劉項羽，聶慶慶，杜恩岐

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院,陜西 楊凌 712100)

PCV2開放閱讀框2(ORF2)編碼的Cap蛋白(約30 ku)形成的病毒樣顆粒(VLPs)與完整的PCV2病毒粒子相似，是PCV2疫苗研制的理想靶標(biāo)[3]。PCV2亞單位疫苗是利用桿狀病毒表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)或大腸桿菌表達系統(tǒng)等高效表達PCV2 Cap蛋白，然后對Cap蛋白進行提取、純化、滅活，再與適宜佐劑乳化后制備而成。由VLPs制備的疫苗免疫原性良好[4-6]，可誘導(dǎo)豬產(chǎn)生免疫保護反應(yīng)，對PCV2病毒產(chǎn)生完全保護[7-8]。VLPs具有很多獨特的性質(zhì)，如能夠進行自我裝配；允許外源基因或基因片段的插入而形成嵌合型VLPs,并將外源性抗原表位展示在其表面，可以作為疫苗呈遞工具，能有效地將表位或基因呈遞給靶細胞，因此在疫苗研究中受到廣泛關(guān)注。外源基因的大小以及展示位點可影響VLPs的形成。Khayat等[9]深入分析了Cap單體以及VLPs的結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cap蛋白N末端在結(jié)構(gòu)內(nèi)部，而C末端暴露在結(jié)構(gòu)外部。研究表明，在Cap蛋白的C-端插入相應(yīng)外源細胞表位,能夠同時誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對Cap和外源細胞表位的免疫反應(yīng)，且不影響VLPs的形成[10]，但目前關(guān)于Cap蛋白C末端展示外源基因后對VLPs穩(wěn)定性的影響研究尚比較少。為此，本研究采用分子生物學(xué)方法合成cap基因及其C-端嵌合PRRSV T細胞抗原表位的cap-T1、cap-T2、cap-T3、cap-T4和cap-T5基因，構(gòu)建其重組菌并進行誘導(dǎo)表達，對表達產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性及VIPs的免疫效果進行檢測，以期為開發(fā)穩(wěn)定、免疫效果良好的PCV2 VLPs疫苗提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

pET28a、ClearColiTMBL21(DE3)，由西北農(nóng)林科技大學(xué)新獸藥研究團隊保存。質(zhì)粒提取試劑盒，購自NEB；TIGEN基因組提取試劑盒、primeSTAR max premix，購自TaKaRa；DNA Marker、限制性內(nèi)切酶，購自大連寶生物工程有限公司；IPTG，購自Genview公司；蛋白Marker，購自Therma公司；瓊脂糖，購自國藥集團；Elisa檢測試劑盒，購自韓國金諾；冷凍透射電鏡，來自中國科學(xué)院武漢病毒研究所；SDA25和SQ佐劑，購自賽德奧生物科技有限公司；S350佐劑，購自桑米特生物科技有限公司。

1.2 cap及其C-端嵌合PRRSV T細胞抗原表位基因的合成

從GenBank中獲取1株P(guān)CV2b型毒株(ZJ株)的cap基因，對其密碼子進行優(yōu)化。同時，在cap基因C-端分別引入經(jīng)篩選的PRRSV T細胞抗原表位T1(SSSHLQLIY)、T2(LLDTKGKLY)、T3(KVDVGGHLI)、T4(RRYVLSSIY-AV)和T5(FLDTV-GLITVSTAGYYHRR)，對其密碼子進行優(yōu)化，構(gòu)建cap-T1、cap-T2、cap-T3、cap-T4和cap-T5基因，將構(gòu)建的基因送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 重組菌株的構(gòu)建

根據(jù)上述合成的基因序列，利用DNAstar軟件設(shè)計擴增cap、cap-T1、cap-T2、cap-T3、cap-T4、cap-T5基因的引物F、R、F/R-T1、F/R-T2、F/R-T3、F/R-T4、F/R-T5，交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物及其序列詳見表1。

