譚義洲，丁考仁青，褚 敏，郭 憲，馬曉明，包鵬甲，閻 萍，梁春年

(1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅 蘭州 730050；2 甘南州畜牧科學(xué)研究所，甘肅 甘南 747000)

藏羊(Tibetan sheep)是中國(guó)三大粗毛綿羊品種之一，具有悠久的養(yǎng)殖歷史。目前藏羊主要分布在我國(guó)西藏、青海、甘肅等高海拔地區(qū)[1]，依據(jù)其生態(tài)環(huán)境，結(jié)合自身的生產(chǎn)及經(jīng)濟(jì)特點(diǎn)可分為高原型、山谷型和歐拉型3大類。藏羊?qū)Ω吆０蔚貐^(qū)的各種極端環(huán)境適應(yīng)性很強(qiáng)，且具有生長(zhǎng)發(fā)育快、育肥性能好等特點(diǎn)，是高原畜牧業(yè)中的珍貴物種資源[2-3]，目前有關(guān)藏羊遺傳學(xué)和分子生物學(xué)方面的研究仍處于較低水平。

解偶聯(lián)蛋白(uncoupling protein,UCPs)是一種線粒體內(nèi)膜蛋白，廣泛分布在動(dòng)物各種組織中。其能消除線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的跨膜質(zhì)子濃度差，導(dǎo)致利用質(zhì)子濃度差驅(qū)動(dòng)的氧化磷酸化過程減慢，阻礙了三磷酸腺苷(ATP)的正常產(chǎn)生，使能量以熱量形式消散[4]。UCP2是UCPs家族里的一員，其在調(diào)節(jié)能量代謝、胰島素分泌、活性氧(ROS)產(chǎn)生以及細(xì)胞代謝、細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡等不同細(xì)胞過程中發(fā)揮著重要作用[5-6]。UCP3和UCP2基因緊密連鎖定位于藏羊的15號(hào)染色體上，當(dāng)受到脂肪酸刺激時(shí)，UCP3基因表達(dá)量上調(diào)，且其蛋白會(huì)參與脂肪酸和其他陰離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[7]。UCP3基因的活性對(duì)氨基酸代謝和脂肪酸氧化及相關(guān)的生化途徑具有重要調(diào)節(jié)作用[8]。國(guó)鵬等[9]研究發(fā)現(xiàn)，黑安格斯牛UCP2-655和UCP3-5465基因多態(tài)性位點(diǎn)與其生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)。艾錦新等[10]采用直接測(cè)序法檢測(cè)黔北麻羊UCP2基因的SNP位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)4個(gè)SNPs位點(diǎn)對(duì)生長(zhǎng)性狀有顯著影響。郝軍等[11]通過直接測(cè)序法對(duì)麥洼牦牛UCP2和UCP3基因多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，共發(fā)現(xiàn)4個(gè)突變位點(diǎn)，其中UCP2基因T1499C位點(diǎn)CT基因型個(gè)體的體質(zhì)量顯著高于TT型。

目前對(duì)于藏羊UCP2和UCP3基因多態(tài)性與其生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析尚未見報(bào)道，本研究以UCP2和UCP3作為候選基因，測(cè)定歐拉型藏羊的生長(zhǎng)性狀，探討該基因多態(tài)性與藏羊生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性，以期篩選歐拉型藏羊分子育種良好的輔助分子標(biāo)記，進(jìn)而為歐拉型藏羊的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

自甘南地區(qū)采集自然放牧的成年健康歐拉型藏羊239頭，每頭使用含有ACD抗凝的真空采血管頸靜脈采血10 mL，輕微振蕩搖勻后置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r(shí)測(cè)定并記錄每頭藏羊的體質(zhì)量、體高、體斜長(zhǎng)、胸圍等體尺性狀。

