朱偉峰 陳 露 譚 凱 王高杰 蔡承志

1.江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所，南京 210014；2.農業(yè)農村部獸用生物制品工程技術重點實驗室，南京 210014；3.國家獸用生物制品工程技術研究中心，南京 210014；4.華中農業(yè)大學動物醫(yī)學院，武漢 430070

巴氏桿菌?。╬asteurellosis）主要由多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）引起，是多種畜禽、野生動物和人類的一種傳染病的總稱。巴氏桿菌病呈地方流行性，會造成動物死亡或影響其生長、降低飼料報酬，給畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來較大經(jīng)濟損失[1-2]。巴氏桿菌病因發(fā)病程度和感染動物不同而有不同的病名，如豬肺疫、豬進行性萎縮性鼻炎、禽霍亂、牛出血性敗血癥、兔巴氏桿菌?。ㄍ贸鲅詳⊙Y）等，其中多數(shù)疫病被中國政府列為二類動物疫病[3]。近年來，巴氏桿菌在多種動物中的臨床分離或檢出率都位居前列[4-7]。多殺性巴氏桿菌同樣可以造成人類感染發(fā)病，是一種人獸共患病病原體[1-2]。

根據(jù)莢膜多糖抗原性的差異可以將巴氏桿菌分為A、B、D、E、F等5個血清型，除E型外其他4個血清型均為臨床常見血清型[8]。目前對巴氏桿菌的免疫保護機制和致病機制依然不完全清楚[2-9]，我們前期主要針對巴氏桿菌的甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）致病作用和免疫保護作用開展了研究，研究結果顯示巴氏桿菌的GAPDH 分子具有黏附宿主細胞和分子的作用[10]，同時作為抗原巴氏桿菌GAPDH 還具有免疫保護效應[11]?？乖砦皇强乖l(fā)免疫保護的物質基礎[12-13]，部分抗原表位既是抗體發(fā)揮作用的位點，也是病原菌對宿主發(fā)揮作用的關鍵位點（即致病性表位）[14]。因而通過鑒定巴氏桿菌GAPDH 的B 細胞表位有助于進一步理解GAPDH 免疫保護效應的本質，并為進一步研究GAPDH 的致病作用提供條件。伴隨生物信息學的發(fā)展，不斷有學者試圖開發(fā)能夠預測抗原表位的軟件，近年來在線軟件Bepipred-2.0 對于線性B 細胞表位已經(jīng)有了比較好的預測效果[15]。本研究的目的是預測巴氏桿菌GAPDH 分子的線性B 細胞表位并進一步鑒定預測結果。

1 材料與方法

1.1 基因序列來源

本研究用于序列分析巴氏桿菌GAPDH 氨基酸序列均來自已經(jīng)完成基因組測序的巴氏桿菌的基因組數(shù)據(jù)：C51-17（A 型，NZ_MAPQ01000003.1）、PMTB2.1（B 型，NZ_CP007205）、HN06（D 型，NC_017027）、Pm70（F 型，NC_002663）。所有序列從自美國國立生物技術信息中心數(shù)據(jù)庫NCBI-GenBank公共數(shù)據(jù)庫中獲得。

1.2 生物材料及主要試劑

鼠源巴氏桿菌GAPDH 高免血清在以前的試驗[10]中已經(jīng)制備并保存。ELISA 板購自美國Costar公司，HRP 鼠二抗購自Biosharp 公司，TMB 單組分顯色液購自湖州英創(chuàng)生物科技有限公司。

1.3 不同菌株GAPDH一級結構的比較

使用在線軟件Clustal Omega（http://www.clustal.org/omega/）完成氨基酸序列多序列比對，比較1.1中不同巴氏桿菌GAPDH氨基酸序之間的相似性。

1.4 巴氏桿菌GAPDH表位預測

使用在線軟件Bepipred-2.0（http://www.detaibio.com/tools/epitope-prediction-vr.html）分析巴氏桿菌GAPDH 分子上各個氨基酸殘基構成表位的能力。以軟件默認的0.5 為閾值，高于此閾值且有較長連續(xù)序列的一段多肽被預測為GAPDH 分子的線性B細胞表位。

1.5 表位多肽的化學合成

針對Bepipred-2.0 所預測到的線性B 細胞表位，通過南京金斯瑞生物科技股份有限公司化學合成對應序列的線性多肽。合成過程簡述如下，使用固相肽合成法（SPPS）合成多肽，即依次向樹脂中添加氨基酸以構建肽鏈。當合成完成后，首先去保護N-端的Fmoc 基團，然后去保護側鏈保護基團，最后將多肽從樹脂上切割下來。粗肽液樣品溶解后，注入高效液相色譜（HPLC）儀，對色譜中出現(xiàn)的每個部分進行分子量和純度測試，以確認目標多肽含量。如果預測到的抗原表位長度均超過25 個氨基酸殘基，常規(guī)合成難度較大，則合成能夠覆蓋對應表位的重疊多肽以完成后續(xù)試驗。