表1 試驗用引物及其序列信息Table 1 Primer sequence information

利用上述引物對合成的cap基因序列進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系(20 μL)為：Taq預(yù)混酶10 μL，引物F、R(0.5 μmol/L)各0.5 μL，合成的cap基因模板(約200 ng/μL)0.5 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR擴增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。以相同的PCR反應(yīng)體系和擴增條件，分別用引物F/R-T1、F/R-T2、F/R-T3、F/R-T4和F/R-T5擴增基因cap-T1、cap-T2、cap-T3、cap-T4和cap-T5。用1%瓊脂糖凝膠對所有基因的擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，用膠回收試劑盒回收目的基因條帶。

分別將回收到的目的基因cap、cap-T1、cap-T2、cap-T3、cap-T4、cap-T5及載體pET28a,用NcoⅠ/Hind Ⅲ雙酶切，酶切體系(20 μL)為：目的基因10 μL，限制性內(nèi)切酶NcoⅠ 1 μL，限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ 1 μL，緩沖液2 μL，ddH2O 6 μL，37 ℃反應(yīng)3.5 h，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果，用膠回收試劑盒回收目的基因條帶及pET28a載體條帶。將回收到的目的基因與pET28a載體連接(連接體系為10 μL：pET28a 1 μL，目的基因4 μL，連接酶混合液solution Ⅰ 5 μL)，16 ℃連接2 h，通過42 ℃熱擊法轉(zhuǎn)化ClearColiTMBL21(DE3)感受態(tài)細胞(制備參照常規(guī)大腸桿菌感受態(tài)細胞制備方法)，用涂布含卡那霉素抗性(終質(zhì)量濃度50 μg/mL)的LB平板進行篩選，挑取單克隆進行PCR驗證和測序驗證。將測序正確的菌株分別命名為重組菌pET28a-cap/ClearColiTMBL21(DE3)、pET28a-cap-T1/ClearColiTMBL21(DE3)、pET28a-cap-T2/ClearColiTMBL21(DE3)、pET28a-cap-T3/ClearColiTMBL21(DE3)、pET28a-cap-T4/ClearColiTMBL21(DE3)和pET28a-cap-T5/ClearColiTMBL21(DE3)，并進行菌種保藏。

1.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達

挑取上述6株單克隆菌，分別接種于含卡那霉素(終質(zhì)量濃度50 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，34 ℃培養(yǎng)過夜，按照體積分數(shù)2%的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基(其中含有酵母提取物20 g/L，胰蛋白胨10 g/L，硫酸銨20 mmol/L，硫酸鎂6 mmol/L，PB 50 mmol/L，甘油10 g/L，調(diào)pH為7.2)中，37 ℃ 220 r/min培養(yǎng)至菌液在600 nm處吸光度(OD600)為0.6左右時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，于28 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)9 h。取誘導(dǎo)培養(yǎng)液，12 000 r/min離心5 min，收集重組菌體，按照1 g菌體加9 mL PBS緩沖液(pH 7.2)的比例制備菌懸液，于ATS均質(zhì)機中進行細胞破碎(壓力為80 000 kPa，破碎2遍)，收集細胞破碎液。

分別取上述6種細胞破碎液200 μL于1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心5 min，取上清200 μL，加入5×蛋白上樣緩沖液50 μL；沉淀加入200 μL PBS緩沖液(pH 7.2)重懸，混勻后同樣加入5×蛋白上樣緩沖液50 μL。將上清和沉淀液蛋白均置于100 ℃水浴中處理3 min，12 000 r/min離心5 min，取上清10 μL進行SDS-PAGE蛋白電泳驗證。

基于“調(diào)整結(jié)構(gòu)、補齊短板、提升質(zhì)量”，推進供給側(cè)改革，以精準(zhǔn)扶貧為核心，“輸血”與“造血”相結(jié)合，從目標(biāo)層、戰(zhàn)略層和路徑層提出供給側(cè)改革視角下精準(zhǔn)扶貧優(yōu)化路徑，對接扶貧資源供需，確保貧困地區(qū)精準(zhǔn)脫貧，見圖4。