1.2 主要試劑及儀器

EasyPure?Blood Genomic DNA Kit血液基因組DNA提取試劑盒、2×EasyTaq?PCR SuperMix，均購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限(北京)公司；NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)、PCR儀，均購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；DYY-6C型電泳儀，購(gòu)自北京市六一儀器廠；天能Tanon2500全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)，購(gòu)自上海天能科技有限公司。

1.3 血液樣品DNA的提取

采用EasyPure?Blood Genomic DNA Kit血液基因組DNA提取試劑盒，對(duì)歐拉型藏羊的全血基因組DNA進(jìn)行提取，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其質(zhì)量和濃度，將合格的DNA置于1.5 mL離心管中，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank公布的藏羊UCP2(登錄號(hào)為NM_001280682.1)、UCP3(GenBank登錄號(hào)為NM_001308581.1)及試驗(yàn)已知信息，分別對(duì)UCP2基因第4，5，6和7外顯子以及UCP3基因第3，4外顯子和部分內(nèi)含子區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，引物送西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司合成。

表1 本研究引物序列信息Table 1 Primer sequence information in this study

1.5 UCP2和UCP3基因PCR擴(kuò)增及遺傳多態(tài)性分析

PCR擴(kuò)增體系10 μL:2×EasyTaq?PCR SuperMix 5 μL，DNA模板(100 ng/μL)0.8 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，蒸餾水3.4 μL。PCR擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，不同退火溫度(表1)下退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司測(cè)序。使用SeqMan軟件拼接測(cè)序所得結(jié)果序列并篩選其套峰位點(diǎn)，再采用MEGA 5.1軟件與參考序列進(jìn)行對(duì)比，初步確定其SNP位點(diǎn)，再以其為模板擴(kuò)增相應(yīng)的序列，對(duì)每個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型。根據(jù)基因型統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果計(jì)算基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量(PIC)(PIC>0.5為高度多態(tài)；0.5>PIC>0.25為中度多態(tài)；PIC<0.25為低度多態(tài))、基因雜合度(He)和有效等位基因數(shù)(Ne)，并進(jìn)行Hard-Weinberg平衡(HWE)適應(yīng)性檢驗(yàn)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用SPSS 21.0中GLM模型的單因素方差分析(One-Way ANOVE)，結(jié)合Duncan’s對(duì)不同基因型個(gè)體的生長(zhǎng)性狀進(jìn)行差異顯著性分析，試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 歐拉型藏羊UCP2、UCP3基因的PCR擴(kuò)增

以歐拉型藏羊UCP2、UCP3基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖1和圖2所示。由圖1可知，UCP2基因第4外顯子擴(kuò)增條帶大小為631 bp，第5,6外顯子擴(kuò)增條帶大小為777 bp，第7外顯子擴(kuò)增條帶大小為635 bp。由圖2可知，UCP3基因第3外顯子擴(kuò)增條帶大小為282 bp，第4外顯子擴(kuò)增條帶大小為314 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期目的條帶大小一致，可直接用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 歐拉型藏羊UCP2、UCP3基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序及SNPs位點(diǎn)篩選

通過對(duì)歐拉型藏羊UCP2、UCP3基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，再根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行SNPs位點(diǎn)篩選和基因分型分析，結(jié)果見圖3和圖4。

圖3顯示，在UCP2基因的擴(kuò)增產(chǎn)物g.52130414 C>T、g.52130584 G>A和UCP3基因的擴(kuò)增產(chǎn)物g.52157335 C>T均發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)，即測(cè)序峰圖出現(xiàn)不同類型的峰。由圖4可見，g.52130414 C>T產(chǎn)生了CC、CT和TT 3種基因型，g.52130584 G>A產(chǎn)生了AA、AG和GG 3種基因型，g.52157335 C>T產(chǎn)生了CC、CT和TT 3種基因型。

