霉素(注射用鹽酸多柔比星)，海正輝瑞制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H33021980。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 深圳雷杜RT-2100C酶標(biāo)儀，日立LST-003全自動(dòng)生化儀，奧體BK-DM500光學(xué)顯微鏡，Bio-Rad IQTM5 PCR 儀。尿白蛋白、血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、血白蛋白(ALB)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所(貨號(hào)分別為C035-2-1，C013-2-1，C011-2-1，A028-1-1，A110-2-1，A111-2-1，C009-3-1，C010-3-1)；p38MAPK抗體購(gòu)于Cell Signaling Technology公司，貨號(hào)：9212S；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、β-actin單抗和標(biāo)記的二抗均購(gòu)于Abcam公司(貨號(hào)分別為ab92486，ab8226，ab6721)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按體重隨機(jī)分為空白組、模型組、雷公藤組、益氣利濕湯中劑量組、益氣利濕湯高劑量組，每組10只?？瞻捉M大鼠給予生理鹽水0.5 mL/只尾靜脈注射，其他4組大鼠均給予阿霉素6 mg/kg尾靜脈注射。1周后檢測(cè)24 h尿蛋白定量證實(shí)造模成功后，雷公藤組給予雷公藤多苷混懸液0.85 mg/(kg·d)灌胃，益氣利濕湯中、高劑量組分別給予益氣利濕湯24.15 g/(kg·d)、48.3 g/(kg·d)灌胃，空白組與模型組均給予等量生理鹽水灌胃，均1次/d，連續(xù)灌胃5周。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1大鼠狀態(tài)及生化指標(biāo) 于實(shí)驗(yàn)期間密切觀察各組大鼠的狀態(tài)，在末次灌胃之后將大鼠置于代謝籠中24 h留取尿液標(biāo)本，使用雙縮尿比色法測(cè)定各組大鼠24 h尿蛋白定量；稱取大鼠體重，詳細(xì)記錄一般情況，以10%水合氯醛按3.5 mL/kg的劑量麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，離心取上清，使用生化分析儀，采用ELISA法測(cè)定血清中BUN、SCr、ALB、AST、ALT、TC、TG水平。

1.5.2腎臟組織病理形態(tài) 取各組大鼠的腎臟組織，使用多聚甲醛進(jìn)行固定，之后按照步驟分別進(jìn)行脫水、包埋及切片后進(jìn)行HE染色，觀察腎臟組織的形態(tài)。

1.5.3腎臟組織中TGF-β1及p38MAPK蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測(cè)：取適量腎組織剪碎，加入RIPA裂解液，制備勻漿，提取蛋白并使用BCA法測(cè)定其蛋白含量。隨后依次進(jìn)行上樣、電泳及轉(zhuǎn)膜，在TBST中清洗1 min之后使用5%的脫脂牛奶在室溫下封閉1 h，封閉結(jié)束后加入稀釋過(guò)的兔抗鼠單克隆抗體，密封后在4 ℃下孵育過(guò)夜。在TBST中清洗3次后加入使用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記過(guò)的羊抗兔二抗，之后在37 ℃下孵育1 h，使用凝膠成像系統(tǒng)顯影，讀取目的條帶灰度值，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值來(lái)表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5.4腎臟組織中TGF-β1及p38MAPK mRNA表達(dá)情況 采用RT-PCR法檢測(cè)：取部分腎組織用液氮固定，通過(guò)Trizol試劑提取大鼠腎臟組織中的總RNA，具體方法按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將提取到的RNA使用氯仿進(jìn)行處理，4 ℃下離心15 min(10 000 r/min)，使用75%乙醇沉淀，在25 μL的反應(yīng)體積中對(duì)樣品的總RNA(2 μg)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增程序：55 ℃3 min，90 ℃ 15 min，95 ℃ 30 s，66 ℃ 2 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。使用PCR儀測(cè)定熒光信號(hào)，將所獲得的數(shù)據(jù)依照公式2-△△Cq計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物序列：TGF-β1上游引物5’-ATGGTGGACCGCAACAAC-3’，下游引物5’-TGAGCACTGAAGCGAAAGC-3’；p38MAPK上游引物5’-CCGAGCGATACCAGAAC-3’，下游引物5’-CACATCCAACAGACCAATC-3’；β-actin上游引物5’-ACCCGCGAGTACAACCTTCT-3’，下游引物5’-TTCAGGGTCAGGATGCCTCT-3’。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般情況 注射阿霉素后第2天，大鼠尾部出現(xiàn)紅腫，食量開(kāi)始減少，大便偏稀，倦臥，互相畏縮，部分大鼠出現(xiàn)爛尾；實(shí)驗(yàn)過(guò)程中模型組死亡3只，雷公藤組及益氣利濕湯高劑量組各死亡2只，益氣利濕湯低劑量組死亡1只。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，空白組大鼠飲食、二便等一般狀態(tài)均正常；模型組大鼠消瘦、精神萎靡，大便稀溏；雷公藤組及益氣利濕湯中、高劑量組大鼠上述癥狀較模型組明顯減輕。