1.6 表位與GAPDH高免血清的反應

使用間接ELISA法[16]鑒定多肽與血清的反應性，簡要敘述如下。以多肽包被ELISA 板（10 μg/孔，對照組不包被任何抗原），37 ℃孵育2 h。以PBST洗滌5 次后，使用5%脫脂乳于37 ℃下封閉1 h。接下來孵育1/200 稀釋的巴氏桿菌C51-17 株GAPDH 高免血清，37 ℃下1 h。以PBST 洗滌5 遍后，孵育偶聯(lián)HRP的羊抗鼠二抗，37 ℃下孵育30 min。經(jīng)過5遍洗滌后加入100 μL的TMB單組分顯色液，反應10 min后加入50 μL 終止液（2 mol/L 硫酸）。最后在酶標儀上讀取450 nm的吸光度。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學檢驗

試驗數(shù)據(jù)均使用平均值（means）±標準差（SD）來表示，用t檢驗檢測試驗組和對照組的統(tǒng)計學差異，差異顯著判定標準為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 不同菌株GAPDH氨基酸序列的相似性

通過多序列比較發(fā)現(xiàn)巴氏桿菌不同血清型菌株C51-17、PMTB2.1、HN06、Pm70的GAPDH氨基酸序列高度保守，僅HN06 發(fā)生了A288T 一處點突變（未展示多序列比對結果）。

2.2 GAPDH線性B細胞表位預測結果

選擇巴氏桿菌C51-17 株的GAPDH 序列進行預測分析，所預測的巴氏桿菌GAPDH 線性B 細胞表位的分布狀況如圖1所示。有多段連續(xù)序列高于軟件默認的閾值0.5，本研究選擇了最長的3個片段（分別記為PMepitope1、PMepitope2、PMepitope3，表1、圖2）作為預測到的線性B 細胞表位進行后續(xù)研究。

圖1 巴氏桿菌GAPDH各氨基酸殘基構成表位能力及線性B細胞表位預測結果

圖2 所預測到的表位在巴氏桿菌GAPDH分子上的位置

2.3 表位對應多肽與GAPDH高免血清的反應

以人工化學合成方式制備所預測表位PMepitope1、PMepitope2、PMepitope3 對應的多肽（分別標記為PMG-1、PMG-2（A-D）、PMG-3）（表1）。由于PMG-2C 結構特殊，經(jīng)過反復和嘗試都沒有成功合成，所以本次試驗沒有使用該條多肽。

表1 巴氏桿菌和GAPDH線性B細胞表位預測結果及對應多肽合成情況

巴氏桿菌GAPDH 的抗原表位PMepitope2 對應的合成多肽PMG-2（A、B、D）均能夠與巴氏桿菌GAPDH 高免血清發(fā)生明顯的反應（P＜0.05），但是PMepitope1和PMepitope3對應的合成多肽（PMG-1、PMG-3）則不能與巴氏桿菌GAPDH 高免血清發(fā)生反應（P＞0.05）。該結果證實所預測到的PMepitope2是巴氏桿菌GAPDH 的抗原表位，但PMepitope1 和PMepitope3則不是巴氏桿菌GAPDH的抗原表位。

3 討 論

BepiPred-2.0 是通過隨機森林算法學習來自于抗體-抗原復合物結構的表位數(shù)據(jù)進而建立起的一種表位預測工具，它對于線性B 細胞表位的預測能力尤為突出[15]。所以本研究選擇了該軟件預測巴氏桿菌GAPDH 的表位。依照軟件使用方法，預測分值高于0.5 且長度較長的多肽構成表位的可能性較大，所以本研究選擇了長度最長的3 段片段來作為預測到的表位進行研究。通過合成多肽與GAPDH高免血清的反應進一步確認了其中1個是表位。研究結果證實BepiPred-2.0 具有較好的表位預測能力，特別是當所預測表位較長時效果良好。

通過ELISA 驗證，本研究最終確認PMepitope2分別是巴氏桿菌GAPDH和巴氏桿菌GAPDH的線性B 細胞表位。該表位的序列及其在GAPDH 分子上的位置與之前研究所鑒定到的GAPDH表位[17-18]都不同，是新的表位。之前的文獻報道顯示GAPDH表位在抗原提呈、調理吞噬等方面發(fā)揮作用，本研究所鑒定到的表位可能也具有類似的免疫學效應，以后應進一步研究，并在疫苗設計中加以利用。

圖3 間接ELISA法檢測多肽與高免血清之間反應的結果

我們的研究結果顯示GAPDH具有高度保守的特點。巴氏桿菌不同血清型菌株的GAPDH一級結構高度相似，僅有1個點突變，本研究所鑒定到的表位所在位點序列完全相同。最近已經(jīng)有研究顯示細菌保守蛋白的表位可以用于建立特異性的診斷方法[16]，因而將來還可以以本研究所鑒定到的表位（PMepitope2）為基礎建立巴氏桿菌感染的特異性診斷方法。我們的前期工作表明，GAPDH是巴氏桿菌的黏附因子，某些氨基酸位點可能發(fā)揮關鍵作用[19]。其他學者的研究則表明有的抗原表位同時也是病原和宿主相互作用的關鍵位點[20-22]，因而本研究所鑒定到的表位可為研究巴氏桿菌與宿主相互作用提供新的線索。

本研究成功預測并鑒定到1個巴氏桿菌的抗原表位，該表位將為以后的巴氏桿菌GAPDH免疫保護機制、致病機制研究提供新的線索，并為基于GAPDH抗原表位的疫苗設計和診斷試劑開發(fā)提供技術基礎。