2.3 歐拉型藏羊UCP2、UCP3基因遺傳多態(tài)性分析

對(duì)歐拉型藏羊UCP2、UCP3基因確定的3個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析，結(jié)果(表2)表明,在UCP2基因g.52130414 C>T突變位點(diǎn)中，等位基因C為優(yōu)勢(shì)等位基因，CT為優(yōu)勢(shì)基因型，純合度為0.535，雜合度為0.465，有效等位基因數(shù)為1.87，多態(tài)信息含量為0.357，屬于中度多態(tài)位點(diǎn)；在UCP2基因g.52130584 G>A突變位點(diǎn)中，等位基因G為優(yōu)勢(shì)等位基因，GG為優(yōu)勢(shì)基因型，純合度為0.643，雜合度為0.357，有效等位基因數(shù)為1.554，多態(tài)信息含量為0.293，屬于中度多態(tài)位點(diǎn)；在UCP3基因g.52157335 C>T突變位點(diǎn)中，等位基因T為優(yōu)勢(shì)等位基因，TT為優(yōu)勢(shì)基因型，純合度為0.561，雜合度為0.439，有效等位基因數(shù)為1.784，多態(tài)信息含量為0.343，也屬于中度多態(tài)位點(diǎn)?？ǚ?χ2)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，3個(gè)SNPs位點(diǎn)均符合Hard-Weinberg平衡(HWE)適應(yīng)性檢驗(yàn)(P>0.05)。

表2 歐拉型藏羊UCP2、UCP3基因多態(tài)位點(diǎn)遺傳多態(tài)性分析Table 2 Genetic polymorphism analysis of UCP2 and UCP3 in Oula-type Tibetan sheep

2.4 歐拉型藏羊UCP2和UCP3基因SNPs位點(diǎn)不同基因型與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

將歐拉型藏羊UCP2和UCP3基因SNP位點(diǎn)不同基因型與其體質(zhì)量、體高、體斜長(zhǎng)和胸圍4個(gè)生長(zhǎng)性狀指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果如表3所示。由表3可知，UCP2基因g.52130414 C>T位點(diǎn)TT基因型體質(zhì)量顯著高于CT基因型(P<0.05)；g.52130584 G>A位點(diǎn)AA基因型體質(zhì)量和體斜長(zhǎng)均極顯著高于AG和GG基因型(P<0.01),AA和GG基因型胸圍均顯著高于AG基因型；UCP3基因g.52157335 C>T位點(diǎn)CC基因型體質(zhì)量顯著高于CT基因型(P<0.05)，TT基因型胸圍顯著高于CT基因型(P<0.05)。其余生長(zhǎng)性狀在各基因型之間差異均不顯著(P>0.05)。

表3 UCP2和UCP3基因SNPs位點(diǎn)多態(tài)性與歐拉型藏羊生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析Table 3 Association analysis of SNPs polymorphisms of UCP2 and UCP3 genes with growth traits of Oula-type Tibetan sheep

2.5 歐拉型藏羊UCP2和UCP3基因SNPs位點(diǎn)基因型組合與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

生物的生長(zhǎng)性狀并非只由單個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控，而是多個(gè)位點(diǎn)共同調(diào)控的結(jié)果[12]。將3個(gè)SNPs位點(diǎn)組合成雙倍型進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)UCP2和UCP3的SNPs位點(diǎn)基因型組合共有11種，因不具備統(tǒng)計(jì)意義，剔除其中發(fā)生頻率低于0.05的6種組合，再對(duì)剩余5種基因型組合與歐拉型藏羊進(jìn)行生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果見表4。

由表4可知，D5型歐拉型藏羊體質(zhì)量極顯著高于D1、D2、D3型(P<0.01)；D5型歐拉型藏羊體高顯著高于D3型(P<0.05)；D5型歐拉型藏羊體斜長(zhǎng)極顯著高于D2型(P<0.01)，且顯著高于D1、D3、D4型(P<0.05)；各雙倍型歐拉型藏羊胸圍差異均不顯著。