2.2各組大鼠24 h尿蛋白定量及血清BUN、SCr水平比較 模型組大鼠24 h尿蛋白定量明顯高于空白組(P<0.05)；雷公藤組及益氣利濕湯中、高劑量組大鼠24 h尿蛋白定量均明顯低于模型組(P均<0.05)，且雷公藤組及益氣利濕湯高劑量組均明顯低于益氣利濕湯中劑量組(P均<0.05)；各組間血清BUN、SCr水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 空白組和慢性腎小球腎炎各組大鼠24 h尿蛋白定量及血清BUN、SCr水平比較

2.3各組大鼠肝功能及血脂指標(biāo)比較 與空白組比較，雷公藤組大鼠血清ALT、AST水平均明顯升高(P均<0.05)，模型組和益氣利濕湯中、高劑量組均無(wú)明顯變化(P均>0.05)；模型組大鼠血清ALB水平明顯降低(P<0.05)，血清TC、TG水平均明顯升高(P均<0.05)。與模型組比較，雷公藤組及益氣利濕湯中、高劑量組大鼠血清ALB水平均明顯升高(P均<0.05)，血清TC、TG水平均明顯降低(P均<0.05)。與益氣利濕湯中劑量組比較，雷公藤組和益氣利濕湯高劑量組大鼠血清ALB水平均更高(P均<0.05)，血清TC、TG水平均更低(P均<0.05) 。見(jiàn)表2。

表2 空白組和慢性腎小球腎炎各組大鼠血清肝功能指標(biāo)及血脂指標(biāo)水平比較

2.4各組大鼠腎臟組織病理學(xué)表現(xiàn) 空白組大鼠腎單位飽滿無(wú)間隙，腎小球內(nèi)可見(jiàn)少量紅細(xì)胞，腎小管內(nèi)細(xì)胞豐富且排列規(guī)整；模型組大鼠的腎小管上皮細(xì)胞可見(jiàn)空泡樣變性，間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)局灶性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及大量蛋白管型，并伴有纖維組織增生性改變；與模型組相比，雷公藤組及益氣利濕湯中、高劑量組大鼠上皮細(xì)胞空泡變性程度較輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和蛋白管型減少，且均無(wú)纖維組織增生性改變，其中雷公藤組病變程度最輕。見(jiàn)圖1。

2.5各組大鼠腎組織中TGF-β1、p38MAPK表達(dá)情況 模型組大鼠腎組織中TGF-β1、p38MAPK蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于空白組(P均<0.05)；雷公藤組及益氣利濕湯中、高劑量組大鼠腎組織中TGF-β1、p38MAPK蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)，且雷公藤組及益氣利濕湯高劑量組均明顯低于益氣利濕湯中劑量組(P均<0.05)。見(jiàn)圖2及表3、表4。

表3 空白組和慢性腎小球腎炎各組大鼠腎臟組織中TGF-β1、p38MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

表4 空白組和慢性腎小球腎炎各組大鼠腎臟組織中TGF-β1、p38MAPK mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