1.5 熱處理對PCV2 Cap VLPs樣品穩(wěn)定性的影響

分別取上述細胞破碎液500 μL于1.5 mL EP管中，置60 ℃水浴鍋中處理30 min，取樣，加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃處理3 min。對照為未經(jīng)過熱處理的細胞破碎液上清。離心后取樣進行SDS-PAGE檢測。

對熱處理后的細胞破碎液上清進行抗體-抗原瓊脂糖平板擴散驗證試驗。將熱處理后的細胞破碎液上清樣品于“V”型板上做2，4，8，16，32，64，128，256倍稀釋，在制備好的瓊脂糖擴散平板(直徑4 mm的梅花形打孔器打孔，中間孔與外周孔距離為3 mm)6個周圍孔中加入稀釋好的樣品60 μL/孔，在中間孔加入Cap陽性血清(60 μL)，將瓊脂糖擴散平板放入濕盒，蓋好蓋放入37 ℃溫箱中反應(yīng)48～72 h后取出，瓊脂糖擴散平板讀數(shù)；按照成線清晰及重復(fù)孔是否一致讀數(shù)，判定效價。試驗重復(fù)2次，對照為未經(jīng)過熱處理的細胞破碎液上清。

1.6 PCV2 VLPs顆粒的冷凍透射電鏡觀察

分別將pET28a-cap/ClearColiTMBL21(DE3)、 pET28a-cap-T4/ClearColiTMBL21(DE3)細胞破碎液60 ℃熱處理30 min，取上清放置在碳包覆的銅網(wǎng)格上，用濾紙干燥，用質(zhì)量分數(shù)2%磷鎢酸負染，室溫下放置24 h；用透射電子顯微鏡(HT7700)在120 kV的加速電壓下進行電鏡觀察，確定Cap蛋白是否組裝成VLPs顆粒。

1.7 VLPs免疫效果檢測

取20只小鼠，隨機分為陽性對照(市場苗)、陰性對照(生理鹽水)、VLPs+佐劑SQ、VLPs+佐劑S350和VLPs+佐劑SDA25等5個組，每組4只。由于C-端嵌合PRRSV T細胞抗原表位后導(dǎo)致VLPs不穩(wěn)定，故小鼠試驗未設(shè)計C-端融合外源基因的試驗組。

免疫程序為：免疫1針，注射劑量100 μL/只(免疫劑量為20 μg/只)，陰性對照組注射等體積生理鹽水代替疫苗。分別于免疫后7，14，21和28 d采血，使用PCV-2抗體檢測試劑盒的Elisa定量抗體水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的PCR擴增

以合成的基因為模板進行PCR擴增，結(jié)果(圖1)顯示，目的條帶單一清晰，cap、cap-T1、cap-T2、cap-T3、cap-T4和cap-T5基因大小分別為633，660，660，660，666和690 bp，均與預(yù)期擴增片段大小一致。

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達

將上述驗證正確的重組菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)表達后收集菌體，細胞破碎后經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳驗證，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，獲得的Cap蛋白及Cap-T1、Cap-T2、Cap-T3、Cap-T4和Cap-T5嵌合蛋白大小正確，條帶清晰，其分子質(zhì)量約為26 ku，灰度分析顯示60%以上的蛋白為可溶性表達。

2.3 熱處理對PCV2 Cap VLPs樣品穩(wěn)定性的影響

2.3.1 SDS-PAGE試驗 由圖3可知，60 ℃處理不同時間對目的蛋白Cap含量幾乎無影響，說明PCV2 Cap蛋白具有一定的熱穩(wěn)定性，這為后期利用原核系統(tǒng)規(guī)?；a(chǎn)高質(zhì)量的PCV2 VLPs疫苗奠定了基礎(chǔ)。圖4表明，60 ℃處理30 min時，Cap-T1、Cap-T2、Cap-T3、Cap-T4和Cap-T5嵌合蛋白大部分遭到損失。