3 討 論

生長(zhǎng)性狀不僅是衡量畜禽個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育的重要指標(biāo)，同時(shí)也在畜禽育種中發(fā)揮著重要的作用，能反映其育種價(jià)值及經(jīng)濟(jì)效益。本研究將基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，可直觀地篩選出良好的分子標(biāo)記以提高歐拉型藏羊的育種效率，對(duì)歐拉型藏羊的選育具有重要意義。歐拉型藏羊UCP2和UCP3基因位于15號(hào)染色體上，分別由8和7個(gè)外顯子組成。對(duì)于UCP2和UCP3基因，目前研究較為成熟的多是其與人體疾病的關(guān)系[13-15]，對(duì)歐拉型藏羊的相關(guān)研究仍處于初級(jí)階段。已有研究結(jié)果表明，UCP2和UCP3基因與畜禽機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育和脂肪沉積息息相關(guān)。張繼等[16]對(duì)江口蘿卜豬的研究發(fā)現(xiàn)，UCP2基因表達(dá)量的增加不利于脂肪沉積，導(dǎo)致肉品質(zhì)變差；蔣秋斐等[17]對(duì)西門塔爾雜種牛UCP3基因的G5465A、T8162C位點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)GA和CC基因型會(huì)影響其體高和體斜長(zhǎng)等性狀以及后期的體質(zhì)量增加速度；Kowalewska-uczak等[18]對(duì)澤西奶牛、波蘭荷斯坦奶牛UCP2和UCP3基因與產(chǎn)奶性狀的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，2種基因均與產(chǎn)奶量和乳脂含量存在顯著相關(guān)性。趙祎等[19]對(duì)延邊黃牛UCP2和UCP3基因與生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)2基因均存在一處突變，且對(duì)延邊黃牛的生長(zhǎng)發(fā)育具有顯著影響；Wang等[20]將秦川牛UCP2和UCP3基因多態(tài)性與肉質(zhì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，證實(shí)UCP2和UCP3基因與秦川牛的肉質(zhì)性狀密切相關(guān)。

本研究以UCP2和UCP3基因?yàn)楹蜻x基因，通過DNA直接測(cè)序法對(duì)239頭成年歐拉型藏羊進(jìn)行檢測(cè)，在UCP2基因第5外顯子上發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNPs位點(diǎn)，根據(jù)其在染色體上的位置分別命名為g.52130414 C>T和g.52130584 G>A，其中g(shù).52130414 C>T產(chǎn)生TT、CT和CC 3種基因型，g.52130584 G>A產(chǎn)生AA、AG和GG 3種基因型；在UCP3第3外顯子上發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNP位點(diǎn)，命名為g.52157335 C>T，其產(chǎn)生CC、CT和TT 3種基因型。3個(gè)SNPs位點(diǎn)均是位于編碼區(qū)的錯(cuò)義突變位點(diǎn)，因?yàn)榫幋a區(qū)的核苷酸序列發(fā)生改變會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，從而影響蛋白質(zhì)的功能[21]。由此推測(cè)，這3個(gè)SNPs位點(diǎn)的突變會(huì)影響歐拉型藏羊UCP2和UCP3蛋白的生理學(xué)功能。

遺傳多態(tài)性是指在同一群體中，某個(gè)基因座上存在2個(gè)或2個(gè)以上的等位基因，且等位基因的頻率大于0.01的現(xiàn)象，其形成機(jī)制是基因突變。通過對(duì)遺傳多態(tài)性的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行分析可從不同角度得到群體的遺傳變異程度。群體的遺傳變異程度越高，表明群體的遺傳多樣性越豐富，選擇潛力越好，對(duì)育種改良的進(jìn)行就更有利[22]。本試驗(yàn)對(duì)3個(gè)SNPs位點(diǎn)遺傳多態(tài)性的分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)SNPs位點(diǎn)均屬于中度多態(tài)位點(diǎn)，說明其遺傳變異程度較大，具有一定的選育潛力，且3個(gè)SNPs位點(diǎn)均符合Hard-Weinberg平衡適應(yīng)性檢驗(yàn)。