免疫機(jī)制是腎小球疾病的始發(fā)機(jī)制，而炎癥介質(zhì)的參與則在此基礎(chǔ)上促進(jìn)了腎小球疾病的發(fā)生及進(jìn)展[10]。多條炎癥相關(guān)信號(hào)通路相互影響、相互作用，共同參與了腎臟組織的炎癥反應(yīng)，其中包括占據(jù)重要地位的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)及核因子-κB ( NF-κB)[11-12]。TGF-β1、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)及白細(xì)胞介素等還能夠激發(fā)下游信號(hào)通路并將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)而對(duì)核內(nèi)相應(yīng)靶基因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，最終產(chǎn)生炎癥效應(yīng)[13]。

作為MAPK家族的重要成員之一，p38MAPK信號(hào)通路能轉(zhuǎn)導(dǎo)多種細(xì)胞外信號(hào)，尤其會(huì)在氧化應(yīng)激環(huán)境中產(chǎn)生大量包括炎癥細(xì)胞、炎癥因子在內(nèi)的炎癥介質(zhì)，從而引起腎臟的足細(xì)胞凋亡及基質(zhì)沉積等病理效應(yīng)。在腎小球疾病的發(fā)生過(guò)程中，p38MAPK信號(hào)通路可以被氧化應(yīng)激、前炎癥因子及高血糖等多種因素誘導(dǎo)而激活，接著通過(guò)激活下游炎癥細(xì)胞、誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)表達(dá)及產(chǎn)生細(xì)胞因子等途徑導(dǎo)致足細(xì)胞損傷[14]。TGF-β1與p38MAPK密切相關(guān)，相互影響，TGF-β1能夠以p38MAPK的上游啟動(dòng)因子的身份存在，從而激活p38MAPK，也可以作為p38MAPK的下游產(chǎn)物而引發(fā)炎癥反應(yīng)。TGF-β1介導(dǎo)的p38MAPK信號(hào)通路與CGN病程進(jìn)展過(guò)程密切相關(guān)，并在其中起關(guān)鍵作用[15]。p38MAPK的過(guò)度激活導(dǎo)致其下游產(chǎn)物相應(yīng)增多進(jìn)而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡并且損傷腎臟組織，且該通路可以與其他相關(guān)通路協(xié)同作用，進(jìn)一步加重腎臟損傷；另外，p38MAPK可以通過(guò)對(duì)TGF-β1、NF-κB等因子表達(dá)的調(diào)控影響腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展，是腎臟纖維化的一條經(jīng)典途徑[16]。

益氣利濕湯是王鐵良教授治療腎病的經(jīng)驗(yàn)方劑，方中黃芪、黨參補(bǔ)氣升陽(yáng)，脾肺同調(diào)，可同時(shí)助脾運(yùn)化、助肺行水，并且現(xiàn)代藥理研究表明此二味中藥可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能[17-18]；芡實(shí)補(bǔ)益脾腎，與芪、參相合脾腎同補(bǔ)，使得先后天相互滋養(yǎng)；茯苓淡滲利濕，與參、芪相配更增利水之能；黃芩清上焦心肺之熱，肺熱清則清肅下行，心火清則心腎相交；地骨皮、麥冬有滋陰清熱之功，地骨皮還具有調(diào)節(jié)免疫及降低血糖、血壓、膽固醇的作用[19]；車前子通利水道，滲濕泄熱；僵蠶祛風(fēng)通絡(luò)；柴胡疏肝理氣，兼以和解少陽(yáng)；另外酌加半枝蓮、白花蛇舌草、魚(yú)腥草等防其熱化。此方補(bǔ)氣與養(yǎng)陰并重，兼以清熱利濕，諸藥相配, 相輔相成，使得諸邪得去、諸證得解。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)TGF-β1/p38MAPK表達(dá)水平的檢測(cè)探索其是否為益氣利濕湯治療CGN的作用靶點(diǎn)，結(jié)果顯示益氣利濕湯可以顯著降低阿霉素致CGN大鼠的24 h尿蛋白定量及血清TC、TG，升高血清ALB，可有效減輕腎臟病理學(xué)改變，減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及蛋白管型的數(shù)量，其機(jī)制可能與調(diào)控TGF-β1/p38MAPK信號(hào)通路進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)損傷有關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。