2.3.2 血清抗體-抗原瓊脂糖擴散試驗 瓊脂糖擴散試驗結(jié)果顯示，所有重組菌株細胞破碎液上清液瓊脂糖擴散效價均為8，說明cap基因C-端嵌合PRRSV T細胞抗原表位具有可行性，結(jié)合前述SDS-PAGE結(jié)果可知，cap基因C-端嵌合PRRSV T細胞抗原表位并未影響Cap蛋白的表達量，但熱處理(60 ℃ 30 min)后，pET28a-cap/ClearColiTMBL21(DE3) 細胞破碎液上清瓊脂糖擴散效價未下降，而C端嵌合PRRSV T細胞抗原表位的重組菌株細胞破碎液上清瓊脂糖平板擴散效價均有大幅下降，其中pET28a-cap-T1/ClearColiTMBL21(DE3)、pET28a-cap-T2/ClearColiTMBL21(DE3)、pET28a-cap-T3/ClearColiTMBL21(DE3)瓊脂糖擴散效價降為0，而pET28a-cap-T4/ClearColiTMBL21(DE3)、pET28a-cap-T5/ClearColiTMBL21(DE3)瓊脂糖擴散效價降為2。

2.4 Cap蛋白的VLPs顆粒電鏡觀察

由圖5電鏡觀察結(jié)果可以看出，在pET28a-cap/ClearColiTMBL21(DE3) 細胞破碎液60 ℃處理30 min后的上清液中，能夠清晰地看到大量PCV2 VLPs的形成；而在pET28a-cap-T4/ClearColiTMBL21(DE3)的細胞破碎液60 ℃熱處理30 min后的上清中，依然能夠觀察到大量處于半解聚狀態(tài)的VLPs顆粒，VLPs的不規(guī)則性明顯增加。

2.5 VLPs的小鼠免疫效果評價

由圖6可知，無論是市場苗，還是來源于原核VLPs的自配苗，免疫后21 d抗體均達到了較高水平，其中VLPs+佐劑SDA25組免疫效果與陽性對照效果相當(dāng)，VLPs+佐劑S350組免疫效果較陽性對照效果更好。

3 討 論

目前，人們已經(jīng)利用真核和原核表達系統(tǒng)成功制備出PCV2 Cap基因工程疫苗，如張家明[11]用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的PCV2 Cap蛋白制備亞單位疫苗，張永武等[12]采用bacPAK桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的PCV2 Cap蛋白制備亞單位疫苗，梁翠琴[13]將Cap蛋白在Sf9細胞中進行表達并對其免疫原性進行了檢測。目前，利用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達PCV2 Cap蛋白，其表達量已經(jīng)能夠提升到198 mg/L[14]，但限于培養(yǎng)時間及培養(yǎng)成本，由其生產(chǎn)的疫苗價格依然偏高。大腸桿菌表達系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、操作簡便、培養(yǎng)周期短、可以大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)、產(chǎn)量高、成本低等優(yōu)點，是現(xiàn)階段規(guī)?；a(chǎn)重組蛋白常用的表達系統(tǒng)。2005年，Shang等[15]最先采用大腸桿菌表達了信號肽定點突變的Cap蛋白，并通過PCV2陽性血清反應(yīng)驗證了其特異性，開啟了原核表達制備亞單位疫苗的先河。楊瑩瑩等[16]利用原核表達系統(tǒng)獲得了免疫原性良好的高純度重組Cap蛋白；另外，有研究者利用PCV2 Cap蛋白結(jié)合一系列融合標(biāo)簽(SUMO標(biāo)簽、His標(biāo)簽、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶GST等)進行共同表達，使Cap蛋白的免疫效果得到了明顯提高[17]。