近年來，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，分子育種技術(shù)已廣泛運(yùn)用到畜禽生產(chǎn)中，大大提高了育種效率，加快了育種進(jìn)程[23]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)UCP2和UCP3基因的研究多在人體上或牛、豬等畜禽上[24-26]，本研究對(duì)UCP2和UCP3基因多態(tài)性與歐拉型藏羊生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，UCP2基因g.52130414 C>T位點(diǎn)TT基因型體質(zhì)量顯著高于CT基因型(P<0.05)；g.52130584 G>A位點(diǎn)AA基因型體質(zhì)量和體斜長(zhǎng)均極顯著高于AG和GG基因型(P<0.01),AA和GG基因型胸圍均顯著高于AG基因型(P<0.05)。UCP3基因g.52157335 C>T位點(diǎn)CC基因型體質(zhì)量顯著高于CT基因型(P<0.05)，TT基因型胸圍顯著高于CT基因型(P<0.05)。體質(zhì)量和胸圍都是直接反映畜禽生長(zhǎng)情況的重要指標(biāo)，在基因型組合分析中，雙倍型D5型的體質(zhì)量極顯著高于D1、D2、D3型(P<0.01)，體高顯著高于D3型(P<0.05)，體斜長(zhǎng)極顯著高于D2型(P<0.01)，同時(shí)且顯著高于D1、D3、D4型(P<0.05)；各雙倍型藏羊胸圍間均無顯著差異(P>0.05)。綜上所述，UCP2基因g.52130414 C>T位點(diǎn)的TT基因型個(gè)體在體質(zhì)量、體高、體斜長(zhǎng)和胸圍生長(zhǎng)性狀上較CT和CC基因型具有更好的優(yōu)勢(shì)；g.52130584 G>A位點(diǎn)的AA基因型個(gè)體在體質(zhì)量、體高、體斜長(zhǎng)和胸圍生長(zhǎng)性狀上較AG和GG基因型具有良好的優(yōu)勢(shì)；UCP3基因g.52157335 C>T位點(diǎn)的CC基因型個(gè)體在各項(xiàng)生長(zhǎng)性狀指標(biāo)上均較CT和TT基因型具有較好的優(yōu)勢(shì)，因此可以分別選擇TT、AA和CC基因型作為后期育種中篩選的目的基因型。根據(jù)基因型組合分析可知，D5雙倍型為優(yōu)勢(shì)基因型，在各生長(zhǎng)性狀上圴明顯優(yōu)于其他雙倍型，可在后期選育工作中予以優(yōu)先考慮。

4 結(jié) 論

研究分析了歐拉型藏羊UCP2和UCP3基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性，在UCP2基因第5外顯子篩選出g.52130414 C>T和g.52130584 G>A 2個(gè)SNPs位點(diǎn)，在UCP3基因第3外顯子篩選出g.52157335 C>T 1個(gè)SNP位點(diǎn)，3個(gè)SNPs位點(diǎn)均屬于中度多態(tài)位點(diǎn)，且屬于錯(cuò)義突變，表明其具有較大的選育潛力，可改變歐拉型藏羊UCP2和UCP3基因表達(dá)蛋白的生理學(xué)功能。3個(gè)突變位點(diǎn)對(duì)歐拉型藏羊體質(zhì)量、體高、體斜長(zhǎng)和胸圍皆具有顯著影響；D5雙倍型為優(yōu)勢(shì)基因型，對(duì)生長(zhǎng)性狀影響顯著。可將UCP2、UCP3基因作為影響歐拉型藏羊生長(zhǎng)性狀的候選遺傳標(biāo)記用于育種輔助選擇，為后續(xù)歐拉型藏羊的分子育種提供科學(xué)依據(jù)。