Beach等[18]成功地構(gòu)建了在PCV2 Cap N-端和C-端插入標(biāo)簽的重組嵌合型病毒，其中插入到PCV2 Cap蛋白C-端的標(biāo)簽?zāi)軌蛘T導(dǎo)豬同時產(chǎn)生抗Cap和抗標(biāo)簽蛋白的抗體，證明外源基因的插入并未影響PCV2重組病毒的繁殖，Cap蛋白C-端能夠插入最少27個氨基酸，同時不影響VLPs的結(jié)構(gòu)。Huang等[19]在PCV2a/CL株Cap蛋白C-端插入猴副流感病毒V5表位基因的重組PCV2，此重組病毒能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗Cap和V5標(biāo)簽的抗體。PCV2 Cap蛋白N-端的精氨酸殘基可能參與綁定病毒的DNA[20]，位于病毒粒子的內(nèi)部，C-端位于病毒粒子的表面[21-23]。已有文獻報道，在Cap蛋白C-端串聯(lián)表達其他外源基因后于桿狀系統(tǒng)中進行表達, 純化后的目的蛋白能夠有效地與PCV2單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，并且可以在體外自組裝形成均一的直徑約17 nm的病毒樣顆粒[24]；Li等[25]將Cap蛋白C-端4個氨基酸殘基替換成豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的抗原表位基因，利用原核表達系統(tǒng)進行Cap蛋白的表達，成功地檢測到了VLPs。

本課題組在前期研究中，對VLPs組裝工藝進行了優(yōu)化，并發(fā)現(xiàn)經(jīng)優(yōu)化工藝組裝的PCV2 Cap VLPs顆粒具有熱穩(wěn)定性[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，在60 ℃條件下處理30 min以上,Cap蛋白依然保持穩(wěn)定；在此基礎(chǔ)上以PCV2 Cap VLPs顆粒作為載體，在Cap蛋白的C-端嵌合PRRSV T細胞抗原表位，成功實現(xiàn)了Cap嵌合蛋白的大量可溶性表達，并觀察到了VLPs顆粒，但C-端嵌合PRRSV T細胞抗原表位的VLPs顆粒的熱穩(wěn)定性大幅下降，其中插入7個氨基酸(T1/T2/T3)時完全檢測不到瓊脂糖擴散效價，插入11及19個氨基酸(T4/T5)時，雖然能夠檢測到蛋白和瓊脂糖擴散效價，但均大幅降低，可能的原因是C-端嵌合外源基因?qū)е耉LPs的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，T細胞表位呈疏水性，Cap蛋白的C-端暴露在外，為親水性，C-端的親水性一旦被疏水性的T細胞表位破壞，就有可能導(dǎo)致VLPs的組裝及穩(wěn)定性出現(xiàn)問題。由于Cap C-端嵌合PRRSV T細胞抗原表位會導(dǎo)致其生成的VLPs顆粒的穩(wěn)定性發(fā)生改變，故本試驗僅對Cap蛋白的免疫效果進行了驗證，并對佐劑進行了初步篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，原核系統(tǒng)表達PCV2 Cap蛋白形成的VLPs能夠誘導(dǎo)較好的特異性抗體，其中以VLPs+佐劑S350的效果最好。

以原核表達系統(tǒng)表達的PCV2 Cap形成的 VLPs顆粒疫苗，成本是桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的PCV2 Cap形成的VLPs疫苗的1/5左右，且疫苗生產(chǎn)周期縮短了3/4，工藝更為簡單。該結(jié)果證明了利用原核表達系統(tǒng)進行PCV2 VLPs疫苗開發(fā)的可行性，同時進一步證明了Cap蛋白羧基端在維持VLPs顆粒穩(wěn)定性，特別是熱穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用，為后期進一步改進VLPs顆粒、生產(chǎn)高質(zhì)量且穩(wěn)定的PCV2 VLPs疫苗奠定了基礎(chǔ)。